Este documento describe diferentes técnicas de tinción e inmunomarcaje utilizadas para analizar tejido nervioso obtenido de muestras de cerebro y médula espinal. Incluye descripciones de técnicas de tinción como tinción de Nissl, Golgi, Klüver-Barrera e inmunocitoquímica, las cuales permiten visualizar estructuras celulares como neuronas, axones, dendritas, mielina y marcadores neuroquímicos. También presenta imágenes ilustrativas de tejido

1. González Juárez Yolanda Morales Cortés Laura Patricia

2. Análisis de imágenes de células nerviosas obtenidas mediante técnicas de tinción. Nitrato de plata Violeta de cresil Otras técnicas de tinción

3. Tinciones para el análisis de células cerebrales

4. Tinción de Nissl Es un método fundamental que utiliza colorantes acidófilos como el azul de metileno, el violeta de cresilo, la tionina, la hematoxilina, el azul de toluidina o el rojo neutro, que se unen al ARN contenido en los ribosomas, tiñendo el núcleo, el nucléolo y los ribosomas del retículo endoplasmático rugoso o sustancia de Nissl. En las células gliales solamente se tiñen los núcleos. Con esta tinción no se logran visualizar las ramificaciones de las neuronas.

5. Tintura de Nissl Cuerpos de tres neuronas multipolares del asta ventral de la materia gris de la médula espinal, con las características típicas del soma incluyendo los nucleolos prominentes (flecha verde) dentro de un gran núcleo leptocromático y grumos de sustancia de Nissl o poliribosomas rER (flecha roja) . La sustancia de Nissl o cromática se extiende desde la base de cada dendrita (D ) pero no dentro del promontorio que da nacimiento al axon

6. Tinción de Nissl que ilustra la tinción en neuronas, células gliales y células endoteliales de los capilares sanguíneos de la corteza cerebral humana

7. Hipocampo humano con tinción de Nissl mostrando la citoarquitectura y la distribución de los campos neuronales.

8. Hipocampo humano con Tinción de Nissl, procedente de un paciente epiléptico, se observa un patrón de esclerosis de hipocampo, con extensa muerte neuronal (marcada con asteriscos).

10. Soma neuronal del asta ventral de la médula espinal de rata. Las estructuras basófilas aparecen teñidas de color azul.

11. Tinciones por medio de impregnación con metales Técnicas con nitrato de plata reducido : Bielschowsky, Bodian, Cajal, Glees, Nauta, que utilizan compuestos con nitrato de plata para posteriormente tratarse las muestras con alguna sustancia reductora.

12. Tinción de Cajal del nucléolo y otros componentes de una célula piramidal.

13. Tinción de Cajal en donde se observan fibras y axones colaterales en células de Purkinje.

14. Neurona del bulbo raquídeo Tinción de Cajal

15. Tinción de Golgi Se basa en la adición de nitrato de plata y dicromato potásico en un tejido, formando un denso precipitado marrón oscuro que impregna completamente las células del sistema nervioso. Con este método se obtiene acceso a la morfología completa de las neuronas y células gliales, y asimismo el marcaje de los axones de las neuronas permite obtener información acerca de la conectividad de las distintas regiones cerebrales.

16. Permite diferenciar morfológicamente cada una de los tipos celulares del cerebro y además ayuda a agruparlas según sus características externas. La técnica tiñe selectivamente un porcentaje muy bajo de células

17. Tinción de Golgi para células piramidales.

18. Neurona piramidal de la corteza cerebral teñida con una modificación del método de Golgi.

19. Tinción de Golgi de la corteza cerebral en donde el precipitado negro permite observar a las neuronas y los astrocitos

20. Neurona piramidal que exhibe el soma y su arborización dendrítica en diferentes planos de profundidad (Técnica de Golgi y Colonnier) B. Neurona piramidal a partir del soma .Abajo en el centro, se desprende hacia arriba la dendrítica apical (Tinción de hematoxilina y eosina)

21. En esta imagen se observa un corte delgado de cerebro de gato teñido por dos procedimientos: la Tinción de Nissl, que tiñe TODOS los cuerpos celulares de violeta y la Tinción de Golgi que muestra los perfiles de algunas neuronas teñidos de negro observándose las siluetas de los cuerpos celulares y sus prolongaciones. El método de Golgi tiñe el 5 % o menos de las neuronas. Si se tiñeran todas las neuronas del tejido el corte parecería casi totalmente negro.

22. Tinciones para mielina Se basan en el uso de colorantes con afinidad por las proteínas unidas a los fosfolípidos. Sirven para identificar tractos de fibras. En neuropatología se utilizan combinaciones de tinciones para Nissl y mielina.

23. 1. Con tetróxido de osmio. Tiñe tejidos grasos de color pardo . Muestra de una fibra de mielina preparada con tetróxido de osmio Se observa un nodo de Ranvier a través de la mitad de ella. La tinción más oscura de la mielina se interrumpe en el nodo, donde la fibra está cubierta sólo por el citoplasma de la célula de Schwann.

24. Fibras separadas teñidas con tetróxido de osmio, mostrando degeneración axonal.

25. Corte semifino teñido con colorante de Richardson mostrando engrosamiento de dos fibras nerviosas, una de ellas mielinizada y la otra con una lámina fina de mielina.

26. 2.Klüver-Barrera Utiliza reactivos como azul de luxol rápido, ácido periyódico de Schiff (PAS) y hematoxilina. Permite marcar de un color los somas y de otro color la mielina de los axones, permitiendo detectar las principales rutas por las que las neuronas se proyectan a otras áreas. El colorante rojo neutro se utiliza para teñir los cuerpos de la sustancia gris y el colorante azul de luxol pone de manifiesto las vías de la sustancia blanca.

27. Núcleos y grumos de Nissl color rojo-violeta. Vainas de mielina azul oscuro. Método de Klüver- Barrera para núcleos, grumos de Nissl y vainas de mielina

28. Fragmento de corteza cerebral que contiene neuronas corticales, piramidales (flechas). Tinción de Klüver-Barrera.

29. Intoxicación aguda por disolventes. Corte hemisférico del cerebro con necrosis del centro oval. Tinción de mielina, luxol fast blue-KIüver Barrera.

30. Tinciones para la glía Tinción de Cajal que utiliza oro sublimado . Este método permite identificar los dos tipos de células neurogliales de la corteza cerebral, especialmente, los astrocitos protoplásmicos rebeldes a la tinción con otros métodos. Esta técnica posibilitó describir detalles como los pies chupadores de las células de la astroglía en la sustancia blanca de cerebros humanos

31. Sección del cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer teñido con el método de Cajal con oro sublimado

32. Proximidad a una vena sanguínea Tinción de Cajal con oro sublimado

33. Para revelar neurotransmisores

34. Fluorescencia inducida por formaldehído y ácido glioxílico. Este método permita la visualización de monoaminas debido a su unión con el formaldehído y provee una estimación semicuantitativa de las terminales monoaminérgicas y la distribución de la densidad de los cuerpos celulares en los tejidos del Sistema Nervioso Central de los mamíferos.

35. Neurona de rata marcada con fluorescencia Foto tomada con microscopía laser confocal; tinción con anticuerpos contra tubulina en neuronas cultivadas in vitro.

36. Inmunocitoquímica Las técnicas inmunocitoquímicas son un tipo de técnicas histológicas que permiten identificar elementos del Sistema Nervioso como orgánulos celulares, neurotransmisores, enzimas de síntesis o de degradación de neurotransmisores, receptores para neurotransmisores, etc. La técnica consiste en crear artificialmente sustancias químicas que reconozcan específicamente al elemento que se quiere estudiar; estas sustancias reciben el nombre de anticuerpos.

37. Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

38. Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido nervioso: la molécula tirosina hidroxilasa (a la izquierda) y el neuropéptido Y (a la derecha), usando fluoresceína y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un método de marcaje indirecto. En esta sección la tirosina hidroxilasa aparece en cuerpos celulares (flecha) mientras que el neuropéptido Y aparece en fibras. El asterisco indica donde está la célula con tirosina hidroxilasa, pero no emite luz visible porque la foto se ha tomado iluminando la sección con una longitud de onda que no excita a la fluoresceína.

39. Una vez extraído el cerebro y preparado el tejido, se incuba en una solución que contiene el anticuerpo que se unirá al elemento a estudiar. Posteriormente, se procede a la localización del anticuerpo porque éste emite señales bajo cierta condiciones, por ejemplo, señales radioactivas u fluorescentes o porque lo exponemos a un segundo anticuerpo que reconoce al primero y que emite una señal.

40. Estas técnicas pueden utilizarse también para medir la actividad cerebral a través de detectar proteínas que se sintetizan cuando las neuronas se activan gracias a los genes de acción inmediata

41. Secciones del cerebro del ratón inmunoteñidas con un anticuerpo antineuroglobina. A. Corteza B. Hipocampo y surco dentado C. Tallo cerebral D. Cerebelo y células de Purkinje.

42. Cerebro, neuronas y células gliales teñidas con una técnica inmunohistoquímica

43. Células de Purkinje del Cerebelo con tinción de Golgi, fotografía obtenida de una preparación original del laboratorio de Golgi en el Istituto di Patologia nella Università di Pavia

44. Estas imágenes se obtuvieron de cortes de tejido nervioso tratados con impregnaciones argenticas Las células que observamos en la imagen A son neuronas piramidales y en la B astrocitos fibrosos

45. BIB LIOGRAFÍA Histología y biología celular: introducción a la anatomía patológica. A. Kierszenbaum. Pp. 248 • Fundamentos de psicobiología: libro de prácticas. María Dolores Escarabajal Arrieta. Pp. 52-54 • Neuroimagen. Técnicas y procesos cognitivos. Ríos, M. pp. 9-10 • Fundamentos de Psicobiología. Diego Redolar Ripoll (coor)) pp. 119-120. • Garcia-Lopez P, Garcia-Marin V and Freire M (2010). The histological slides and drawings of Cajal. Front. Neuroanat. 4:9. doi: 10.3389/neuro.05.009.2010. • http://www.golgistain.com/Services.php • http://www.siumed.edu/~dking2/ssb/NM032b.htm • http://www.courseweb.uottawa.ca/medicine-histology/english/ss_basictissues/nervous_tissue.htm • http://www.ihcworld.com/royellis/gallery/cajal.htm • http://www.anatomyatlases.org/MicroscopicAnatomy/Section06/Plates • Histochemistry and Cell Biology Volume 49, Number 2, 81-93, DOI: 10.1007/ http://redalyc.uaemex.mx/pdf/843/84342604.pdf http://campus.usal.es/~histologia/PDAtecnicas/histotec/neurotec/neurotec.ht http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do