Se estudió la obtención de brotes mediante la organogénesis directa a partir de Saintpaulia ionantha, utilizando explantes de hoja, cultivados en medio Murashige y Skoog, suplementado con AIA y KIN. El ensayo fue realizado en dos ocasiones debido a la presencia de un hongo endógeno en planta usada en el primer ensayo, lo cual condujo a una contaminación total de los explantes sembrados, por tal motivo el segundo ensayo registra el uso de Bagsin-Captan, fungicidas sistémico y de contacto respectivamente, para prevenir la invasión fúngica.

1. Obtención de plantas haploides mediante el cultivo in vitro
de anteras y granos de polen de cucarda (Hibiscus
rosasinensis).
Ayala Paola, Chasiquiza Alexandra
Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolquí - Ecuador.
Noviembre, 2013
RESUMEN
El cultivo de anteras meristemoses utilizado generalmente para la obtención de plantas
haploides, las cuales se regeneran mediante embriogénesis somática o por organogénesis
a partir de callo. La flor de cucarda (Hibiscus rosa sinensis), presenta numerosos
estambres. Se usó como medio de cultivo MS, enriquecido con 0,8mg/L de tiamina, 0,2mg/L
de KIN, 2mg/L de AIA, 20m/L de azúcar y 7,5g/L de agar con pH ajustado a 5,7-5,8. Los
resultados fueron exitosos,no existió contaminaciónni explantes necrosados.
Palabras clave:Propagación, polen, microesporas, óvulos y cultivo in vitro.
ABSTRACT
Anthers meristem culture is generally used to obtain haploid plants which are regenerated
via somatic embryogenesis or organogenesis from callus. Cockade flower (Hibiscus rosasinensis), has numerous stamens. Was used as a MS medium, enriched with 0.8 mg / L
thiamine, 0.2 mg / l KIN, 2mg / L IAA, 20m / L of sugar and 7.5 g / L of agar, pH adjusted to 5
,7-5, 8. The results were successful; there was no contamination or necrotic explants.
Key words:
Propagation, pollen, microspores, ovules and in vitro culture.
INTRODUCCIÓN
Hibiscua rosa sinensis es una planta
ornamental
común
con
muchas
variedades.
Arbustos
generalmente
menores de 8 pies de altura en el cultivo,
pero pueden ser de 15piesen las zonas
tropicales. Hojas de forma ovoides y color
verde brillante. Flores en ejes superiores
de las hojas, solitarias, con pétalos de 2-5
pulgadas de largo y de color rojo brillante,
o, a veces rosa, púrpura, naranja, amarillo
o blanco. Los cultivares pueden ser
individuales, dobles y de color rojo,
amarillo, blanco o naranja. El fruto es una
cápsula de 5 células cada una con 3
semillas. Crece principalmente en las
zonas
tropicales
y
se
cultivaba
originalmente en Asia(Dvorkin PharmD &
Whelan MS, 2012)
El cultivo de tejidos vegetales, permite la
obtención de altas tasas de multiplicación
a partir de un explante inicial, gracias a la
totipotencia de las células vegetales. El
explante puede ser tomado de, tallo, raíz,
hoja, meristemos, embriones, etc.; o de
tejidos no somáticos como: anteras,

2. polen,
microesporas,
etc.(Narváes, 2009).
óvulos,
El cultivo in vitro de anteras con polen
inmaduro, permite que el polen se divida
para formar embriones o callo. Por lo
general el cultivo de anteras se utiliza
para la obtención de plantas haploides,
las cuales se regeneran a través de la
embriogénesis somática a partir del polen,
directamente
o
por
la
vía
de
organogénesis a partir de un callo
(Abdelnour A., 1994).
El objetivo de esta práctica es evaluar la
viabilidad y obtener formación de callo a
partir de anteras de cucarda (Hibiscus
rosa sinensis).
MATERIALES Y METODOS
Se recolectóplantas de cucarda y se
realizó lavados con agua corriente para
remover impurezas yse preparó 500ml de
una solución de detergente al 2% más
tres gotas de tween20, se sumergió las
flores de cucarda en la solución
poniéndolas
en
agitación
durante
20minutos. Posterior a este tiempo se
lavó los explantes, 2 veces con agua
destilada y una vez con agua estéril. Se
eliminó el agua y se prosiguió a sumergir
las muestras en 500ml de una solución de
cloro al 2% más 3 gotas de Tween
durante 10 minutos en agitación.
Terminado del lavado con cloro, se
trasladó los explantes a la cámara de
siembra previamente esterilizada de
acuerdo a procedimiento descrito en
prácticas anteriores y se realizó 2 lavados
con agua estéril.
Finalizado los lavados, se realizó cortes a
las capsulas de cucarda desde su base
de tal manera que los filamentos de las
anteras quedaron libres. Se colocó las
anteras en un frasco de medio de cultivo.
Se utilizó medio remanente de la práctica
de
violeta,
MS
enriquecido
con
enriquecido con 0,8mg/L de tiamina,
0,2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20m/L de
azúcar y 7,5g/L de agar con pH ajustado a
5,7-5,8. Se incubó a temperatura
ambiente y después de 7 días de la
siembra se evaluó, presencia de callo y
contaminación por hongos o bacterias. Se
establecieron 3
escalas para la
evaluación de los resultados como se
indica en la Tabla 1,2.
Tabla 1.- Leyenda de valores de contaminación.
Contaminación por hongo y bacteria
0
No existe contaminación
1
Poca contaminación
2
Contaminación masiva
Tabla 2.-Leyenda de valores de necrosis.
Necrosis
No necrosis
Necrosis media
Necrosis alta
0
1
2
RESULTADOS
Como se observó en las Fotografía 1 y 2
no existe contaminación en ninguno de
los frascos:
1P
2P
Fotografía 1.- Frascos con polen de cucarda de Paola Ayala.
1A
1B
Fotografía 2.- Frascos con polen de cucarda de Alexandra Ch.

3. Para evaluar el desarrollo de anteras en
cultivo in vitro se tomaron los siguientes
parámetros: porcentaje de contaminación,
viabilidad, oxidación, necrosis y formación
de callo.
Frasco
Contaminación (%)
1P
2P
1A
2A
0
0
0
0
Tabla 3.-
Porcentaje de contaminación entre los
diferentes explantes de cucarda.
Frasco
Oxidación (%)
1P
2P
1A
2A
0
0
0
0
Tabla 4
Porcentaje de Oxidación entre los diferentes
explantes de polen de cucarda.
DISCUSIÓN
La obtención de brotes a partir de polen y
anteras, es viable gracias al bajo nivel de
contaminación y la respuesta de los
explantes y la baja contaminación se
debió al buen proceso de desinfección y
al cuidado que se tuvo en el momento de
la siembra.
Debido a las limitaciones de esta técnica
se puede considerar su uso solo en
determinados cultivos en los cuales se
dependen del genotipo de la planta, es
decir solo ciertas plantas van a estar
predeterminadas
a
generar
líneas
homocigotas como el arroz, la cebada, el
trigo, papa y maíz entre otras (Lentini et
al, 1997).
Los resultados posibles que se pueden
obtener del cultivo in vitro de anteras, es
la formación de callo u organogénesis, en
la primera las microesporas que se
encuentran
dentro de las anteras
inmaduras inducen la formación de callo,
mientras en la segunda se generan
embriones (Núñez, V, 1984).
Los mejores resultados al obtener callo se
obtienen con anteras completas, para
generar una abertura por la cual los
granos de polen tengan un contacto más
directo con el medio enriquecido (Lentini
et al, 1997).
Se debe controlar de mejor manera la
etapa fisiológica de la planta para generar
androgénesis ayudara a tener mejores
resultados en la obtención de callos y
regeneración de pantas. En estudios
realizados sobre Solanum lycpersicon, se
encontró que la mayor producción de callo
ocurre cuando el meiocito está entre
metafase I y telofase II (Roca et al ,1993).
CONCLUSIONES:
Posterior a la primera semana de los
explantes no presentaron oxidación o
necrosis, lo que nos indica buena
adaptación al medio.
La técnica fue exitosa debido a la
ausencia de necrosis o contaminación,
pero esta técnica es limitada y se la
puede considerar eficiente solo
en
determinados
cultivos
que
son
económicamente importantes.
En este estudio se evaluó la viabilidad de
las anteras y el desarrollo de callo en
anteras de cucarda, con resultados
satisfactorios en la viabilidad de anteras,
existió por lo menos un crecimiento
mínimo de cada uno de los explantes,
pero no se generó callo, nuestra
respuesta en la mayoría de explantes solo
fue el desarrollo de la antera.

4. BIBLIOGRAFÍA
Abdelnour A., E. J. (1994). Conceptos básicos
del Cultivo de Tejidos Vegetales.
UCA-CATIE.
RECOMENDACIONES
Se necesita mejorar el tiempo de
respuesta, mediante condiciones de
cultivo (luz, temperatura, humedad) o
cambiando
concentraciones
de
fitorreguladores en el medio.
El desarrollo que tengan las anteras es
fundamental para un crecimiento rápido
de los brotes, por lo que es necesario
buscar botones florales a punto de
abrirse, para asegurar el estado de
madurez de los explantes.
El cultivo meristemos es una técnica útil
en la obtención de plantas libres de
contaminantes, y que además, permite el
desarrollo directo de brote, sin formación
de callo u organogénesis asegurando que
la inestabilidad genética y la variación
somaclonal se reducen al mínimo.
Dublin, P. (1987). Multiplication végétative, "in
vitro" de l. Arabusta. Café Cacao;
Techniques de reproduction
végétative "in vitro" et amélioration
génetique chez les caféirs cultivés.;
Techniques de reproduction
végétative "in vitro" et amélioration
génétique chez les ca. Paris: IFCC.
Dvorkin PharmD, L., & Whelan MS, J. (2012).
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Medicine. Recuperado el 2013, de
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http://www.bu.edu/bhlp/Clinical/crosscultural/herbal_index/herbs/Hibiscus%
20Rosa%20Sinensis.html
López, C., & Cazola, J. (2006). Saneamiento
del material vegetal: Cultivo de
Meristemos. Recuperado el 2 de 11
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Narváes, S. (2009). Regeneración de brotes a
partir de hojas provenientes de
plantas in vitro de rosa, variedad akito.
Sangolquí, Ecuador: Tesis de Grado.
Rafael, M. (1987). Regeneración "in vitro" de
explantes caulinares del cafeto
(Cofiea arabica cv. 'Catimor').
Caracas, Venezuela: Escuela de
Biología, Facultad de Ciencias,
Universidad Central de Venezuela.
Roca, W., & Beltrán, J. (1984). Cultivo de
Meristemos para la Conservación de
Germoplasma de yuca in vitro. Cali,
Colombia: CIAT.

5. CUESTIONARIO
Calcular la proporción de los granos de polen en cada antera que se desarrolló en las
plántulas.
La cantidad y viabilidad de granos de polen se pueden conocer por la metodología de
hematocitómetro. La técnica consiste en la observación de los granos de polen bajo el
esteromicroscopio, coloreando los granos viables con azul de anilina en lactofenol al 1%
que es llevado a la cámara de hematocitómetro con una pipeta de Pasteur y se calcula
según la siguiente fórmula.
¿Cómo puede usted determinar si las plantas son haploides o diploides?
En las plantas, las dos fases nucleares reciben nombres diferentes: las formas haploides,
desarrolladas a partir de los gametos, se denominan gametofitos, mientras que las formas
diploides se denominan esporofitos.
Las plantas haploides contienen la mitad del material genético necesario, para poder dar
origen a una nueva planta, es decir este será incapaz de reproducirse, convirtiéndose en un
híbrido. Por lo cual se las puede identificar, al no ser viables reproductivamente se las
considera plantas haploides.