Se estudió la obtención de brotes libres de enfermedades mediante el cultivo de embriones inmaduros de limón en medio Murashige y Skoog. Se observó ausencia de contaminación en dos de los cuatro frascos, pero oxidación en los otros dos. El uso de embriones inmaduros permite obtener plantas viables libres de virus.

1. OBTENCIÓN DEBROTES A PARTIR DE EMBRIONES INMADUROS DE
LIMÓN (Citrus limonum) EN EL LABORATORIO DE CULTIVO IN VITRO DE
TEJIDOS VEGETALES.
Paola Ayala, Alexandra Chasiquiza
Cultivo de Tejidos. Ingeniería en Biotecnología. Universidad de las Fuerzas Armadas
ESPE.
Sangolquí-Ecuador
Diciembre 2013
RESUMEN
Se estudió la obtención de brotes libres de enfermedades mediante el cultivo de
embriones inmaduros de Citrus limonum, cultivado en medio Murashige y Skoog. El
uso de embriones inmaduros permite obtener plantas viables y estos no presentan virus
ni patógenos debido a que las semillas se encuentran aisladas dentro del fruto, se pudo
observar ausencia de contaminación pero oxidación en dos de los cuatro frascos.
Palabras Clave: embryos, in vitro culture, healthyplants.
ABSTRACT
Obtaining free outbreaks studied by culturing immature embryos of Citrus limonum,
grown in Murashige and Skoog medium. The use of immature embryos and allows to
obtain viable plants are unable to produce virus or pathogens because the seeds are
isolated within the fruit, we observed absence of contamination but oxidation in two of
the four flasks.
Keywords: meristems, viruses, healthy plants.
INTRODUCCIÓN
La propagación sexual de algunas
especies tiene limitantes como: una baja
producción de semillas porárbol en
condiciones naturales causada porla
pérdida de frutos durante el desarrollo y
ladificultad de conservar los genotipos
encondiciones silvestres, la semilla
tiene latencia natural, la cual produce
baja uniformidaden la germinación en
condiciones de vivero(Gómez & Toro,
2007).
La técnica de obtención de brotes a
partir de embriones sirve para evitar la
presencia de contaminantes endógenos
debido a que muchos cultivos vegetales
contienen virus sistémicos, los cuales
afectan su funcionamiento y abaten su
rendimiento, representando grandes
pérdidas
económicas
para
los
agricultores, por tanto es deseable la
producción de plantas libres de virus.
En muchas especies se puede lograr
plantas
sanas
sometiéndolas
a
tratamientos con calor o con la
aplicación de productos químicos, sin
embargo ciertos virus han resistido a
todas las pruebas de erradicación, lo
cual hace necesario el uso de otros
métodos(Pérez, 2009).
El objetivo de la práctica fue obtener
brotes, a partir de embriones extraídos
de frutos de limones, cultivados in vitro
en medio MS.

2. MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
Preparación de la sala de siembra: El
piso se desinfectó con kalipto, las
cámaras de siembra se limpiaron con
papel toalla estéril y Savlón. Los
materiales usados en la siembra tales
como: mecheros, pinzas bisturí, papel
toalla, plástico, ligas, botellas de agua,
etc.
fueron
introducidas
previa
esterilización, luego se prendió las
lámparas UV de las cabinas de flujo
durante 15min y en los siguientes 15
min se encendió el flujo de aire luego de
apagar las lámparas.
Después de una semana de la siembra,
se evaluó la contaminación por hongos
y bacterias, la oxidación y la
geminación de los explantes. Se
establecieron 3
escalas para la
evaluación de los resultados como se
indica en la tabla 1,2 y 3:
Material vegetal:Se utilizómuestras de
limón adquiridas en un mercado, se
manejó un limón por persona.
Contaminación por hongo y bacteria
0
No existe contaminación.
1
Poca contaminación.
2
Contaminación total.
Finalizado los lavados, se realizó cortes
profundos en el limón, para obtener las
semillas, sin dañarlas. Se colocó
aproximadamente 3 semillas por frasco
de medio de cultivo. El medio utilizado
fue el MS.
Tabla 1.- Escala de germinación.
Tabla 2.- Escala de contaminación por hongos y
bacterias
0
1
2
Oxidación
No oxidación
Oxidación media
Oxidación total
Tabla 3.- Contaminación por hongo y bacteria
1
No
No
2
No
No
3
No
Si
4
No
SI
Tabla 4.- Evaluación semanal de explantes de
brotes.
Siembra del material:Sé eliminó la
corteza, se extrajolas semillas y se las
colocó en el medio MS.
Figura 1y 2.- Frasco 1 con el explante en
desarrollo. Primera Semana.
Nº brotes
Oxidación
Como se puede observar en la tabla 4 y
en las figuras 1 y 2, dos de los explantes
sembrados dieron resultados positivos,
En el frasco 3 y 4 se observa oxidación.
Contaminación
(hongo o
bacteria)
Inmediatamente al término del lavado
con cloro, se trasladó los explantes a la
cámara de siembra y se realizó 3
lavados con agua estéril.
0
1
2
# frasco
Se realizó lavados con agua corriente
para remover impurezas y se preparó
1000 ml de una solución de detergente
al 2% más 6 gotas de Tween, se
sumergieron los limones en la solución
poniéndola en agitación durante 20
minutos. Posterior a este tiempo se lavó
los explantes, dos veces con agua
destilada y una vez con agua estéril. Se
eliminó el agua y se prosiguió a
sumergir las muestras en 1000 ml de
una solución de cloro al 5% más 6 gotas
de Tween durante 10 minutos en
agitación.
Germinación
No existe germinación
Germinación media
Germinación total
2
1
3
1

3. DISCUSIÓN
En este estudio se buscó evaluar el
porcentaje de germinación de las
semillas de limón (Citrus limon), en el
cual presentó un porcentaje bajo ya que
perduro la dormancia de las semillas.de
limón que se encuentra vivas pero en
estado de latencia(Campbell, 2005).
Referente a la contaminación, ninguna
de las semillas dentro de los frascos
tuvo presencia de hongos o de bacterias.
Otro factor que pudo influir en la
germinación de las semillas es la
temperatura de incubación porque existe
una
acumulación de metabolitos
secundarios en las semillas y por lo
tanto su crecimiento está directamente
asociados a la temperatura(Sinclair,
1984).
CONCLUSIONES
El método de desinfección fue agresivo
debido a que la mitad de las semillas
presento oxidación.
La obtención de brotes a partir de
embriones inmaduros, esposiblepor el
bajo nivel de contaminación, aunque la
respuesta de los brotes es lenta.
Las semillas se desarrollan de manera
lenta, pero sin cambios no previstos,
debido a la ausencia de hormonas en el
medio,
RECOMENDACIONES
Para mejorar el tiempo de germinación
se podría agregar fitoreguladores en el
medio.
Cuando se maneje las semillas hay que
cuidar de no maltratarlas, para que no se
afecte su capacidad regenerativa.
BIBLIOGRAFÍA
Gómez, M., & Toro, J. (2007). Boletín
Técnico de Biodiversidad: Manejo
de las semillas y propagación de
especies forestales. medellín:
Corporación Autónoma Regional
del Centro de Antioquia.
López, J. (1997). Tratamientos
pregerminativos. Medellín:
Universidad Nacional de Colombia.
Ospina, C., Hernández, J., Patiño, J., &
Salazar, J. (2003). El Cedro Negro:
una especie promisoria de la zona
cafetera. Chichina-Caldas:
Federación nacional de cafeteros
de Colombia.
Pérez, M. (2009). Enfermedades en las
plantas: Organismos, Patógenos,
Identificación y Diagnóstico. .
Recuperado el 12 de 2013, de
http://agricultura.uprm.edu/sea/cli
nica/CLDIAEnfPlan.pdf
Sinclair, W. (1984). The Biochemistry ans
physiology of the lemon and other
citrus fruits.California: universidad
de California, División Agrícola,
Reserva Natural.

4. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué considera Ud. Que el desarrollo del embrión cortado, es diferente
del embrión intacto?
Un embrión intacto además de permanecer aislado y estéril dentro del fruto
posee elementos como nutrientes y fitohormonas que le permiten crecer de
forma natural, un embrión cortado muestra un desarrollo diferente dado que al
ser cortado y extraído se afecta la disponibilidad de las sustancias normales que
lo rodean, hay que denotar que los embriones tienen un endospermo muy
delicado que puede lastimarse al cortar el embrión afectando su capacidad de
desarrollo(Sinclair, 1984).
2. Describa las razones para las variaciones de crecimiento.
Una de las principales razones para la variación del crecimiento de los
embriones se debe a que la semilla tiene latencia natural, la cual produce baja
uniformidaden la germinación(Gómez & Toro, 2007).
Otra razón asociada con la variación del crecimiento es la retención de
inhibidores, los cuales estáncontenidos en la testa que es permeable alagua y
semi o impermeable a algunos químicos o gases, la cual, además, ejerce
resistenciamecánica contra el desarrollo del embrión(López, 1997), el grado de
lignificación de la testaestá relacionado con la latencia que limitala cantidad de
oxígeno dentro de la semilla,lo que lleva a la producción de
sustanciasinhibidoras del crecimiento en los tejidos embriogénicos.
También los altos contenidos de aceitesen los cotiledones, disminuyen la
capacidady uniformidad de germinación, sobre todo encondiciones de alta
temperatura(Ospina, Hernández, Patiño, & Salazar, 2003).