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Efecto citotóxico de Annona muricata
(guanabana) en cultivo de líneas celulares de
adenocarcinoma gástrico y pulmonar.
Annona muricata (guanabana) citotoxic effect
in lung and abdominal neoplasms cell lines

        Angel Quispe(1), David Zavala(1), Margarita Posso(1), José Rojas(1), Abraham Vaisberg(2)
        Sociedad Científica de San Fernando. Lima, Perú.


            RESUMEN
            Objetivo: Determinar la actividad antitumoral del extracto etanólico de hojas de Annona muricata “in vitro” en líneas celulares
            de adenocarcinoma de pulmón y gástrico. Diseño: Estudio experimental. Lugar: Laboratorio de Investigación del Departamen-
            to de Farmacología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y de la Facultad de Ciencias y Filosofía de la Universidad
            Peruana Cayetano Heredia. Materiales: Líneas celulares tumorales C- 678 y H-460. Intervenciones: Se enfrentó el extracto
            etanólico de hojas de Annona muricata en cultivos “in vitro” de líneas celulares tumorales y se comparó su actividad con el
            fármaco 5 Fluoruracilo. Se utilizó como control a las células VERO. Principales medidas de resultados: Actividad citotóxica
            de Annona muricata en líneas celulares C- 678, H-460 y VERO. Resultados: Se halló el porcentaje de crecimiento celular para
            cada dilución en cada línea celular comparando el número de células antes y después de la aplicación del extracto y del fármaco,
            obteniéndose la concentración inhibitoria de crecimiento medio (GI50) para cada línea celular encontrándose para H460, C678
            y VERO con extracto etanólico de hojas de Annona muricata menos de 0.00022, y con 5 Fluoruracilo 0.003, 0.0013 y 0.0043
            mg/ml respectivamente. Conclusiones: El extracto etanólico de hojas de annona muricata mostró tener efecto citotóxico sobre
            las líneas tumorales C678 y H460. Las concentraciones de extracto etanólico utilizadas parecen ser más citotóxicas que las
            concentraciones homólogas de 5 Fluoracillo.
            Palabras Clave: Annona muricata, citotoxicidad inmunológica, neoplasias pulmonares, neoplasias abdominales.




ABSTRACT                                                                                        ethanolic extract of Annona muricata leaves was less than 0, 00022.
Objective: To determine the antitumoral “in vitro” activity of the                              However, the inhibiting concentration with 5 FU was 0,003, 0.0013
ethanolic extract Annona muricata leaves in H460 and C678 ce-                                   and 0, 0043 mg/ml for H460, C678 and VERO cells, respective-
llular lines. Design: experimental study. Setting: Laboratory of the                            ly. Conclusions: The ethanolic extract of Annona muricata leaves
San Marcos University Pharmacology Department and Sciences                                      showed cytotoxic effect in C-678 and H-460 tumoral cell lines. The
and Philosophy Faculty of Cayetano Heredia University. Materials:                               ethanolic extract concentrations used seem to be more cytotoxic
Tumor cell lines C-678 and H-460. Interventions: The ethanolic ex-                              than 5FU.
tract of Annona muricata leaves was faced in “in vitro” cultures of                             Keywords: Annona muricata, cell citotoxicity, lung neoplasms, ab-
tumor cell lines and their activity was compared with 5 Fluoruracilo                            dominal neoplasms.
(5FU). Culture of VERO cells was used as control. Main outcome                                   INTRODUCCIÓN
measures: Annona muricata cytotoxic activity in C-678 and H-460
cell lines. Results: We found the percentage of cellular growth for                             La Annona muricata, también conocida en nuestro medio
every dilution in every cellular line comparing the number of cells                             como “guanábana” es un pequeño árbol perteneciente a la
before and after the application of the extract and the drug. The in-                           familia Annonaceae, género Annona(1). Varios estudios infor-
hibiting concentration of average growth for each cellular line from                            man la presencia de acetogeninas citotóxicas en las hojas de
                                                                                                Annona muricata(2).
                                                                                                La investigación en estos compuestos ha tenido una gran ex-
                                                                                                pansión debido a sus diversas actividades biológicas, incluida
1 Estudiantes de Medicina Humana de la Facultad de Medicina de San Fernando. Univer-            la antitumoral “in vitro” citotóxica(3-13); estas actividades son
  sidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.                                               explicadas por la inhibición del complejo I de la cadena respi-
2 Facultad de Ciencias, Unidad de investigación de la Facultad de Ciencias, Universidad         ratoria mitocondrial(14).
  Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.
Correspondencia: Ángel Pelayo Quispe Mauricio.                                                  No encontramos estudios previos que evalúen la actividad
Correo-e: 0110857@unmsm.edu.pe                                                                  antitumoral de la Annona muricata en células de adenocar-
-	 Manuscrito recibido el 15 mayo de 2007 y aceptado para publicación el 20 de julio de 2007.



                                                                                                                                    CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1   19
Efecto citotóxico de Annona muricata (guanabana) en cultivo de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico y pulmonar


cinoma gástrico (C-678) ni en adenocarcinoma pulmonar              las distintas diluciones de extracto (40ul/pozo) y fueron in-
(H-460), en consecuencia este ensayo busca encontrar dicha         cubadas por 48h horas adicionales. Al término de las 48h,
actividad y la concentración ideal a la cual es efectiva contra    se cuantificó el crecimiento de las células con el método del
dichas células neoplásicas, con un margen de protección para       bioensayo de citotoxicidad con Sulforodamina B (SRB). 	
células no neoplásicas (VERO).                                     Para el extrato etanólico se mezcló 20mg de extracto eta-
                                                                   nólico más 100uL de etanol al 100%. Una hora después fue
MATERIAL Y METODO                                                  centrifugado a 12000 RPM por 10 minutos. El sobrenadante
Es un estudio experimental realizado en el laboratorio de In-      fue el stock de 20mg/100uL. Se diluyó el extracto mezclando
vestigación y Desarrollo de la Facultad de Ciencias y Filosofía,   8,5uL de stock (20mg/100uL) con 680uL de medio; asimismo
de la Universidad Peruana Cayetano Heredia y el laboratorio        para las siguientes diluciones (1:3) se mezcló 150uL de la
de Investigación del Departamento de Farmacología, de la           anterior con 300uL de medio. Finalmente cada pozo recibió
Universidad Nacional Mayor de San Marcos.                          40uL de la dilución, siendo la concentración inicial en las pla-
La unidad de investigación fue cada célula perteneciente           cas de 0,5mg/mL.
al cultivo de células VERO, de la línea celular C-678 (Ade-        Para el 5 Fluoruracilo la concentración inicial fue de 0,125mg/
nocarcinoma gástrico de ratón), y de la línea celular H 460        mL y luego se hicieron diluciones sucesivas de 1:3. Finalmen-
(Adenocarcinoma pulmonar de humano). El material bioló-            te la placa 1 fue incubada por un periodo de 48 horas, termi-
gico utilizado fueron las hojas frescas de Annona muricata,        nado éste, se procedió a la lectura de los resultados.
las líneas celulares tumorales fueron proporcionadas por el        La citotoxicidad del extracto etanólico de las hojas de Annona
Laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias y Filosofía    muricata fue evaluada en 3 diferentes líneas celulares (VERO,
de la UPCH.                                                        C678 y H460). Para evaluar dicha actividad se empleó el
Para la preparación de los extractos, se desecó 500 mg. de         estudio de citotoxicidad de la Sulforodamina B (SRB). Las
hojas de Annona muricata “guanábana” a 40ºC por 3 días             líneas celulares fueron inoculadas en dos placas para cultivo
en cámara de desecación y posteriormente pulverizadas con          de células de 96 pozos. En cada pozo se colocaron 160 ul de
un molino eléctrico, luego se procedió a la extracción con         medio de cultivo conteniendo las líneas celulares. Las placas
etanol al 95%, obteniéndose así el extracto etanólico para         fueron incubadas a 37º C en una atmósfera húmeda de 5 %
realizar el bioensayo.                                             de CO2 y 95% de aire por 24 h. La primera placa fue tratada
La línea celular C-678 fue cultivada en RPMI 1640, suplemen-       a las 24 h con ácido tricloroacético (TCA) con el fin de fijar
tado con: 7.5 % suero fetal bovino y 50 ug/ml de gentamici-        las células en tiempo cero y poder cuantificar la cantidad de
na; conservado a una temperatura de 37 ºC, en un ambiente          células antes de agregar los extractos. La segunda placa (pla-
húmedo con 95% aire y 5% CO2. Por otro lado las líneas             ca 1) recibió las diluciones del extracto o solvente como se
celulares H460 y VERO fueron cultivadas y mantenidas en            muestra en la tabla 2. Esta placa fue incubada por segunda
crecimiento logarítmico en el medio de cultivo MEM, en las         vez a 37º C en una atmósfera húmeda de 5 % de CO2 y
mismas condiciones.                                                95% de aire por 48 horas.
Se realizó un primer conteo de una muestra de cada línea ce-       Concluidas las 48 horas a cada pozo se le adicionó TCA frío
lular usando un hemocitómetro y luego hacer las diluciones         y luego se incubó a 4º C por 1 hora. Se lavó cinco veces con
necesarias y obtener una población celular similar en cada         agua con el objetivo de eliminar el TCA y luego se secó con
pozo (Tabla 1).                                                    una cámara de flujo de aire.
Para el ensayo de la actividad antitumoral se utilizó una pla-     Posteriormente se agregó Sulforodamina B (SRB) al 0,4%
ca control (placa 0) con 8 pozos para cada línea celular; y        diluído en 1% de ácido acético y se dejó en tinción por 20
además una placa experimental (placa 1) con 24 pozos para          minutos. Concluido el tiempo de tinción fueron lavados 4
cada línea celular de los cuales 8 fueron para 5 fluoruracilo,     veces con ácido acético al 1% y luego secados en cámara de
8 para extracto etanólico de hojas de Annona muricata y 8          flujo de aire.
para control.                                                      Después del secado de las placas, el colorante unido fue
Ambas placas fueron incubadas por un periodo de 24 ho-             solubilizado con 10mM de Tris base (pH 10.5). Finalmente la
ras a 37 °C, en una atmósfera húmeda conteniendo 95% de            absorbancia leída sobre un lector de placa automatizada en
aire y 5% de CO2. La placa 0 fue sometida a conteo celular         una longitud de onda de 550nm. El valor de GI50 fue definido
concluido el tiempo de incubación. A la placa 1 se agregaron       como la concentración de muestra de prueba que causó una
                                                                   reducción del 50 % de la absorbancia.
                                                                   Para hallar el GI50 de cada sustancia citotóxica se utilizó el
            Tabla 1. Número de células por cada pozo
                                                                   análisis de correlación lineal. Para todos los análisis se utilizó
                                                                   Excel 2003.
   PLACA 0*	    Control tiempo 0 (al momento de agregar el
   extracto)
                                                                   RESULTADOS
   PLACA 1*	    VERO: 3,000 cel/pozo (178,125 cell/9,5 ml)
   	            H460 : 1,500 cel/ pozo (89,062 cell/9,5 ml)        Para obtener el número de células de cada pozo se recurrió
   	            C-678 : 3,500 cel/ pozo (207,812 cell/9,5 ml)      a diferentes métodos ya señalados, los resultados fueron to-
   • Se plaquearon 160 ul / pozo                                   mados en densidades ópticas (indicador indirecto del núme-



 20   CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1
Angel Quispe, David Zavala, Margarita Posso, José Rojas, Abraham Vaisberg


Tabla 2. Porcentaje de crecimiento celular por cada dilución                                        Tabla 3. Concentración Inhibitoria de Crecimiento Medio para
	           Dilución	                      VERO	                 H460	                 C678         cada línea celular

	 en mg / mL	                           5FU	    Extracto	   5FU	 Extracto	         5FU	 Extracto    		                              5 FU	             Extracto

	                0.5000	                12.4	    -10.1	      -2.5	    -6.7	        -12.4	   -19.8   	            VERO	            0.00043	            <0.00022
	                0.1670	                14.2	    -10.5	      0.0	    -10.3	         -9.9	   -18.4   	            H460	            0.00030	            <0.00022
	                0.0560	                15.4	     38.6	       7.3	    24.0	         -3.4	    50.8   	            C678	            0.00013	            <0.00022
	                0.0190	                15.1	     36.7	     12.7	     35.1	         -2.6	    51.9
	                0.0060	                26.2	     34.1	     25.8	     36.5	          6.4	    49.6
	                0.0020	                41.5	     25.8	     33.4	     33.9	         16.5	    49.2
	                0.0010	                97.4	     42.9	     60.2	     38.1	         40.2	    38.5
	                0.0002	                99.7	     40.6	     102.1	    37.7	         71.9	    44.9   DISCUSIÓN
                                                                                                    Al comparar los resultados para todas las líneas celulares el
                                                                                                    GI50 del extracto etanólico se encontró a una concentración
                                                                                                    menor comparada con el GI50 del 5 FU, lo que demuestra
                                                                                                    que la concentración utilizada de extracto tiene mayor cito-
                                                                                                    toxicidad. Para las líneas celulares H460 y C678 las diluciones
ro), tanto del “tiempo 0”como al cabo de de las 48 horas;                                           mayores del extracto etanólico produjeron muerte celular
con los cuales se obtuvo un porcentaje de crecimiento para                                          mientras que sólo la dilución mayor de 5FU mostró el mismo
cada línea celular (Tabla 2)                                                                        comportamiento (Gráfico 1).
Con los porcentajes de crecimiento celular se determinó la                                          La línea celular C678 mostró un comportamiento diferente
GI50. No existe una correlación lineal entre las diluciones y                                       frente al extracto porque no se encontró una relación direc-
el porcentaje de crecimiento, debido a esto tomaremos los                                           ta entre concentración y citotoxicidad dicho hallazgo podría
2 puntos correspondientes a las diluciones más cercanas al                                          deberse a características intrínsecas del extracto que le otor-
GI50 para la construcción de una nueva recta para determi-                                          gan la misma actividad citotóxica a diluciones diferentes o
nar una GI50 más aproximado (este artificio es válido solo                                          quizá a la existencia de dos o más poblaciones celulares con
cuando se trabaja con extractos, debido a que contiene un                                           diferentes respuestas frente a la exposición al extracto. Sin
gamma de compuestos químicos diferentes; además para fi-                                            embargo nuestra comparación con el 5FU indicaría que la
nes del trabajo basta con obtener un GI50 aproximado para                                           posibilidad se acerca más al primer postulado que a la coexis-
determinar si el extracto es interesante o no para su poste-                                        tencia de dos o más poblaciones celulares. Existen estudios
rior análisis).                                                                                     realizados con acetogeninas (compuestos puros) de Annona
Tomando en cuenta estas salvedades se obtuvo los siguientes                                         muricata que demostraron actividad antitumoral, sus resulta-
GI50 para cada línea celular. (Tabla 3). Se pudo determinar                                         dos muestran una actividad directa sobre el complejo I de la
un aproximado de la GI50 para el extracto etanólico de hojas                                        cadena respiratoria mitocondrial inhibiendo de esta manera
de Annona muricata, ya que ésta se encontraba a diluciones                                          la proliferación celular tumoral.(15)
menores que las previstas para el presente trabajo (en las 3                                        La posible actividad antitumoral de Annona muricata se debe
líneas la GI50 está por debajo de 0.00022 mg/ml de concen-                                          a un compuesto activo que posee ésta, probablemente se
tración del extracto). Para el control positivo, el 5Flúorura-                                      trate de una acetogenina aunque no se puede descartar la
cilo, se determinó la GI50 con las diluciones previstas en el                                       presencia de un nuevo compuesto, dicho compuesto no fue
diseño del presente trabajo.                                                                        identificado en éste trabajo; pues la naturaleza del mismo no
                                                                                                    lo permite, por eso, se recomienda un posterior estudio en
                                                                                                    el que se realice la purificación e identificación del compues-
                                                                                                    to activo específico que posee esta actividad.
                                                                                                    Así también, se recomienda probar la actividad antitumoral
                              Grafico 1: Concentración Inhibitoria de Crecimiento Medio             de extracto etanólico de Annona muricata “in vivo” en ani-
                                                                                                    males de de experimentación.
                                  5
                                  4.5                                                               Se concluye que el extracto etanólico de hojas de Annona
                                  4                                                                 muricata mostró tener efecto citotóxico sobre las líneas
    Concentración mg/mL x 10 -4




                                  3.5                                                               tumorales C678 y H460; las concentraciones de extracto
                                  3                                                                 etanólico utilizadas son más citotóxicas que las concentra-
                                  2.5                                                               ciones homólogas de 5FU, y para la línea VERO la actividad
                                  2
                                                                                                    citotóxica de extracto etanólico es superior a la actividad del
                                  1.5
                                                                                                    homólogo de 5FU.
                                  1
                                  0.5
                                                                                                    AGRADECIMIENTOS
                                  0
                                          VERO                H460            C678 Línea celular    Al Dr. Jorge Arroyo Acevedo del departamento de Farmacología de
                                                                                                    la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San
                                        GI50 5 FLUORURACILO          GI50 EXTRACTO                  Marcos, por prestar ambientes y asesoría para la preparación del
                                                                                                    extracto etanólico de hojas de Annona muricata.


                                                                                                                                            CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1   21
Efecto citotóxico de Annona muricata (guanabana) en cultivo de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico y pulmonar


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS                                                           from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod 1995, 58(9):1430-7.
                                                                                 8.	 Wu F, Zeng L, Gu Z, Zhao G, Zhang Y et al. Muricatocins A and B, two new
1.	 Lock O, Rojas R. Química y Farmacología de Annona Muricata Linn. Revis-
                                                                                     bioactive monotetrahydrofuran Annonaceous acetogenins from the leaves
    ta de Química 2003; 8(2):23-8.
                                                                                     of Annona muricata. J Nat Prod 1995, 58(6): 902-8.
2.	 Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers L, Wu F et al. Muricoreacin and murihexocin
                                                                                 9.	 Geum-Soog K, Lu Z, Feras A, Lingling L, Feng-E, Wu Z, et al. Two New Mono-
    C, mono-tetrahydrofuran acetogenins, from the leaves of Annona murica-
                                                                                     Tetrahydrofuran Ring Acetogenins, Annomuricin E and Muricapentocin, from
    ta. Phytochemistry 1998; 49(2):565-71.
                                                                                     the Leaves of Annona muricata. J Nat Prod 1998, 61(4):432-6.
3.	 Hopp D, Zeng L, Gu Z, Kozlowski J, McLaughlin J. Novel mono-te-
                                                                                 10.	Saw H, Diego C, Laurens A, Hocquemiller R, Lebuf M, et al. Solamin, a
    trahydrofuran ring acetogenins, from the bark of Annona squamosa,
                                                                                     cytotoxic mono-tetrahydrofuranic -lactone acetogenin from Annona mu-
    showing cytotoxic selectivities for the human pancreatic carcinoma cell
    line, PACA-2. J Nat Prod 1997, 60(6):581-6.                                      ricata seeds. Phytochemistry 1991, 30(10):3335-8.
4.	 Hopp D, Zeng L, Gu Z, McLaughlin J. Squamotacin: an annonaceous ace-         11.	Fang-Rong Ch, Yang-Chang W. Novel Cytotoxic Annonaceous Acetoge-
    togenin with cytotoxic selectivity for the human prostate tumor cell line        nins from Annona muricata. J Nat Prod 2001, 64 (7):925-31.
    (PC-3). J Nat Prod. 1996, 59(2):97-9.                                        12.	Fang-Rong Ch., Chih-Chuang L., Chih-Yuan L., Chi-Jung Ch., Hui-Fen Ch.
5.	 Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers L, Wu F et al. Muricoreacin and murihexocin       et al. New Adjacent Bis-Tetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins from
    C, mono-tetrahydrofuran acetogenins, from the leaves of Annona murica-           Annona muricata. Plant Med 2003; 69:241-6.
    ta. Phytochemistry 1998, 49(2):565-71.                                       13.	Chih-Chuang L., Fang-Rong Ch., Chih-Yuan Lin, Chi-Jung Ch., Hui-Fen Ch.
6.	 Wu F, Zeng L, Gu Z, Zhao G, Zhang Y et al.. New bioactive monote-                et al. New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins
    trahydrofuran Annonaceous acetogenins, annomuricin C and muricatocin             from Annona muricata. J. Nat. Prod 2002, 65(4):470-5.
    C, from the leaves of Annona muricata. J Nat. Prod 1995, 58(6):909-15.       14.	Tormo J, González C, Cortes D, Estornell E. Kinetic Characterization of
7.	 Wu F, Zhao G, Zeng L, Zhang Y, Schwedler J, et al. Additional bioactive          Mitochondrial Complex I Inhibitors Using Annonaceous Acetogenins Arch
    acetogenins, annomutacin and (2,4-trans and cis)-10R-annonacin-A-ones,           Biochem Biophys 1999; 369 (1):119-26.




  22    CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1

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  • 1. Articulo original Efecto citotóxico de Annona muricata (guanabana) en cultivo de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico y pulmonar. Annona muricata (guanabana) citotoxic effect in lung and abdominal neoplasms cell lines Angel Quispe(1), David Zavala(1), Margarita Posso(1), José Rojas(1), Abraham Vaisberg(2) Sociedad Científica de San Fernando. Lima, Perú. RESUMEN Objetivo: Determinar la actividad antitumoral del extracto etanólico de hojas de Annona muricata “in vitro” en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y gástrico. Diseño: Estudio experimental. Lugar: Laboratorio de Investigación del Departamen- to de Farmacología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y de la Facultad de Ciencias y Filosofía de la Universidad Peruana Cayetano Heredia. Materiales: Líneas celulares tumorales C- 678 y H-460. Intervenciones: Se enfrentó el extracto etanólico de hojas de Annona muricata en cultivos “in vitro” de líneas celulares tumorales y se comparó su actividad con el fármaco 5 Fluoruracilo. Se utilizó como control a las células VERO. Principales medidas de resultados: Actividad citotóxica de Annona muricata en líneas celulares C- 678, H-460 y VERO. Resultados: Se halló el porcentaje de crecimiento celular para cada dilución en cada línea celular comparando el número de células antes y después de la aplicación del extracto y del fármaco, obteniéndose la concentración inhibitoria de crecimiento medio (GI50) para cada línea celular encontrándose para H460, C678 y VERO con extracto etanólico de hojas de Annona muricata menos de 0.00022, y con 5 Fluoruracilo 0.003, 0.0013 y 0.0043 mg/ml respectivamente. Conclusiones: El extracto etanólico de hojas de annona muricata mostró tener efecto citotóxico sobre las líneas tumorales C678 y H460. Las concentraciones de extracto etanólico utilizadas parecen ser más citotóxicas que las concentraciones homólogas de 5 Fluoracillo. Palabras Clave: Annona muricata, citotoxicidad inmunológica, neoplasias pulmonares, neoplasias abdominales. ABSTRACT ethanolic extract of Annona muricata leaves was less than 0, 00022. Objective: To determine the antitumoral “in vitro” activity of the However, the inhibiting concentration with 5 FU was 0,003, 0.0013 ethanolic extract Annona muricata leaves in H460 and C678 ce- and 0, 0043 mg/ml for H460, C678 and VERO cells, respective- llular lines. Design: experimental study. Setting: Laboratory of the ly. Conclusions: The ethanolic extract of Annona muricata leaves San Marcos University Pharmacology Department and Sciences showed cytotoxic effect in C-678 and H-460 tumoral cell lines. The and Philosophy Faculty of Cayetano Heredia University. Materials: ethanolic extract concentrations used seem to be more cytotoxic Tumor cell lines C-678 and H-460. Interventions: The ethanolic ex- than 5FU. tract of Annona muricata leaves was faced in “in vitro” cultures of Keywords: Annona muricata, cell citotoxicity, lung neoplasms, ab- tumor cell lines and their activity was compared with 5 Fluoruracilo dominal neoplasms. (5FU). Culture of VERO cells was used as control. Main outcome INTRODUCCIÓN measures: Annona muricata cytotoxic activity in C-678 and H-460 cell lines. Results: We found the percentage of cellular growth for La Annona muricata, también conocida en nuestro medio every dilution in every cellular line comparing the number of cells como “guanábana” es un pequeño árbol perteneciente a la before and after the application of the extract and the drug. The in- familia Annonaceae, género Annona(1). Varios estudios infor- hibiting concentration of average growth for each cellular line from man la presencia de acetogeninas citotóxicas en las hojas de Annona muricata(2). La investigación en estos compuestos ha tenido una gran ex- pansión debido a sus diversas actividades biológicas, incluida 1 Estudiantes de Medicina Humana de la Facultad de Medicina de San Fernando. Univer- la antitumoral “in vitro” citotóxica(3-13); estas actividades son sidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú. explicadas por la inhibición del complejo I de la cadena respi- 2 Facultad de Ciencias, Unidad de investigación de la Facultad de Ciencias, Universidad ratoria mitocondrial(14). Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú. Correspondencia: Ángel Pelayo Quispe Mauricio. No encontramos estudios previos que evalúen la actividad Correo-e: 0110857@unmsm.edu.pe antitumoral de la Annona muricata en células de adenocar- - Manuscrito recibido el 15 mayo de 2007 y aceptado para publicación el 20 de julio de 2007. CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1 19
  • 2. Efecto citotóxico de Annona muricata (guanabana) en cultivo de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico y pulmonar cinoma gástrico (C-678) ni en adenocarcinoma pulmonar las distintas diluciones de extracto (40ul/pozo) y fueron in- (H-460), en consecuencia este ensayo busca encontrar dicha cubadas por 48h horas adicionales. Al término de las 48h, actividad y la concentración ideal a la cual es efectiva contra se cuantificó el crecimiento de las células con el método del dichas células neoplásicas, con un margen de protección para bioensayo de citotoxicidad con Sulforodamina B (SRB). células no neoplásicas (VERO). Para el extrato etanólico se mezcló 20mg de extracto eta- nólico más 100uL de etanol al 100%. Una hora después fue MATERIAL Y METODO centrifugado a 12000 RPM por 10 minutos. El sobrenadante Es un estudio experimental realizado en el laboratorio de In- fue el stock de 20mg/100uL. Se diluyó el extracto mezclando vestigación y Desarrollo de la Facultad de Ciencias y Filosofía, 8,5uL de stock (20mg/100uL) con 680uL de medio; asimismo de la Universidad Peruana Cayetano Heredia y el laboratorio para las siguientes diluciones (1:3) se mezcló 150uL de la de Investigación del Departamento de Farmacología, de la anterior con 300uL de medio. Finalmente cada pozo recibió Universidad Nacional Mayor de San Marcos. 40uL de la dilución, siendo la concentración inicial en las pla- La unidad de investigación fue cada célula perteneciente cas de 0,5mg/mL. al cultivo de células VERO, de la línea celular C-678 (Ade- Para el 5 Fluoruracilo la concentración inicial fue de 0,125mg/ nocarcinoma gástrico de ratón), y de la línea celular H 460 mL y luego se hicieron diluciones sucesivas de 1:3. Finalmen- (Adenocarcinoma pulmonar de humano). El material bioló- te la placa 1 fue incubada por un periodo de 48 horas, termi- gico utilizado fueron las hojas frescas de Annona muricata, nado éste, se procedió a la lectura de los resultados. las líneas celulares tumorales fueron proporcionadas por el La citotoxicidad del extracto etanólico de las hojas de Annona Laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias y Filosofía muricata fue evaluada en 3 diferentes líneas celulares (VERO, de la UPCH. C678 y H460). Para evaluar dicha actividad se empleó el Para la preparación de los extractos, se desecó 500 mg. de estudio de citotoxicidad de la Sulforodamina B (SRB). Las hojas de Annona muricata “guanábana” a 40ºC por 3 días líneas celulares fueron inoculadas en dos placas para cultivo en cámara de desecación y posteriormente pulverizadas con de células de 96 pozos. En cada pozo se colocaron 160 ul de un molino eléctrico, luego se procedió a la extracción con medio de cultivo conteniendo las líneas celulares. Las placas etanol al 95%, obteniéndose así el extracto etanólico para fueron incubadas a 37º C en una atmósfera húmeda de 5 % realizar el bioensayo. de CO2 y 95% de aire por 24 h. La primera placa fue tratada La línea celular C-678 fue cultivada en RPMI 1640, suplemen- a las 24 h con ácido tricloroacético (TCA) con el fin de fijar tado con: 7.5 % suero fetal bovino y 50 ug/ml de gentamici- las células en tiempo cero y poder cuantificar la cantidad de na; conservado a una temperatura de 37 ºC, en un ambiente células antes de agregar los extractos. La segunda placa (pla- húmedo con 95% aire y 5% CO2. Por otro lado las líneas ca 1) recibió las diluciones del extracto o solvente como se celulares H460 y VERO fueron cultivadas y mantenidas en muestra en la tabla 2. Esta placa fue incubada por segunda crecimiento logarítmico en el medio de cultivo MEM, en las vez a 37º C en una atmósfera húmeda de 5 % de CO2 y mismas condiciones. 95% de aire por 48 horas. Se realizó un primer conteo de una muestra de cada línea ce- Concluidas las 48 horas a cada pozo se le adicionó TCA frío lular usando un hemocitómetro y luego hacer las diluciones y luego se incubó a 4º C por 1 hora. Se lavó cinco veces con necesarias y obtener una población celular similar en cada agua con el objetivo de eliminar el TCA y luego se secó con pozo (Tabla 1). una cámara de flujo de aire. Para el ensayo de la actividad antitumoral se utilizó una pla- Posteriormente se agregó Sulforodamina B (SRB) al 0,4% ca control (placa 0) con 8 pozos para cada línea celular; y diluído en 1% de ácido acético y se dejó en tinción por 20 además una placa experimental (placa 1) con 24 pozos para minutos. Concluido el tiempo de tinción fueron lavados 4 cada línea celular de los cuales 8 fueron para 5 fluoruracilo, veces con ácido acético al 1% y luego secados en cámara de 8 para extracto etanólico de hojas de Annona muricata y 8 flujo de aire. para control. Después del secado de las placas, el colorante unido fue Ambas placas fueron incubadas por un periodo de 24 ho- solubilizado con 10mM de Tris base (pH 10.5). Finalmente la ras a 37 °C, en una atmósfera húmeda conteniendo 95% de absorbancia leída sobre un lector de placa automatizada en aire y 5% de CO2. La placa 0 fue sometida a conteo celular una longitud de onda de 550nm. El valor de GI50 fue definido concluido el tiempo de incubación. A la placa 1 se agregaron como la concentración de muestra de prueba que causó una reducción del 50 % de la absorbancia. Para hallar el GI50 de cada sustancia citotóxica se utilizó el Tabla 1. Número de células por cada pozo análisis de correlación lineal. Para todos los análisis se utilizó Excel 2003. PLACA 0* Control tiempo 0 (al momento de agregar el extracto) RESULTADOS PLACA 1* VERO: 3,000 cel/pozo (178,125 cell/9,5 ml) H460 : 1,500 cel/ pozo (89,062 cell/9,5 ml) Para obtener el número de células de cada pozo se recurrió C-678 : 3,500 cel/ pozo (207,812 cell/9,5 ml) a diferentes métodos ya señalados, los resultados fueron to- • Se plaquearon 160 ul / pozo mados en densidades ópticas (indicador indirecto del núme- 20 CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1
  • 3. Angel Quispe, David Zavala, Margarita Posso, José Rojas, Abraham Vaisberg Tabla 2. Porcentaje de crecimiento celular por cada dilución Tabla 3. Concentración Inhibitoria de Crecimiento Medio para Dilución VERO H460 C678 cada línea celular en mg / mL 5FU Extracto 5FU Extracto 5FU Extracto 5 FU Extracto 0.5000 12.4 -10.1 -2.5 -6.7 -12.4 -19.8 VERO 0.00043 <0.00022 0.1670 14.2 -10.5 0.0 -10.3 -9.9 -18.4 H460 0.00030 <0.00022 0.0560 15.4 38.6 7.3 24.0 -3.4 50.8 C678 0.00013 <0.00022 0.0190 15.1 36.7 12.7 35.1 -2.6 51.9 0.0060 26.2 34.1 25.8 36.5 6.4 49.6 0.0020 41.5 25.8 33.4 33.9 16.5 49.2 0.0010 97.4 42.9 60.2 38.1 40.2 38.5 0.0002 99.7 40.6 102.1 37.7 71.9 44.9 DISCUSIÓN Al comparar los resultados para todas las líneas celulares el GI50 del extracto etanólico se encontró a una concentración menor comparada con el GI50 del 5 FU, lo que demuestra que la concentración utilizada de extracto tiene mayor cito- toxicidad. Para las líneas celulares H460 y C678 las diluciones ro), tanto del “tiempo 0”como al cabo de de las 48 horas; mayores del extracto etanólico produjeron muerte celular con los cuales se obtuvo un porcentaje de crecimiento para mientras que sólo la dilución mayor de 5FU mostró el mismo cada línea celular (Tabla 2) comportamiento (Gráfico 1). Con los porcentajes de crecimiento celular se determinó la La línea celular C678 mostró un comportamiento diferente GI50. No existe una correlación lineal entre las diluciones y frente al extracto porque no se encontró una relación direc- el porcentaje de crecimiento, debido a esto tomaremos los ta entre concentración y citotoxicidad dicho hallazgo podría 2 puntos correspondientes a las diluciones más cercanas al deberse a características intrínsecas del extracto que le otor- GI50 para la construcción de una nueva recta para determi- gan la misma actividad citotóxica a diluciones diferentes o nar una GI50 más aproximado (este artificio es válido solo quizá a la existencia de dos o más poblaciones celulares con cuando se trabaja con extractos, debido a que contiene un diferentes respuestas frente a la exposición al extracto. Sin gamma de compuestos químicos diferentes; además para fi- embargo nuestra comparación con el 5FU indicaría que la nes del trabajo basta con obtener un GI50 aproximado para posibilidad se acerca más al primer postulado que a la coexis- determinar si el extracto es interesante o no para su poste- tencia de dos o más poblaciones celulares. Existen estudios rior análisis). realizados con acetogeninas (compuestos puros) de Annona Tomando en cuenta estas salvedades se obtuvo los siguientes muricata que demostraron actividad antitumoral, sus resulta- GI50 para cada línea celular. (Tabla 3). Se pudo determinar dos muestran una actividad directa sobre el complejo I de la un aproximado de la GI50 para el extracto etanólico de hojas cadena respiratoria mitocondrial inhibiendo de esta manera de Annona muricata, ya que ésta se encontraba a diluciones la proliferación celular tumoral.(15) menores que las previstas para el presente trabajo (en las 3 La posible actividad antitumoral de Annona muricata se debe líneas la GI50 está por debajo de 0.00022 mg/ml de concen- a un compuesto activo que posee ésta, probablemente se tración del extracto). Para el control positivo, el 5Flúorura- trate de una acetogenina aunque no se puede descartar la cilo, se determinó la GI50 con las diluciones previstas en el presencia de un nuevo compuesto, dicho compuesto no fue diseño del presente trabajo. identificado en éste trabajo; pues la naturaleza del mismo no lo permite, por eso, se recomienda un posterior estudio en el que se realice la purificación e identificación del compues- to activo específico que posee esta actividad. Así también, se recomienda probar la actividad antitumoral Grafico 1: Concentración Inhibitoria de Crecimiento Medio de extracto etanólico de Annona muricata “in vivo” en ani- males de de experimentación. 5 4.5 Se concluye que el extracto etanólico de hojas de Annona 4 muricata mostró tener efecto citotóxico sobre las líneas Concentración mg/mL x 10 -4 3.5 tumorales C678 y H460; las concentraciones de extracto 3 etanólico utilizadas son más citotóxicas que las concentra- 2.5 ciones homólogas de 5FU, y para la línea VERO la actividad 2 citotóxica de extracto etanólico es superior a la actividad del 1.5 homólogo de 5FU. 1 0.5 AGRADECIMIENTOS 0 VERO H460 C678 Línea celular Al Dr. Jorge Arroyo Acevedo del departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San GI50 5 FLUORURACILO GI50 EXTRACTO Marcos, por prestar ambientes y asesoría para la preparación del extracto etanólico de hojas de Annona muricata. CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1 21
  • 4. Efecto citotóxico de Annona muricata (guanabana) en cultivo de líneas celulares de adenocarcinoma gástrico y pulmonar REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod 1995, 58(9):1430-7. 8. Wu F, Zeng L, Gu Z, Zhao G, Zhang Y et al. Muricatocins A and B, two new 1. Lock O, Rojas R. Química y Farmacología de Annona Muricata Linn. Revis- bioactive monotetrahydrofuran Annonaceous acetogenins from the leaves ta de Química 2003; 8(2):23-8. of Annona muricata. J Nat Prod 1995, 58(6): 902-8. 2. Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers L, Wu F et al. Muricoreacin and murihexocin 9. Geum-Soog K, Lu Z, Feras A, Lingling L, Feng-E, Wu Z, et al. Two New Mono- C, mono-tetrahydrofuran acetogenins, from the leaves of Annona murica- Tetrahydrofuran Ring Acetogenins, Annomuricin E and Muricapentocin, from ta. Phytochemistry 1998; 49(2):565-71. the Leaves of Annona muricata. J Nat Prod 1998, 61(4):432-6. 3. Hopp D, Zeng L, Gu Z, Kozlowski J, McLaughlin J. Novel mono-te- 10. Saw H, Diego C, Laurens A, Hocquemiller R, Lebuf M, et al. Solamin, a trahydrofuran ring acetogenins, from the bark of Annona squamosa, cytotoxic mono-tetrahydrofuranic -lactone acetogenin from Annona mu- showing cytotoxic selectivities for the human pancreatic carcinoma cell line, PACA-2. J Nat Prod 1997, 60(6):581-6. ricata seeds. Phytochemistry 1991, 30(10):3335-8. 4. Hopp D, Zeng L, Gu Z, McLaughlin J. Squamotacin: an annonaceous ace- 11. Fang-Rong Ch, Yang-Chang W. Novel Cytotoxic Annonaceous Acetoge- togenin with cytotoxic selectivity for the human prostate tumor cell line nins from Annona muricata. J Nat Prod 2001, 64 (7):925-31. (PC-3). J Nat Prod. 1996, 59(2):97-9. 12. Fang-Rong Ch., Chih-Chuang L., Chih-Yuan L., Chi-Jung Ch., Hui-Fen Ch. 5. Kim G, Zeng L, Alali F, Rogers L, Wu F et al. Muricoreacin and murihexocin et al. New Adjacent Bis-Tetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins from C, mono-tetrahydrofuran acetogenins, from the leaves of Annona murica- Annona muricata. Plant Med 2003; 69:241-6. ta. Phytochemistry 1998, 49(2):565-71. 13. Chih-Chuang L., Fang-Rong Ch., Chih-Yuan Lin, Chi-Jung Ch., Hui-Fen Ch. 6. Wu F, Zeng L, Gu Z, Zhao G, Zhang Y et al.. New bioactive monote- et al. New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins trahydrofuran Annonaceous acetogenins, annomuricin C and muricatocin from Annona muricata. J. Nat. Prod 2002, 65(4):470-5. C, from the leaves of Annona muricata. J Nat. Prod 1995, 58(6):909-15. 14. Tormo J, González C, Cortes D, Estornell E. Kinetic Characterization of 7. Wu F, Zhao G, Zeng L, Zhang Y, Schwedler J, et al. Additional bioactive Mitochondrial Complex I Inhibitors Using Annonaceous Acetogenins Arch acetogenins, annomutacin and (2,4-trans and cis)-10R-annonacin-A-ones, Biochem Biophys 1999; 369 (1):119-26. 22 CIMEL 2007 Vol. 12 Nº 1