El suelo es considerado un espacio heterogéneo definido por sus propiedades físicas, químicas y biológicas, que bajo condiciones naturales tiende a desarrollar un equilibrio dinámico entre sus diferentes atributos, lo que genera las condiciones adecuadas para una diversidad de organismos simbióticos, transformadores y descomponedores de sustratos. En el presente estudio se aislaron hongos y bacterias procedentes de la rizósfera de plantas de Café (Coffea arabica L.) con y sin inoculación microbiana. Se usaron diversos medios de cultivo según la metodología de Reyes y Valery (2007). Los resultados se expresaron en ufc.g-1 de suelo. Se determinaron densidades poblacionales muy bajas al comparar las rizósfera de plantas sin inoculación y con inoculación microbiana.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA
VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL
Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES DEL SUELO
RIZOSFÉRICO DE PLANTAS DE CAFÉ (Coffea arabica L.)
Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Biofertilizantes. UNET.
RESUMEN
El suelo es considerado un espacio heterogéneo definido por sus propiedades físicas,
químicas y biológicas, que bajo condiciones naturales tiende a desarrollar un equilibrio
dinámico entre sus diferentes atributos, lo que genera las condiciones adecuadas para una
diversidad de organismos simbióticos, transformadores y descomponedores de sustratos. En
el presente estudio se aislaron hongos y bacterias procedentes de la rizósfera de plantas de
Café (Coffea arabica L.) con y sin inoculación microbiana. Se usaron diversos medios de
cultivo según la metodología de Reyes y Valery (2007). Los resultados se expresaron en
ufc.g-1
de suelo. Se determinaron densidades poblacionales muy bajas al comparar las
rizósfera de plantas sin inoculación y con inoculación microbiana.
Palabras clave: Rizósfera, microorganismos, inoculo, suelo, fertilidad.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son los seres vivos
más numerosos que existen en la tierra;
son organismos ancestrales que han
colonizado exitosamente cada nicho
ecológico posible, se encuentran
prácticamente en todas las regiones del
planeta, desde los polos, en ambientes bajo
el punto de congelación y muy secos, hasta
los trópicos con temperaturas altas y con
elevada precipitación pluvial. Su presencia
y actividad es esencial para la salud y
funcionamiento adecuado de todos los
ecosistemas (Olembo, 1991).
El suelo constituye el producto de factores
geológicos, topográficos, climáticos,
físicos, químicos y biológicos que han
actuado sobre la roca madre y sedimentos
geológicos que, en asociación con
partículas inorgánicas o minerales,
entrelazadas con materia orgánica y gases
de difusión, forman una entidad viviente.
Cuando el suelo es humedecido, este

2. complejo sistema se transforma en un
sustrato fértil, donde brota la vida en el
planeta (de Felipe, 2004). En general, se
considera que la microbiota del suelo,
conformada principalmente por bacterias y
hongos, juega un papel importante en la
fertilidad, reciclaje de nutrientes,
evolución, estructura y conservación del
mismo (Reyes y Valery, 2007).
En este contexto, los microorganismos que
crecen en la rizósfera de las plantas,
constituyen la biomasa mayor de nuestro
planeta. Las bacterias son, sin duda alguna,
el grupo de organismos metabólicamente
más significativos de los organismos del
suelo. En cuanto a los hongos, son los
organismos más dominantes por los
múltiples procesos que realizan y por su
gran biomasa (de Felipe, 2004).
El efecto benéfico de los microorganismos
en la rizósfera establece y acelera procesos
bioquímicos que influyen sobre el
crecimiento y desarrollo de las plantas, lo
que está asociado con un incremento de
elementos químicos disponibles y la
producción de sustancias de crecimiento o
de control de patógenos. De allí que la
diversidad y densidad de microorganismos
sean indicadores de interés en el estudio de
la calidad y sostenibilidad de los
ambientes terrestres (Reyes y Valery,
2007).
Al respecto, el objetivo de la presente
actividad de laboratorio es el aislamiento
de microorganismos cultivables del suelo
rizosférico de plantas de café (Coffea
arabica L.).
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras de Suelo Rizosférico
El material del suelo rizosférico se obtuvo
de dos plantas de café (Coffea arabica L.)
dispuestas en el Laboratorio de
Biofertilizantes, propagadas en el vivero
de la Unidad Académica La Tuquerena,
Rubio, Edo. Táchira. Una de las plantas
carece de aplicación de inoculante
bacteriano (SIM) y la segunda planta
presenta inoculación al momento de la
siembra con Penicilluin rugulosum (cepa
IR, disolvente de fosfato) y Trichoderma
sp. (cepa VP) (COM).
Análisis de Suelos
El análisis con fines de fertilidad del suelo
usado en el vivero de la Unidad
Académica La Tuquerena se realizó en el
Laboratorio Bioambiental UNET
(11/04/2012), verificando Textura
(método Bouyucos), Materia Orgánica
(Wakley y Black), Fósforo (Bray I, lectura
colorimétrica azul de molibdeno
Spectronic 20), Calcio, Magnesio y
Potasio (Acetato de Amonio),
Conductividad Eléctrica (Conductímetro),
y el pH (pHmetro).

3. Muestreo de Microorganismos
Cultivables del Suelo
Para el ensayo de laboratorio se
seleccionaron dos (2) plantas de café de
seis meses de edad. Una planta
identificada como SIM (sin aplicación de
inoculante microbiano) y otra identificada
como CIM (con aplicación de inoculante
microbiano). Se sacaron las plantas del
suelo, sacudiendo suavemente con el
objeto de eliminar la tierra en exceso,
quedando presente solo el suelo rizosférico
(Fig. 1).
Fig. 1. Plántula de café (Coffea arabica L.) con
suelo rizosférico.
Las raíces son colocadas en un matraz con
20 ml de solución isotónica estéril de
cloruro de sodio al 0,89%, más una gota de
tween 80. Manteniendo en agitación
constate por una hora para desprender
totalmente el suelo rizosférico de las
raíces.
De la disolución obtenida, se realizaron
diluciones seriadas hasta 10-5
, que serían
usadas para la siembra por extensión en
placas de Petri, previamente preparadas
con los siguientes medios de cultivos
microbiológicos solidos: Papa-dextrosa-
agar (PDA) y Medio Mínimo con
Hidroxiapatita (HA), ambos con sulfato de
estreptomicina (100µg.ml-1
) para
determinar hongos totales
(concentraciones 10-2
y 10-3
); Agar
Nutritivo, Medio Mínimo con
Hidroxiapatita (HA), y medios de cultivo
específicos, como Medio Azotobacter
(AZ) (Garasini 1967) y Medio
Azospirilum (AZP) (Rodríguez 1982),
para determinar bacterias totales
(concentraciones 10-4
y 10-5
). Se realizaron
tres repeticiones por cada dilución y para
cada una de las muestras, siguiendo las
normas de asepsia requeridas en cámara de
flujo laminar (Fig. 2).
Fig. 2. Proceso de siembra en cámara de flujo
laminar.

4. Las placas con medios de cultivo, fueron
ubicadas inicialmente al medio ambiente y
luego de 48 h en incubadora, realizando el
conteo de colinas individuales a las 48, 72,
92, 120 y 172 horas posteriores a la
siembra de microorganismos en cada placa
de Petri.
Los resultados expresan la presencia de
microorganismos, bacterias y hongos,
presentes en el suelo rizosférico de las
plántulas de café, expresados en UFC.g-1
de suelo seco, considerando el contenido
de humedad del suelo.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Análisis de Suelo
De los resultados del análisis físico-
químico realizado a las muestras de suelo
empleadas para la siembra en umbráculo
de las semillas de Café (Coffea arabica
L.), provenientes del vivero de la Unidad
Académica La Tuquerena, y utilizada para
el ensayo del muestreo de
microorganismos cultivables del suelo,
podemos señalar que presenta una textura
gruesa (Franco arenosa: 14% Arcilla, 33%
Limo), niveles bajos de P (3 ppm), Ca (132
ppm), Mg (38 ppm), nivel medio de K (71
ppm), pH ácido (4,04), C.E. baja (0,24
mmho/cm), y buena relación Ca/Mg (2,1
Eq/Eq). Suelo característico de la región
andina, que requiere corrección de pH y
aplicación de fertilizantes para suplir los
requerimientos nutricionales del cultivo.
Conteo de Microorganismos
Cultivables del Suelo
Las observaciones fueron realizadas cada
24 horas, anotando la presencia de nuevas
colonias durante cada observación. Los
resultados han sido expresados en ufc-g-1
,
determinando el promedio aritmético y
desviación estándar por concentración y
por cada medio de cultivo usado en el
crecimiento de microorganismos
cultivables.
En el caso de la muestra de suelo
rizosférico no inoculado (SIM) (Cuadro
Nº 1), el desarrollo de ufc.g-1
fue muy bajo,
reportando valores nulos para los medios
de cultivo Hidroxiapatica + Antibiótico
para bacterias totales, e Hidroxiapatita
para hongos, en ambas concentraciones.
Cuadro Nº 1. (Grupo 1º) Crecimiento de
microorganismos cultivables del suelo
rizosférico. Plantas de café sin inoculante
microbiano (SIM).

5. El medio PDA+AB 10-2
 reporta = 7,21
ufc.g-1
± 12,48 para el crecimiento de
hongos. En el caso de crecimiento de
bacterias totales, el medio Agar Nutritivo
10-4
 reporta = 7,21 ufc.g-1
± 12,48. Para
los medios específicos Azospirillium se
reportan = 14,42 ufc.g-1
± 24,97 y =
14,42 ufc.g-1
± 24,97 respectivamente para
las concentraciones 10-4
 y 10-5
, en
Azotobacter para la concentración 10-4
se
presentó una tendencia de crecimiento =
28,83 ufc.g-1
± 33,03.
Como se puede valorar por los resultados,
se advierte una creciente inhibición del
desarrollo de los microrganismos
cultivables del suelo rizosférico en la
muestra de suelo no inoculado. El
desarrollo adecuado de los
microorganismos en el medio de cultivo se
ve afectado por una serie de factores de
gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio,
como la disponibilidad adecuada de
nutrientes, la consistencia del medio, la
presencia o ausencia de oxígeno,
condiciones de humedad adecuada, luz
ambienta, pH del medio, temperatura y
esterilidad del medio (Tortora et al., 2007).
Así mismo, la técnica y destreza al
momento de realizar la siembra en la
capsula pueden haber influido en el escaso
desarrollo de ufc en los medios.
Los resultados del ensayo correspondiente
a las plántulas con inoculación microbiana
(CIM) se muestran en el Cuadro Nº 2,
siendo evidente la presencia de ufg.g-1
en
la mayoría de las concentraciones y
medios de cultivo evaluados.
Cuadro 2. Grupo 2º. Crecimiento de
microorganismos cultivables del suelo
rizosférico. Plantas de café con inoculante
microbiano (CIM).
Se encontraron mayores densidades de
bacterias y hongos cultivables totales en la
muestra de la rizósfera de café (Coffea
arabica L) con inoculación microbiana,
siendo significativa la presencia de
colonias de bacterias disolventes de
fosfato (caracterizada por la presencia de
un halo hialino alrededor de la colonia), en
el medio de cultivo Hidroxiapatita +
Antibiótico. El desarrollo efectivo de
diversas asociaciones microbianas en un
suelo está relacionado sus condiciones
físicas, químicas y biológicas (Reyes y
Valery, 2007).
Para crecimiento de hongos, PDA+AB
10-2
 ( = 3,23 ufc.g-1
± 3.7) y 10-3
 ( =

6. 0,81 ufc.g-1
± 1,40); HA + AB 10-2
 ( =
4,84 ufc.g-1
± 4,84) y 10-3
 ( = 1,61 ufc.g-
1
± 2,80). Para el crecimiento de bacterias
totales, Agar Nutritivo reporta 10-4
 ( =
22,60 ufc.g-1
± 3.70) y 10-5
 ( = 4,84
ufc.g-1
± 4,19); Hidroxiapatita 10-4
 ( =
6,46 ufc.g-1
± 2,80); Azospirillium 10-4

( = 18,57 ufc.g-1
± 5,04) y 10-5
 ( = 1,61
ufc.g-1
± 1,40); y Azotobacter 10-4
 ( =
11,30 ufc.g-1
± 5,04) y 10-5
 ( = 2,42
ufc.g-1
± 4,19) (Fig. Nº 3)
Fig. Nº 3. Medios de cultivo de los diferentes
tratamientos.
La capacidad para colonizar las raíces es
una condición indispensable para que una
bacteria sea considerada como una
verdadera PGPR, siendo por tanto esa
capacidad un primer paso y un rasgo
crucial para la selección de los inóculos
microbianos a ser usados como
biofertilizantes, biopesticidas,
fitoestimuladores o biorremediadores
(Lugtenberg et al., 2001). Es también un
primer indicio de que el microorganismo
es capaz de lograr el efecto benéfico
esperado. Además de la capacidad de
colonización, el éxito en la utilización de
microorganismos promotores del
crecimiento vegetal reside en el estudio de
cepas compatibles y específicas a los
diversos cultivos y a las condiciones
ambientales prevalecientes (Peña y Reyes,
2007). El desarrollo de colonias en medios
específicos como el Azotobacter y el
Azospirrilium, bacterias que poseen un
complejo enzimático capaz de reducir el
nitrógeno del aire a amonio para ser
asimilado por las plantas, constituye un
efecto de la reacción de los exudados que
la planta transfiere a la rizósfera. La
producción de estas sustancias, al servir de
fuente energética y de biosíntesis a los
microorganismos adyacentes a la planta,
ejercerán una influencia positiva o
negativa sobre los mismos al inducir
cambios en el pH de la rizósfera,
disponibilidad de sustratos específicos, de
nutrientes y de factores de crecimiento
microbiano, lo que temporalmente va a
moldear la estructura de la comunidad
microbiana rizosférica de la planta (Reyes
y Valery, 2007).
La diferencia expresada en los
tratamientos SIM y CIM, radica en el
efecto inoculador aplicado a la muestra de
suelo del vivero de la Unidad Académica
La Tuquerena, Rubio, Edo. Táchira.
Asimismo, se requiere revisar la
metodología al momento de extraer la
muestra de rizósfera de la planta, ya que se
observan diferencias significativas entre la
muestra de suelo empleada para los
cálculos de la muestra SIN y CIM. Se
requieren análisis posteriores para
corroborar metodología y proceso, debido

7. a la variedad de cepas con capacidades
especificas detectadas en el presente
informe.
CONCLUSIONES
La inoculación microbiana en la muestra
de suelo proveniente del umbráculo de la
U.A. La Tuquerena, permitió un mejor
desarrollo de poblacionales microbianas
cultivables en la rizósfera de plantas de
Café (Coffea arabica L.).
Las condiciones del suelo sin inoculación
microbiana y el manejo agronómico, no
permitió la promoción de poblaciones
microbianas en el suelo, a pesar de los
exudados que pudiese generar la planta de
Café (Coffea arabica L.).
Se detectó la presencia de colonias
bacterianas capaces de disolver fosfato,
con capacidad de resistencia al antibiótico
estreptomicina.
La presencia de microorganismos
benéficos en la rizósfera promueve
diversos procesos bioquímicos que
establecen el desarrollo y crecimiento de
las plantas, permitiendo la disponibilidad
de elementos químicos, sustancias de
crecimiento y de control de patógenos.
Siendo de suma importancia la
biodiversidad microbiana como indicador
de suelos supresivos.
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