El documento describe el uso de aptámeros en biosensores. Explica que los aptámeros son moléculas de ADN o ARN que se seleccionan para unirse a objetivos específicos a través del proceso SELEX. Luego describe varios tipos de biosensores que usan aptámeros, incluyendo aptasensores ópticos como SPR y fluorescencia, y aptasensores electroquímicos como voltametría y espectroscopía de impedancia. El documento proporciona ejemplos de cómo los aptámeros se han utilizado

1. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Uso de aptámeros en biosensores
8 -Marzo-
2.011
Aptámeros
Juan C. Vidal

2. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
I. Aptámeros y Biosensores :
II. Transducción de masa :
III. Aptasensores ópticos :
IV. Aptasensores electroquímicos :
ÍNDICE
● QCM ● AFM
● SPR ● Fluorescencia
● Aptabeacons ● Microarrays
SELEX, Transd.+Rec., vs Ab,
Spielgelmers, Plegamientos
● Voltametría ● EIS
Índice
Uso de aptámeros en biosensores

3. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
BIOSENSOR
I. Aptámeros y Biosensores

4. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Características ideales de un biosensor
I. Aptámeros y Biosensores
• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad
• Alta fiabilidad • Tiempo vida largo
• Bajo coste • Tiempo corto análisis
• Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo
• Tiempo real • Portátil
• Automatizable • Miniaturizable
• Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis

5. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Biosensores analíticos
BIOSENSORES
• Ópticos
• Electroquímicos
• T. Masa (QCM)• Catalíticos (enzimas)
• De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA,
Receptores, tejidos, MIPs…)
Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo
I. Aptámeros y Biosensores
Bioreactivo inmovilizado
Transductor

6. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Selección de aptámeros: SELEX
Aptámeros
(DNA o RNA)
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
o SELEX convencional (1990)
o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX)
o SELEX automatizado (1998)
I. Aptámeros y Biosensores
(Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN;
In-vitro transcription; modific. quím.;
Selecc. negativa;Post-SELEX)

7. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptámeros vs. Anticuerpos
I. Aptámeros y Biosensores
Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad,
cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados,
FP / EIS / SPR, Arrays
Aptámeros Anticuerpos
Afinidad μM - pM μM - pM
Especificidad Alta Alta
Síntesis In-vitro In-vivo (inmunización)
Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuesta
Réplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb)
Modif. química Sencilla / Afinidad Limitada
Desnaturalización Reversible Irreversible
Tiempo de vida Largo Limitado
Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad5-25 kDa
vs
150 kDa

8. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Spiegelmers / Aptámeros modificados
• “Mirror-image aptamers” (1996<)
• Síntesis de L-nucleósidos
(en lugar de D-enantiómeros)
• Mínima toxicidad e inmunogenicidad
Nucleósidos modificados (1994<)
(no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX.
I. Aptámeros y Biosensores
Noxxon Pharma AG

9. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Plegamiento de los Aptámeros
Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas,
interacciones dipolares (Van der Waals)
• Especificidad
• Espaciadores
• Disoluc. reguladoras
• Iones
• Regeneración
(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC)

10. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción
II. III y IV. Transducción

11. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción de masa (I)
II. Transducción de masa
QCM
S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2),
IgG, Regenerac. (2002)
• Efecto piezoeléctrico
• NO ETIQUETADO (t. real)
• f0 ~ 5 MHz, 10 MHz

12. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Transducción de masa (II)
Flexible micro-cantilevers (2004)
Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs)
3-32 nm differential bending (Gold)
2x (referencia – ads. inespecífica)
Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1)
AFM
II. Transducción de masaS ~ 1-100 nM Thbr
50 x 150 μm

13. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)
III. Aptasensores ópticos
SPR ~ 10 pg/mm2
QCM ~ 1 ng/mm2
Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real,
sin etiquetado (2001)
Sistemas de flujo (Biacore)
Kd (afinidad)

14. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores de fluorescencia (FP)
III. Aptasensores ópticos
Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt,
L-adenosina (μM) (1998)
• Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada
• Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente
• Etiquetado fluorescente del aptámero
• Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.)
• También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados)

15. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptamer microarrays
III. Aptasensores ópticos
• Spotting”
• Multianalito (1998, FP)
• Somalogic (LOD 10 fM)
• FP (fibras ópticas)
• Bi-Apt + av-agarosa
Lisozima + HIV +
Ricina (glass-slides)
(LODs 320 ng mL-1)
(Ellington, 2004)

16. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptamer molecular beacons - FP
Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996)
• Versatilidad frente Ab’s
• Composición disoluciones
• En disolución (no inmovilizac. Apt)
• No regeneración
F*-Q*
F*-F*
FRET
Mayor sensibilidad
(ej. thrombin pM) (TBA, 2002)
Cocaine (dye displac.)
III. Aptasensores ópticos

17. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores electroquímicos
IV. Aptasensores electroquímicos
•DPV, CRA, SWV, LSV, …
•EIS
ELAA (<1 nM) (2005)
TBA (CNTs)
(*): enz., MB, NPs
•S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM)
Desplazamiento

18. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores: sandwich / competitividad
IV. Aptasensores electroquímicos
Sandwich:
=> necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo
• Conjugaciones previas
• No influye el cambio conformacional (3D)
• Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs)
Competitividad o desplazamiento:
=> Necesidad de Ag*
LODs ~ 0,5 pM
ELONAs (~ ELISAs)

19. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Espectroscopía de Impedancia e-
EIS (2005)
IV. Aptasensores electroquímicos
• No etiquetado (difus. externa)
• Sensibilidad (Ab’s)
• Modulac. carga Apt.(-)
• IgG (Ferric.), hairpin,
(2-100 nM, LOD 0,1 nM)
• Medida rápida (10-90 min.)

20. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Electrochemical aptabeacons
IV. Aptasensores electroquímicos
•Etiqueta electroquímica (mediador)
•Regeneración (immovilizac.)
•“Reagentless” (as SPR, QCM)
•No “contaminación óptica”
•Cuádruple / helix-junction
•Grandes cambios conformac. (Prot.)
Ejemplos:
TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002)
Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006)
Señal ON / Señal OFF

21. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensor electroquímico de OTA (ejemplo)
IV. Aptasensores electroquímicos
Determination of OTA in wheat flour
DPV
LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s

22. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Aptasensores: ejemplos
IV. Aptasensores electroquímicos
• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr)
• 2 Apt* (FM - híbrido)
• LOD 50 pM
Aplicaciones Aptasensores:
Drogas, proteínas, peq. molec.,
Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds.,
Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av,
Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas)
Cocaína (500 μM)
(3-way-juntion)
Platelet PDGF
NPs (CNTs, QDs)

23. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAPLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES
Gracias por su atención !!
Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman)
Prof. Juan C. Vidal (GEAS)
Lcda. Alba Ezquerra (GEAS)
Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL)
Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL)
Aptasensores (inmunosensores)
electroquímicos: