Produccion in vitro en bovinos 2019

Producción de embriones in vitro en Bovinos
Dr. César J. Arreseigor DVM
BIONORTE SA
info@bionortefiv.com

VENTAJAS
• Frecuencia de procedimientos
• Menos efectos colaterales para la
donante
• Se puede realizar en donantes
preñadas
• No hay necesidad de FSH en donantes
de razas cebuínas o sintéticas
• Menor cantidad de semen utilizado
• Posibilidad de utilizar semen sexado

LIMITACIONES
• Utilización a escala
– Mas Donadoras
– Mas Receptoras
• Mayor inversión en Personal
Tècnico,equipamientos y estructura
física
• Entrenamiento de los técnicos
• Menor tasa de preñez con embriones
congelados

PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO
POR OPU

Aspiracion Guiada por ultrasonografia
• poco traumático
• aplicable a hembras vacías y preñadas
• aplicable en hembras jóvenes y prepuberes
• animales con infertilidad adquirida (traumas al parto, cesareas,
fetos momificados,quísticas, etc)
• donantes con una baja respuesta superovulatoria?
•Donantes con buena respuesta superovulatoria pero con pobre
producción de embriones viables
•LO MEJOR MAS PRODUCTIVO: HACERLO EN
DONANTES NORMALES!!!!!

Punción Folicular transvaginal
con guía ultrasonográfica

Equipo de Aspiración Folicular
37

Hendriksen et al., 2004
0,78
0,41
0,27

Aspiración folicular transvaginal guiada
por ultrasonido (OPU) LABORATORIO
• El contenido del tubo se coloca en un filtro
para colecta de embriones
• Se lava el filtro con PBS a 37°C,
colocando el líquido en una placa de
Petri
• Se buscan los CCO´s (complejo cúmulo
ovocito) con una lupa 40x
• Todas las estructuras encontradas se
extraen de la placa para ser lavadas en 3
gotas

Está rodeado por el fluido folicular y por varias capas de células
del cúmulus, las que están en estrecha conexión con las células
de la granulosa.
El Complejo Ovocito Cúmulus ( COC )
Complejo ovocito-cúmulus de bovino

CALIDAD OOCITOS
GRADO I.
GRADO II.
VIABLES.
GRADO III

CALIDAD OOCITOS
DESNUDOS.
ATRESICOS.
NO VIABLES.
DEGENERADOS

Cleavage %
Blastocyst %
80
60
40
20
0
Ward et al. (1999)
Oocyte Morphology

Obtención de los ovocitos a
partir de la OPU
Maduración in vitro de ovocitos (MIV)
Selección
Lavado de los COCs en medio
de mantenimiento y maduración
Estufa de cultivo
Medio de MIV
TCM 199 + suero +
hormonas
24 horas
Ovocito con cúmulus
expandido

Estufa de cultivo
Medio de FIV
Fert-Talp (Parrish y col., 1986)
Vaselina
Atmósfera gaseada
Temperatura
PREPARACION DEL SEMEN PREPARACION DE LOS OVOCITOS
Capacitación
Reacción acrosómica
Concentración de los Espermatozoides
Maduración Nuclear y Citoplasmática
Fecundación in vitro (FIV)

P4 Device
BE
(2,0mg)
Protocolo con ECP
PGF2
+
eCG
(400UI)
+
ECP (0,5mg)
TETF
D0 D8 D 17 o 18
+
Removal
D 9-10
OPU
Sincronización de Receptoras y Momento de la OPU
para transferir embriones producidos in vitro

Protocolo J- Synch
Receptoras de embriones
dispositivo
0 6 8 16-17
72-80 hs
BE PG+eCG+Pintura TETF
OPU
~ 70-80% de tasa de celo
~ 80% de tasa de aprovechamiento
Asegura receptoras con CL y medioambiente uterino más viables para
asegurar la fertilidad.

66
SELECCION DE
DONANTES
Cada productor tiene sus propias razones para la selección de sus donantes, las cuales son a menudo
más económicas que genéticas. En realidad el factor económico es el mas importante en el programa de
transferencia embrionaria. Óptimos resultados reducirán costos por lo cual la selección de la vaca
donante es un evento critico del cual depende el éxito del programa.
Los criterios generales para la selección de donantes son los siguientes:
1- Ciclos estrales regulares y que hayan comenzado a temprana edad.
2- Dos o menos servicios por concepción en años anteriores.
3- Comportamiento individual superior en características de importancia económica.
4- Crías superiores a la media del rodeo. EPDs o Genómica
5- Ningún problema al parto o irregularidades reproductivas.
7- Ningún defecto genético o de conformación detectable.
8- Entre 3 y 10 años de edad.
9 Condición corporal moderada (3 a 3.5)
10 Historia de buena respuesta en superovulaciones anteriores?

Eficiencia de la Aspiración Folicular
principales variables biológicas
• Bos taurus vs Bos indicus
• Variación individual dentro de la misma raza
• Sincronización/superestimulacion de la Onda Folicular
• Aspiraciones Repetidas
• Nutrición donadoras.
• Estación - Stress térmico donadoras.

Cantidad y calidad de folículos en Bos taurus y Bos indicus

Carvalho et al., 2004
Gimenes et al., 2008; Pontes et al., 2010;
Guerreiro et al., 2014;
ÇÃO in
iões
MENOR POPULAÇÃO FOLÍCULOS MENOR PRODU
ANTRAIS vitro de embr
Bos
taurus
Bos
indicus
0
10
20
30
40
50
Nelore (Bos indicus) Holandesa (Bos taurus)
42
22
37
15
21.5
1.1
Folículos vizualizados
Óocitos recuperados
Embriões clivados
Blastocistos
P < 0,01
a a
a 7.3
a
b
b 5.2
b b
Gimenes et al., 2008

RESULTADOS POR RAZA
Breed n
Number of
viable COCs
collected
Number of
cleaved
zygotes
(%)
Number of
blastocysts
produced
(%)
Holstein 620 8.0±0.2 a
4.3±0.1a 1.6±0.1 a
(57%) (21%)
Angus and
229 11.6±0.5 a
6.1±0.4 a 3.0±0.2 a
Bonsmara (54%) (26%)
Brangus and
1045 19.3±0.4 b
10.4±0.3 b 5.3±0.2 b
Braford (57%) (30%)
Brahman 52 15.8±1.4 b
11.3±1.2 b 6.8±0.9 b
(72%) (41%)
ab P<0.05 Bernal et al., IETS 2015

Tabla 1. Nº Total de ovocitos, ovocitos viables y blastocistos por raza
An
gus
Braford Brangus Bonsmara Holando
Nº de ovocitos
totales
15.5
(c)
25.68 (a) 21.81 (b) 16.59 (c) 14.65(c)
Nº ovocitos totales
viables
13.0
8 (c)
20.0 (a) 17.5 (b) 14.47 (c) 7.12 (d)
Nº de blastocistos
G1
5.55
(a)
4.74 (a) 5.94 (a) 3.92 (b) 3.82 (b)
Tabla 2. Nº Total de ovocitos, ovocitos viables y blastocistos por cuartiles
C1 C2 C3 C4
Nº de ovocitos totales 13.01 (c) 16.7 (b) 17.9 (b) 28.85 (a)
Nº ovocitos totales
viables
8.91 (a) 12.15 (b) 13.83 (c) 23.10 (a)
Nº de blastocistos G1 3.08 (c) 4.08 (b) 5.51 (a) 7.17 (a)

RESULTS – Effect of Type of Semen
Semen n
Number of
viable
COCs
collected
Number of
cleaved
zygotes
(%)
Number of
blastocysts
produced
(%)
Conventional 139 10.9±0.5
6.3±0.4 2.8±0.2
(62%) b (27%) b
Sexed 481 7.1±0.2
3.7±0.1 1.1±0.6
(55%) a (19%) a
ab P<0.05

Numero de Folículos:
causas?
Cual puede ser la causa de variación
en el numero de folículos?
1. Genéticas
2. Ambientales
79

Secuelas
• adherencias de ovario
• proliferación del tejido conectivo - fibrosis
• los cambios cíclicos
• donantes preñadas pierden la preñez
• reducción de longevidad reproductiva de las
donantes?
• propagación de enfermedades

• Factores
 aguja
 método de aspiración: precisa o “Vacum”
 tiempo entre las aspiraciones
 capacidad del veterinario
 número de aspiraciones
Adherencias y Fibrosis

Que Pasa con la donadoras
Despues de muchas OPU?
 En general hay un disminución de la producción de embriones
a medida que se hacen aspiraciones repetidas.
 Pero los datos son controversiales
 Hay diferencias entre animales superestimulados y los no
superestimulados?
 Hay lesiones en el ovario?
 Hay secrecion anormal de progesterona y estradiol? 96

Gimenes et al., Theriogenology 83 (2015) 385–393

OPU in Holstein Superstimulated Donors collected
10 times every two weeks.
Donors were ≥ 12 mo old (n = 38).
F.X. Grand, Alliance Boviteq, Saint-Hyacinthe QC, Canada

Tabla 1: Comparación entre sistemas de producción de embriones
SISTEMA MOET OPU-FIV
Hormonas Superovulación Opcional FSH, ECG, P4, GnRH
Semen 3 paj /col 1 paj /hasta 8 donantes
Frecuencia 42 a 60 días 14 a 21 días
Embriones/col 5 a 6 2 (europeas) – 4-6 (indicas)
Emb/año 30 - 35 40 - 80
Preñez TEF-TEC 65 - 55% 40 - 30%
Abortos 5 – 10% 10 – 15%
Peso al Nacer + 10% + 20 – 50%
Distocias 5 – 10% 10 – 20%
Pérdidas terneros 10 – 12% 20 – 25%
Terneros gigantes < 0,1% 2 – 4%
COMPARACION ENTRE LOS SISTEMAS MOET Y OPU-FIV

Costos de producción de toros seleccionados hasta los 2 años
MOET OPU-FIV
Genética de donantes 100 Kg. 100 Kg.
Tecnología y servicios 150 200
Pérdidas hasta los 7 d 10% 35 20 % 90
Gastos DNA ARP 50 50
Selección al destete 10% 43 10% 59
Costos receptora y ternero 120 150
Alimentación hasta los 650 Kg. 350 350
Sanidad general 20 20
Examen andrológico 40 40
Pérdidas 10% 100 10% 120
TOTAL 1008 Kg. 1179 Kg.

OTROS FACTORES QUE AFECTAN
LA PRODUCCION DE OVOCITOS

1. Oocyte quality
and IVP in donor
calves

Doadora
Doadora com avaliação genética

TE
(doadora
adulta)
1ª GERAÇÃO 5.000
2ª GERAÇÃO 6.000
3ª GERAÇÃO 7.000
4ª GERAÇÃO 8.000
5ª GERAÇÃO 9.000
Simulação: Rebanho com produção média de 4.000 kg / lactação
Sêmen de touros com PTA + 500 kg / lactação
Embrião de vacas com PTA + 500 kg / lactação
Intervalo
entre
gerações
de
3
anos
TE
(doadora
bezerra)
1ª GERAÇÃO 5.000
2ª GERAÇÃO 6.000
3ª GERAÇÃO 7.000
4ª GERAÇÃO 8.000
5ª GERAÇÃO 9.000
15 anos
Intervalo
entre
gerações
de
1
ano
5 anos
TE de doadoras adultas (2 anos) x TE de doadoras bezerras (2 meses)

Qualidade oocitária e produção in vitro de embriões
de bezerras da raça Nelore

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
OPU (laparoscopia)
Avaliação qualidade
oócito, PIVE
Bezerras 3 meses- P4
(n=8)
Novilhas púberes
controle positivo
( n=8)
Bezerras 3 meses- P4+FSH
(n=8)

2. Grupo Bezerras com P4 + FSH (n = 8)
D7
CIDR®
D0 D5M D5T D6M D6T
3. Grupo Novilha púbere Controle Positivo (n = 8)
FSH
(30mg)
FSH
(30mg)
FSH
(20mg)
FSH
(20mg)
OPU Laparoscopia
(Manhã)
1. Grupo Bezerras com P4 (n = 8)
D0 D7
CIDR®
OPU Laparoscopia
(Manhã)
D0 D7
OPU Transvaginal
(Manhã)

IDADE : 3,5 MESES
PESO MÉDIO: 115,9 kg
BEZERRAS UTILIZADAS NO EXPERIMENTO

Pregnancy rate of calves embryos
produced in vitro (2015)
Cycling Heifers
(2 year) 29/56 51.8%
Calves
(2 a 4 months) 13/30 43.3%

Birth of a calves of an embryo of calves

In vitro embryo production of Holstein
calves

In vitro embryo production of Holstein calves
OPU - Laparoscopia
(bezerras)
PIVE
Bezerras 2-4 meses (n=24) Novilhas púberes 13-16 meses (n=8)
OPU - Transvaginal guiada
por US
(novilhas púberes)

EXPERIMENTAL DESING
2. Grupo Bezerras com P4 + FSH (n = 8)
D7
CIDR®
D0 D5M D5T D6M D6T
3. Grupo Novilha púbere Controle Positivo (n = 8)
FSH
(30mg)
FSH
(30mg)
FSH
(20mg)
FSH
(20mg)
OPU Laparoscopia
(Manhã)
1. Grupo Bezerras com P4 (n = 8)
D0 D7
CIDR®
OPU Laparoscopia
(Manhã)
D0 D7
OPU Transvaginal
(Manhã)

OBS: nenhum d
P
o
Ó
sa
S
n
-
O
i
m
P
a
E
i
R
sAa
p
Tr
Óe
Rs
e
IOn
t
a
r
a
mqualquer
complicação após o procedimento cirúrgico

CALVES HEIFERS CONTROL
N 9 9 .
Oócitos totais, n 5,4 7,2 .
Oócitos viáveis, n 1,0 2,6 .
Taxa de viáveis1, % 18,4 35,4 .
Oócitos cultivados, n 4,0 6,0 49
Embriões clivados, n 2,7 5,0 43,0
Taxa de clivagem2, % 66,7 83,3 87,8
Embriões por animal, n 0,9 2,1 15
Taxa de blastocisto3, % 22,2 35,2 30,6
1 número oócitos viáveis/número de oócitos total
2 número de embriões clivados/ número de oócitos cultivados
3 número de blastocistos produzidos/ número de oócitos cultivados

Birth of a calf of an embryo of calf

2. Oocyte quality and IVP
in prepubertal and
pubertal heifes

NELORE (Bos indicus)

Experimental desing
Prepubertal
(8 to 12 mo)
n=24
Prepubertal
(18 to 22 mo)
n=20
Pubertal
(22 to 26 mo)
n=25
• Nelore heifers

HOLSTEIN (Bos taurus)
EXPERIMENTAL DESING

In vitro embryo production of prepubertal Holstein
donors
Master Thesis (USP)
Bruna Martins Guerreiro
2014

In vitro embryo production of prepubertal Holstein donors
OPU +US Oocyte quality and IVF
Prepubertal heifers Pubertal heifers 12-14
8-10 m (n=32) m (n=32)
Lactanting cows
(n=32)
Non lactanting cows
(n=32)

In vitro embryo production of prepubertal Holstein donors
OPU OPU OPU OPU OPU OPU
D0 D15 D30 D45 D60 D75
Experimental desing

Pregnancy rate in beef recipients
28.6
0
5
10
15
25
20
30
35
40
Prepubertal Pubertal Lactating cows Non-lactating cows
Conception
rate,
%
0
(0/15)
9.7
(3/28)
(10/25)
32.7
(36/74)
P=0.13

Guerreiro, B. 2014 (Mestrado FMVZ/USP)

Effect of FSH treatment in OPU programs in
prepubertal Holstein heifers

Experimental Desing
D0 D7
DISPOSITIVO P4
D4M D4T D5M D5T
FSH
(46mg)
FSH
(46mg)
FSH
(34mg)
FSH
(34mg)
OPU
(manhã)
BE (2mg) + 2mL
PROSTAGLANDINA
36h
- CONTROLE (n = 20 novilhas púberes)
- FSH 160 mg (n = 20 novilhas púberes)
D7
D0 D4M D4T D5M D5T
OPU
(manhã)
DISPOSITIVO P4
BE (2mg) + 2mL
PROSTAGLANDINA

RESULTADOS PARCIAIS
CONTROL FSH
n 6 6
Folículos aspirados,n 9,0 25,6
Taxa de recuperação, n 1 70,0 40,0
Oócitos totais recuperados, n 6,5 10,2
Oócitos viáveis, n 3,3 5,8
Taxa de oócitos viáveis, % 2 51,3 57,4
Embriões clivados, n 2,5 5,2
Taxa de clivagem, % 3 55,1 84,4
Taxa de blastocisto, % 4 33,3 58,6
Blastocistos, n 1,3 3,5
1 (No. Oócitos totais/folículos aspirados)*100
2 (No. oócitos viáveis/oócitos totais)*100
3 (No. oócitos clivados/Oócitos viáveis)*100
4 (No. blastocistos/Oócitos viáveis)*100

RESULTADOS PARCIAIS
1.3
7.4
58.44
3.7
39.6
88.9
0
10
20
30
50
40
70
60
80
90
100
FSH CONTROLE
Proporção
de
folículos,
%
Fols < 6 mm
Fols 6-10 mm
Fols > 10 mm

1
5
7
 Trans Ova data presented at AETA, 2016.
EMBRYO TRANSFER (OPU / IVP)

Superestimulación con FSH para la
producción de ovocitos para FIV

Experimento 1 - Protocolo
Vieira et al., 2014 - Therigenology

Control p-FSH Control p-FSH Treatment Lactation Treat*Categ
No. 15 15 15 15 . . .
Total follicles aspirated 17.6±1.6 18.2±2.1 16.7±1.5 16.3±1.6 0.92 0.52 0.62
Total oocytes retrieved 13.0±1.7 10.7±1.5 10.9±1.6 9.9±1.5 0.10 0.51 0.54
Recovery rate, % 1
73.9
(195/264)
59.0
(161/273)
65.6
(164/250)
61.1
(149/244)
< 0.001 0.89 0.08
COCs cultured 10.0±1.3 8.9±1.3 8.5±1.4 8.3±1.3 0.52 0.58 0.57
COCs culture rate, % 2
76.9
(150/195)
82.6
(133/161)
78.0
(128/164)
83.9
(125/149)
0.05 0.77 0.88
Lactating donors Non-lactating donors P-value 5
Cleavage rate, % 3
65.3
(98/150)
8
63.2 72.7 72.
(84/133) (93/128) (91/125)
0.81 0.16 0.69
Blastocyst r
Embryos pr
10.8 17.3 31.3 52.8
ate, % 4 < 0.001 0.001 0.16
(15/150) (23/133) (40/168) (66/125)
oduced per OPU 1.0±0.4 1.5±0.5 2.7±0.6 4.4±0.8 0.01 0.003 0.17
EMBRIÕES / SESSÃO DE OPU
DOADORA EM LACTAÇÃO DOADORA SECA
Resultados prévios

Protocolo

Control p-FSH Control p-FSH Treatment Lactation Treat*Categ
No. 15 15 15 15 . . .
Total follicles aspirated 17.6±1.6 18.2±2.1 16.7±1.5 16.3±1.6 0.92 0.52 0.62
Total oocytes retrieved 13.0±1.7 10.7±1.5 10.9±1.6 9.9±1.5 0.10 0.51 0.54
Recovery rate, % 1
73.9
(195/264)
59.0
(161/273)
65.6
(164/250)
61.1
(149/244)
< 0.001 0.89 0.08
COCs cultured 10.0±1.3 8.9±1.3 8.5±1.4 8.3±1.3 0.52 0.58 0.57
COCs culture rate, % 2
76.9
(150/195)
82.6
(133/161)
78.0
(128/164)
83.9
(125/149)
0.05 0.77 0.88
Lactating donors Non-lactating donors P-value 5
Cleavage rate, % 3
65.3
(98/150)
8
63.2 72.7 72.
(84/133) (93/128) (91/125)
0.81 0.16 0.69
Blastocyst r
Embryos pr
10.8 17.3 31.3 52.8
ate, % 4 < 0.001 0.001 0.16
(15/150) (23/133) (40/168) (66/125)
oduced per OPU 1.0±0.4 1.5±0.5 2.7±0.6 4.4±0.8 0.01 0.003 0.17
EMBRIÕES / SESSÃO DE OPU
DOADORA EM LACTAÇÃO DOADORA SECA
Resultados
Vieira et al., Theriogenology 2014; 82:318-324

 El control de la dinámica folicular es fundamental para la
Producción de Embriones.
 Sin embargo, la mayor variación en la Producción de
Embriones entre animales se debe al número de folículos por
onda folicular y estas están correlacionadas con:
 La respuesta superovulatoria y la producción in vivo.
 La obtención de ovocitos y la producción in vitro.
 La identificación de los animales con una mayor
población folicular ayuda en gran medida a disminuir la
variación en la producción de embriones in vivo e in vitro

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A.-BOVINOS y BUBALINOS
1.-ASPIRACION FOLICULAR(OPU)
2.-CLASIFICACIÒNY MANIPULACION DE OVOCITOS Y EMBRIONES
3.-COLECTA Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
4.-CONGELACIÓN DE EMBRIONES Y OVOCITOS
5.-EVALALUACION,MANEJO,TRANPORTE Y TE DE EMBRIONES FIV
6.-TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
7.-IA e IATF
8.-ECOGRAFIAS REPRODUCTIVAS
9.-LABORATORIO DE FIV
10.-TRANSFERENCIA INTRAFOLICULAR DE OVOCITOS INMADUROS(TIFOI)
11.-BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS EN BUBALINOS
B.- OVINOS Y CAPRINOS
1.- IA CONVENCIONAL Y LAPAROSCOPIA
2.-MANEJO DE SEMEN FRESCO Y CONGELACION
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