Manual de Torres

MANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DEMANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICABACTERIOLOGÍA MÉDICA
porporporporpor
Miguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. TorresMiguel F. Torres

Portada interna:
Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibu-
jos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
© 1996, Miguel Francisco Torres Rubín
Químico Biólogo graduado de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Posee
Maestría en Microbiología Médica de la Universidad de Duke, Carolina del Norte,
Estados Unidos.
Fundador del Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y catedrático ti-
tular de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Microbiología, Escuela de
Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San
Carlos de Guatemala.
Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social
(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Acade-
mia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Aca-
demia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
Los criterios expresados en esta publicación son de la exclusiva responsabilidad
del autor e incluyen su experiencia personal.
Impreso en Editorial Serviprensa C.A.
3a. avenida 14-68, zona 1
Tels. 232-5424, 232-9025 Fax: 232-0237
Guatemala, Guatemala, 1996

ÍNDICE
PRESENTACIÓN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRÓLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPÍTULO 1:
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos de
Esterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo de
Antisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Químicos.
CAPÍTULO 2:
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29
Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos para
la Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de Medios
Sólidos por Estrías.
CAPÍTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo.
Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del Género
Shigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colección
de Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. Patógenos
Frecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Países en Desarrollo.

CAPÍTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPÍTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación de
Resultados. Informe.
CAPÍTULO 6:
INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75
Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPÍTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propósito. Manifestaciones Clínicas y MicroorganismosAsociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. Punción
Supra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detección
de Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPÍTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo de
Garganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba de
Bacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. Características
Físicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clínico.
CAPÍTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación.
Informe.

CAPÍTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología y
Sintomatología de Neumonía y Bronquitis.
CAPÍTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología y
Sintomatología de Septicemia. Informe.
CAPÍTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatología
de Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del Género
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPÍTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de la
Sífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiológicos.
CAPÍTULO 14:
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR).
Interpretación de Resultados. Informe.
CAPÍTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe.

CAPÍTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriológica paraAntibiograma.Antibióticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gram-
negativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación de
Resultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de las
Zonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Límites
Aceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPÍTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados.
Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12
Diversas Morfologías Bacterianas. Informe.
CAPÍTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación de
Esputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína
(NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el Método
Convencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/
Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
“Atípicas”).
BIBLIOGRAFÍA / 223

ÍNDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriología
2 Asas para Micología
Fig.3 / 40
INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)

Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color y
sus explicaciones correspondientes.

Guatemala, agosto de 1996
PRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓNPRESENTACIÓN
Las enfermedades infecciosas continúan siendo la principal causa de morbi-
mortalidad en Mesoamérica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud
pública de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las
más frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal
de salud en diagnóstico bacteriológico, incide directamente en su mejor tratamiento
y control.
La Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos
de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRÁCTICO DE
BACTERIOLOGÍA MÉDICA a la comunidad científica de Guatemala y Centroamérica.
Como su título lo indica, se trata de un libro fácil de leer, comprender y aplicar,
dirigido a profesionales, estudiantes y técnicos que estudian o trabajan directamente
la bacteriología en los laboratorios clínicos privados o estatales.
El autor es catedrático titular desde hace 22 años en el Departamento de
Microbiología, Escuela de Química Biológica de esta Casa de Estudios. Durante estos
años, ha tenido a su cargo la enseñanza de la bacteriología médica a los estudiantes
de Química Biológica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera
de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no sólo como
catedrático e investigador a través de sus múltiples publicaciones en revistas
científicas nacionales e internacionales, sino también a lo largo de los años ha
demostrado su empeño por mejorar la microbiología en nuestro medio. Uno de sus
principales logros fue la creación del Laboratorio Microbiológico de Referencia
-LAMIR- en 1991.
La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigación en
bacteriología, parasitología y micología, aunados a sus conocimientos y experiencia
adquiridos durante varios años de servicio como microbiólogo clínico del Instituto
Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido
del manual.
Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidad
de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas
carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos.
Atentamente,
Lic. Jorge Rodolfo Pérez Folgar
Decano
Lic. Gerardo Arroyo Catalán Licda. Heidi Logemann Lima
Director de la Escuela Jefe del Departamento
de Química Biológica de Microbiología

AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados
bacteriólogos de Centroamérica y el Caribe, por su valiosa colaboración al haber
revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos
comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio,
enriquecen la obra.
Licda. Floridalma Cano Granados
Supervisora del Laboratorio de Bacteriología y Parasitología Intestinal
Laboratorios de Microbiología “Dr. Leonardo J. Mata”
Instituto de Nutrición de Centroamérica y Panamá
Guatemala
Dr. Edmundo E. Poujol
Ex-Director del Departamento de Microbiología
Universidad Nacional Autónoma
Honduras
Dr. Jaime Guevara R.
Jefe de la Sección de Laboratorios
Dirección Técnica de Servicios de Salud
Caja Costarricense de Seguro Social
Costa Rica
Dra. Marion C. de Martin
Vice-decana de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional
Panamá
Dr. Gerardo F. Martínez
Jefe del Departamento de Bacteriología / Micología
Sub-Dirección de Microbiología
Instituto de Medicina Tropical “Dr. Pedro Kourí”
Cuba
A los personeros del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de
Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de
la Segunda Edición del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro
mensaje académico y guía de trabajo a profesionales, técnicos de laboratorio y
estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriología médica en nuestros países,
debe ser la meta. Estas labores deben ser dinámicas y constantes.

15
PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN
Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por
primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin
embargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con los
geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera
vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivo
puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteria
como causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método de
investigación de las infecciones, actualmente vigente.
Hoy en día, la bacteriología clínica ha avanzado enormemente y en la última
década del siglo XX es muy extensa y diversa. Por este motivo, se hace necesario
extraer de la literatura actualizada los conocimientos, técnicas y criterios
interpretativos necesarios para efectuar adecuadamente los análisis bacteriológicos
más frecuentes, y ordenarlos de manera simple y comprensible. Estos son los
propósitos fundamentales de la presente publicación.
Este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA MÉDICA no es un texto
exhaustivo de la materia, ni mucho menos un tratado de taxonomía bacteriana. Es
una guía simplificada de trabajo, orientada hacia la obtención de resultados lo más
rápido posible y con el mayor significado clínico. Al final del libro, se seleccionan
las referencias bibliográficas más relevantes.
Anteriormente se aceptaba que el buen bacteriólogo clínico era aquel capaz
de identificar hasta especie todas las bacterias presentes en determinado cultivo.
Hoy en día este concepto ha cambiado y el buen bacteriólogo clínico es quien
discrimina efectivamente los microorganismos potencialmente patógenos de la
microbiota normal, los identifica total o presuntivamente lo más pronto posible y
emite un informe claro y correcto. Por este motivo, en el presente manual práctico
se hace énfasis en los criterios actualizados de interpretación.
El estudio de la Historia de la Humanidad, permite comprender la realidad
presente y proyectarse mejor hacia el futuro. En el caso de la bacteriología médica,
los inspiradores escritos, sus retratos y el ejemplo de tres pioneros de esta ciencia,
que aparecen al principio del libro, van dedicados al amable lector.

16
Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopio
representó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, no
sólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”,
sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa
entretención para científicos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de
las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la
bacteriología, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los
descubrimientos básicos que han permitido el desarrollo de la bacteriología médica
moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron múltiples, por lo que es muy
difícil sumarizarlos. Conviene recordar que el increíble avance de la bacteriología
en las postrimerías del siglo XX, y el que vivirán nuestros descendientes en el
próximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discípulos.
La Primera Edición de este MANUAL PRÁCTICO DE BACTERIOLOGÍA
MÉDICA, fue patrocinada por la compañía farmacéutica Pfizer, en septiembre de
1996. Esta edición se agotó rápidamente entre profesionales y estudiantes de
laboratorio clínico en Centroamérica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado
como referencia del trabajo rutinario en bacteriología clínica en múltiples
laboratorios y es libro de texto en varias universidades.
En 1999, el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social de Guatemala, ha
reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edición, la cual llegará a todos
los profesionales y técnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clínicos, ahora
como norma obligatoria a observar en bacteriología médica. El autor ha plasmado
en el presente libro, treinta años de experiencia en la materia, de manera simplista
y expresando lo mínimo que es necesario efectuar en los laboratorios clínicos de
Mesoamérica.
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999

17
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides.
Durante 50 años, informó periódicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas
dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental,
dibujó y reportó por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.

18
Carta a sus hermanas:
“La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaña del éxito.
Estas tres cosas, trabajo, voluntad y éxito, llenan la existencia
humana.
La voluntad abre la puerta al éxito, ambos brillantes y felices, el
trabajo pasa estas puertas y al final del viaje el éxito corona nuestros
esfuerzos”.
LOUIS PASTEUR, 1841 (Besançon, Francia)

19
Roberto Koch fue un médico rural alemán, nacido en 1843. Sus aportes a la
bacteriología médica fueron enormes. Primero cultivó la bacteria causante del ántrax en
humor vítreo de buey. Luego desarrolló gradualmente técnicas bacteriológicas fundamentales,
como el uso del agar extraído de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y
así poder observar colonias.
Con su discípulo Paul Ehrlich, aplicó los colorantes derivados de la anilina a la
coloración de microorganismos. Descubrió las bacterias causantes de el cólera, la tubercu-
losis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueño.

21
CAPÍTULO 1
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
La microbiología es la ciencia que estudia a los seres vivos microscópicos, es
decir que sólo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeños orga-
nismos microscópicos son llamados vulgarmente “microbios”, pero la palabra co-
rrecta para designarlos es microorganismos. La microbiología se aplica no sólo a la
ciencia médica, sino también a la veterinaria, a la agronomía y a la industria, por lo
que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.
Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican según su
estructura, manera de reproducirse y muchas otras características. Los grupos más
importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los
hongos. Los virus son los microorganismos más pequeños, se reproducen única-
mente dentro de las células y tienen forma similar a cristales. La palabra
microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre sí.
La microbiología se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo
taxonómico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos,
pero su estudio se basa en estructuras microscópicas.
Bacteriología (bacterias)
Micología (hongos)
Virología (virus)
Parasitología
Protozoología (protozoos)
Helmintología (helmintos)
Entomología (insectos, ácaros, otros)
La mayoría de los microorganismos no son capaces de causar enfermedades
en el hombre y se les llama por esta razón “saprófitos” o “saprobios”. Sin embargo,
algunos causan enfermedades en el hombre, llamadas infecciones. Cuando un
microorganismo es capaz de producir infección, se dice que es “patógeno”; la
“virulencia” es la cuantificación de la patogenicidad.
La inmunología nació ligada a la microbiología como el estudio de los meca-
nismos de defensa contra los microorganismos. Ahora su campo de acción se ha
extendido mucho y es una ciencia biológica independiente.
Microbiología

22
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las
bacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos que
vemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente don-
de hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto de
bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice
que forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel con-
junto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin
causarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debe
utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, no
infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama
“oportunistas”.
EL NOMBRE CORRECTO DE LOS MICROORGANISMOS:
Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema
binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran
grupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundo
nombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos los
nombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, por
esta razón:
a) Siempre se subrayan discontinuamente o se escriben con letra cursiva
b) Nunca se tildan
Ejemplos:
Staphylococcus aureus (bacteria)
Escherichia coli (bacteria)
Streptococcus pyogenes (bacteria)
Pseudomonas aeruginosa (bacteria)
Entamoeba histolytica (parásito, protozoo)
Giardia lamblia (parásito, protozoo)
Ascaris lumbricoides (parásito, helminto)
Trichophyton rubrum (hongo)
Microsporum canis (hongo)
Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso co-
mún o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
Los nombres vulgares más conocidos son los siguientes:

23
Nombre correcto: Nombre vulgar:
Escherichia coli colibacilo (bacteria)
Streptococcus pneumoniae neumococo (bacteria)
Neisseria gonorrhoeae gonococo (bacteria)
Enterobius vermicularis oxiuro (parásito, helminto)
Trichuris trichiura tricocéfalo (parásito, helminto)
Entamoeba histolytica ameba histolítica (parásito, protozoo)
Entamoeba coli ameba coli (parásito, protozoo)
Hymenolepis nana tenia nana (parásito, helminto)
Candida albicans monilia (hongo)
Si se desea hacer referencia a todas las especies de un género se usa la abre-
viatura para especies: “spp.” y no se subraya. Si sólo se refiere a una especie no
determinada de un género dado, se usa: “sp.” abreviatura de especie.
Ejemplos:
Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen.
Shigella sp. = una especie no determinada del género Shigella.
RECOMENDACIONES DE BIOSEGURIDAD PARA EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Dr. Miguel F. Torres y Dra. Margarita Paz de Ramírez
Laboratorio Microbiológico de Referencia (LAMIR) y Depto. de Citohistología.
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos.
Tomado de:

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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
11. Lavarse las manos frecuentemente
12. Usar gabacha
13. Usar guantes de caucho en buen estado cuando es necesario
14. Usar mascarilla cuando es necesario
15. Rotular adecuadamente todo el material y los reactivos
16. No comer en el área de trabajo
17. No almacenar comida en el área de trabajo
18. No fumar
19. Usar adecuadamente los desinfectantes
10. Usar detergentes y desinfectantes adecuados para cada tipo de material
11. Clasificar los desechos
12. Descontaminar el material biológico antes de descartarlo
13. Esterilizar o incinerar el material contaminado
14. Destruir el material descartable o no reusable
15. No utilizar materiales inflamables cerca del mechero
16. Conocer el uso y manejo de los extinguidores
17. Neutralizar los desechos químicos
18. Descontaminar el material radioactivo antes de su descarte
Equipo necesario:
1. Campana bacteriológica
2. Campana de flujo laminar cuando es necesario
3. Lámpara de pie
4. Mechero o incinerador
5. Incubadora bacteriológica
6. Autoclave
7. Horno esterilizador
8. Agitador de tubos
9. Centrífuga

25
Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación:
1. Extinguidores en lugares accesibles
2. Basureros cerrados
3. Lava-ojos
4. Extractor de vapores
5. Incinerador
6. Recipientes con desinfectantes y descontaminantes
7. Campana de flujo laminar y/o de bioseguridad
8. Equipo adecuado para descarte de material contaminado y de solventes
9. Recipientes plomados
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN O DESINFECCIÓN
Método Concentración o nivel Actividad
ESTERILIZACIÓN:
Calor Húmedo (autoclave) 121° C a diferentes intervalos de tiempo
Seco (horno) 171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas;
121° C por 16 horas
Gas Oxido de etileno 450-500 mg/litro a 55-60° C
Líquido Glutaraldehido variable
Peróxido de hidrógeno 6-30%
Formaldehido 6-8%
Dióxido de cloro variable
DESINFECCIÓN
Calor Húmedo
(incluye pasteurización) 75-100° C alta
Líquido glutaraldehido variable alta-media
peróxido de hidrógeno 3-6% alta-media
formaldehido 1-8% alta-media
compuestos clorinados 500-5,000 mg de cloro libre/litro intermedia
alcoholes (etanol, isopropílico) 70% intermedia
compuestos fenólicos 0.5-3% media-baja
compuestos yodados 0.1-0.2% media-baja
ANTISEPSIA
alcoholes 70%
yodóforos 1-2 mg de yodo libre/litro
hexaclorofeno 1-3%

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DESINFECCIÓN:
Proceso generalmente menos letal que la esterilización.
Elimina virtualmente todos los microorganismos patógenos pero no ne-
cesariamente todas las formas microbianas (esporas).
El procedimiento de desinfección carece del margen de seguridad que
se logra por los procedimientos de esterilización.
Factores:
1. Naturaleza y número de microorganismos contaminantes.
2. El tipo y configuración del material a desinfectar.
3. Tipo y concentración del germicida químico usado.
4. Tiempo y temperatura de exposición.
DESCONTAMINACIÓN:
Es un término usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a
una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este término abarca
desde lavado con agua y jabón hasta la desinfección o esterilización.
ANTISEPSIA:
Un antiséptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido
vivo con el propósito de inhibir o destruir microorganismos.
USO EFECTIVO DE ANTISÉPTICOS, DESINFECTANTES Y
PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN
Factores para la elección de desinfectantes y procedimientos de
esterilización.
1. Grado de muerte microbiana requerida.
2. Naturaleza del material o la superficie a ser tratada.
3. Costo y disponibilidad de los agentes germicidas.

27
ESTERILIZACIÓN:
Uso de procedimiento físico o químico para destruir toda la vida
microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas
altamente resistentes.
Tipos de esterilización:
Calor húmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de óxido de etileno
Esterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS A GERMICIDAS QUIMICOS
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
VIRUS PEQUEÑOS O NO LIPÍDICOS
Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
VIRUS DE MEDIANO TAMAÑO O LIPÍDICOS
Herpes simplex - Cytomegalovirus
Virus sincitial respiratorio
Virus de Hepatitis B
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(*) En orden descendente de resistencia
RESISTENCIA DE MICROORGANISMOS A GERMICIDAS QUÍMICOS (*)

29
CAPÍTULO 2
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy sim-
ple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción.
Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
La reproducción de las bacterias ocurre por simple partición de una célula en
dos células hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparación con la repro-
ducción de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas
que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser móviles o inmóviles.
Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos
que agitan en forma de látigo.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condicio-
nes de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que re-
quieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
según cada medio de cultivo.
Las bacterias se clasifican en base a diversas características. Según sus reque-
rimientos de oxígeno, las bacterias pueden ser:
a. Aerobias: Crecen bien en la atmósfera que respiramos, es decir en pre-
sencia de oxígeno, el cual requieren para su sobrevivencia.
b. Microaerofílicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxí-
geno. Para disminuir la concentración de oxígeno en el microambiente
en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos
en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un
5 al 10 % de anhídrido carbónico (CO2).
c. Anaerobias: Son incapaces de crecer en presencia de oxígeno, el cual les
es sumamente tóxico e impide su crecimiento.

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d. Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen la
facultad de también crecer en aerobiosis.
Según la temperatura óptima de crecimiento, las bacterias pueden ser:
a. Mesófilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la tempe-
ratura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este
grupo se incluyen todas las bacterias patógenas, por esta razón la tem-
peratura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras
bacteriológicas es de 36 grados centígrados.
b. Termófilas: Crecen a altas temperaturas (calor).
c. Criófilas: Crecen a bajas temperaturas (frío).
d. Psicrotróficas: Crecen a temperaturas de refrigeración.
Según su forma, las bacterias se clasifican en tres grupos:
a. Cocos: Son bacterias de forma esférica o redondeada. Ejemplo, Foto A
página siguiente: Microfotografía de Staphylococcus aureus en división.
b. Bacilos: Son bacterias alargadas, de forma similar a una salchicha o
bastoncillo. Ejemplo, Foto B página siguiente: bacilos en división.
c. Espiroquetas: Son bacterias alargadas y retorcidas en forma de resorte o
espiral. Ejemplo, Foto C página siguiente: Microfotografía de bacterias
de la microbiota oral; Treponema sp. (espiroquetas), bacilos y cocos.
Dependiendo de su forma de agrupación los cocos pueden clasificarse así:
a. Diplococos: Agrupación de bacterias esféricas en grupos de dos, o
parejas (ejemplos: Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae).
b. En cadenas. Ejemplo: estreptococos (Streptococcus spp.)
c. En racimos. Ejemplo: estafilococos (Staphylococcus spp.)
Este tipo de clasificación no se aplica a los bacilos ni a las espiroquetas.

32
CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA
Para poder trabajar bacteriología médica, se requiere del siguiente material y
equipo básico, según se ilustra en la figura 1 (pág. 34).
1. Una superficie lisa del alto de un escritorio de oficina (76 a 78 cm de alto),
material liso, blanco o negro mate, lavable, tipo fórmica. El lugar de trabajo debe
estar lejos de ventanas que permitan corrientes de aire, lavatrastos o basureros.
Contar con una silla cómoda, giratoria, con respaldo, y ajustable al alto adecuado.
2. Un mechero quemador de gas propano tipo Meker, Bunsen o “Touch-O-
Matic”. Ajustar la entrada de aire a manera de obtener una llama azul y translúcida
(no amarilla). Debe tenerse presente que solamente es estéril el aire que está un pie
(30 cm) alrededor del mechero encendido, por lo que se debe trabajar lo más cerca
posible. Situarlo al frente ligeramente hacia la derecha. También puede usarse
incinerador.
3. Una campana bacteriológica de madera o fibra de vidrio para aislar el área
de trabajo, la cual debe desinfectarse diariamente antes de iniciar el trabajo. Frotar-
la por dentro con formol al 10 por ciento, fenol al 1 por ciento, o por lo menos con
alcohol al 70 por ciento. La campana no es indispensable; puede trabajarse sin ella,
si se hace con cuidado, es decir sobre una superficie desinfectada y cerca del me-
chero.
4. Un autoclave para esterilizar con calor húmedo a presión, material y me-
dios de cultivo, “matar” material contaminado y cultivos (esterilizar previo des-
carte o limpieza). Puede ser pequeño, tipo olla de presión. Calibrarlo a manera de
autoclavear siempre por 15-20 minutos a 121o C y 15 libras de presión por pulga-
da cuadrada.
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con las
siguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en la
figura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de
platino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).
Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en
“L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y lim-
piarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizan-
do el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.
Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que
ya está fría.

33
6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”;
colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuerte-
mente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directamente a los ojos.
7. Microscopio óptico binocular de buena calidad, con condensador de cam-
po oscuro.
8. Lupa o de preferencia microscopio estereoscópico para observar bien
las colonias.
9. Incubadora bacteriológica que debe mantenerse constantemente a 36o C
exactos (no a 37o C ó a 35o C). Debe mantenerse siempre cerrada y pegarle una hoja
de control diario de temperatura.
10. Balanza para pesar medios de cultivo.
11. Hornilla eléctrica de dos discos y temperatura graduable.
12. Refrigerador con congelador.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tien-
das, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras
(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres
microaerofílicos.
14. Jarro Gas-Pak (BBL) o similar, sobres generadores de anaerobiosis,
catalizadores e indicadores para incubar cultivos anaerobios.
15. Agitador de tubos tipo “vortex”.
16. Colorantes, soluciones y medios de cultivo según se describe en cada
capítulo.
17. Gradillas para colocar tubos con medios de cultivo o muestras.

34
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍAFig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA

35
LA COLORACIÓN DE GRAM
Las bacterias son microorganismos incoloros, por
este motivo deben teñirse para poder observarlos con ayu-
da del microscopio. Por esta razón, a continuación se des-
cribe la técnica más importante que debe usarse para di-
ferenciar bacterias: la coloración de Gram. Se recomienda
usar la modificación de Hucker según Bartholomew, de
acuerdo con la bibliografía que aparece al final de este
manual.
a) Preparación de frotes:
La coloración de Gram puede aplicarse a frotes extendidos sobre portaobjetos
de vidrio (también llamados frotis) de todo tipo de muestras clínicas, o a frotes de
suspensiones de cultivos. Frotar la muestra suavemente y sin revolver mucho so-
bre la superficie de un portaobjetos limpio y seco. Esperar que seque sobre una
superficie lisa o flamear muy levemente. Rotular adecuadamente con crayón graso
por detrás de la lámina. Una vez que el frote ya está seco, fijar pasando levemente
por la llama del mechero dos veces, sin que se caliente excesivamente (que no que-
me al ponerlo sobre la piel del dorso de la mano). Dejar que el frote se enfríe antes
de colorearlo, pues si se colorea caliente precipitan los colorantes.
Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frote debe
hemolizarse con agua. Proceder así: dejarlo secar y fijar con calor, cubrir comple-
tamente con agua del chorro un minuto, y luego proceder a colorearlo con Gram.
Este tratamiento permite destruir los eritrocitos y poder observar las bacterias.
b) Técnica de la coloración de Gram:
1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo sua-
vemente con agua corriente, escurrir bien.
3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 ó 5 segundos,
hasta que ya no salga más cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve
en frotes delgados y más prolongado en frotes gruesos.
Hans Gram

36
4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavemente
con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a
36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire
obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
5. Examinar en el microscopio con el lente de inmersión, con aceite especial
de viscosidad adecuada.
c) Resultados:
Bacterias gram-positivo: morado-azul obscuro.
Bacterias gram-negativo: rojo.
La diferencia de coloraciones se debe al grosor de la pared celular, que es más
“delgada” en las bacterias gram-negativo. Esta coloración sólo es válida para cocos
y casi todos los bacilos (excepto micobacterias), no es válida para espiroquetas. Si
el frote es de material clínico, es decir de muestras de pacientes, debe quedar rojo a
simple vista después de colorearlo. Si hay leucocitos presentes en la muestra éstos
deben ser rojos (gram-negativo) y si hay levaduras deben verse azul-morado (gram-
negativo), lo que sirve para evaluar si el frote se decoloró adecuadamente.
d) Informe:
El reporte correcto de una bacterioscopía (observación de bacterias) con Gram
debe contener los siguientes elementos y en este orden:
1. Identificación del paciente (apellidos, nombres, número de registro o
afiliación, servicio y fecha).
2. Título que indique el tipo de muestra examinada y el sitio anatómico de
donde proviene. Por ejemplo: Secreción de úlcera en miembro inferior derecho.
Coloración de Gram:
3. Mencionar primero las bacterias observadas. Empezar por la clase más
freuente en la muestra, indicar agrupación y cantidad (muy escaso, escaso, regular
cantidad, abundante o muy abundante ó +, ++, +++, ++++). Por ejemplo: cocos
gram-positivo en cadenas cortas: abundantes; bacilos gram-negativo: regular can-
tidad, diplococos gram-negativo: muy escasos. Usar siempre positivo y negativo

37
en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en
plural.
4. Luego es muy importante para el médico saber si hay glóbulos blancos en
la muestra, su clase y cantidad. Por ejemplo: Leucocitos polimorfonucleares: abun-
dantes. Este dato indica que hay verdadera infección y que la muestra era purulenta.
Si se observan bacterias dentro del citoplasma de los leucocitos, mencionar
“intracelular” en el reporte, lo que es de especial interés clínico en los frotes de
secreciones uretrales masculinas. La presencia de linfocitos indica infección cróni-
ca o viral (no purulenta).
5. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras o micelio de hongos
(gram-positivo); de células epiteliales, de especial interés en frotes de esputo (se
miran gram-negativo aplanadas con citoplasma grande, transparente y núcleo
pequeño redondo u ovalado). Aunque no es crucial, indicar la presencia de fibrina,
que se mira en forma de hebras gram-negativo alargadas e irregulares.
6. Cuando es necesario, con experiencia y cautela podrán incluirse al final
comentarios sobre la calidad de la muestra, indicar que la morfología observada es
compatible con una especie de bacterias o recomendaciones de tratamiento (con
mucha prudencia).
Reactivos para la coloración de Gram:
(Modificación de Hucker según Bartholomew)
1. CRISTAL VIOLETA:
Solución “A”:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etílico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solución “B”:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración.
2. LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio.............................................................. 2 gramos

38
Moler en un mortero el yodo y el yoduro. Agregar el agua destilada (en
probeta) poco a poco. Continuar moliendo para disolver completamente; agregar
el agua a manera de ir lavando el mortero, hacia una botella de vidrio oscuro
(ámbar). Sólo dura una semana.
3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico
al 95 %.
4. SAFRANINA:
Solución stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada).................................................... 2.5 gramos
Alcohol etílico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solución de trabajo:
Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así:
Solución stock .................................................................... 10 ml
Solución anticorrosiva para desinfectar bisturíes:
Formaldehido (Formol) .................................................... 8 %
Alcohol etílico .................................................................... 60-70 %
Nitrito de sodio .................................................................. 0.2 %
Para preparar un litro:
En un balón aforado de 1,000 ml (1 litro), colocar 2 gramos de nitrito de sodio,
luego agregar 700 ml de etanol absoluto y 200 ml de formaldehido al 40 %. Luego
aforar con 100 ml de agua destilada.
Los bisturíes con sus mangos deben mantenerse constantemente sumergidos
en esta solución, dentro de un recipiente de acero inoxidable con tapadera.

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Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USOFig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:
1. Asa en argolla o anillo, no calibrada. Generalmente de almbre de
nichrome. Sirve para siembra por estrías e inoculaciones en general.
2. Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificación, o subcultivo.
3. Asa de platino en anillo. Calibrada para tomar 0.001 ml, para
urocultivo.
4. Asa espatulada, para manipular colonias duras y tomar muestras.
ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:ASAS PARA MICOLOGÍA Y MICOBACTERIAS:
5. Asa de almbre grueso en "L", para purificar colonias de hongos y
procedimientos especiales.
6. Aguja de disección con punta aguda, para purificar colonias pequeñas
y distribuir las preparaciones de hongos en fresco.

40
4. Flamear segunda vez, al
terminar la segunda estría.
Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOSFig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
SÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍASSÓLIDOS POR ESTRÍAS
5. Tercera estría. Debe tocar
ligeramente la segunda estría,
y cubrir toda la superficie libre
del medio sin tocar al final el
inóculo original.
1. Con asa o hisopo estéril,
estriar inóculo original de
aproximadamente 0.5 cm,
en el borde de la caja de Petri.
2. Flamear primera vez al
terminar el inóculo original.
3. Segunda estría cruzada,
debe tocar ligeramente
el inóculo original.

41
CAPÍTULO 3
COPROCULTIVO
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas,
es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
Las principales especies enteropatógenas que se buscan en el coprocultivo,
en orden de importancia en Guatemala son:
- Shigella flexneri (Shigella grupo B)
- Salmonella typhi (agente de fiebre tifoidea)
- Shigella sonnei (Shigella grupo D)
- Salmonella enteritidis
- Shigella dysenteriae tipo 1 (Shigella A-1 o “Bacilo de Shiga”,
causa severa disentería epidémica)
- Shigella boydii (Shigella grupo C, rara en Guatemala)
- Salmonella choleraesuis
- Arizona hinshawii (rara)
- Edwardsiella tarda (muy rara)
- Yersinia enterocolitica (muy rara)
Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el in-
testino humano, por lo que se conocen comúnmente como “enterobacterias”. For-
man aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacte-
rias anaerobias. Por esta razón es muy importante que el laboratorio esté en capaci-
dad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatógenos de la lista
anterior.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
- heces frescas (la mejor muestra)
- hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

42
- material obtenido por proctoscopía
- biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir el
hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fácil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose los
glúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colecta-
das y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pier-
dan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la mues-
tra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un me-
dio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propó-
sito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
Glicerol salino bufferado
Para transporte de coprocultivos
Cloruro de sodio......................................................................4.2 gramos
Fosfato dipotásico (anhidro)..................................................3.1 gramos
Fosfato monopotásico (anhidro) ...........................................1.0 gramos
Rojo fenol..................................................................................0.003 gramos
Agua destilada.........................................................................700 ml
Glicerina ...................................................................................300 ml

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El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca y
luego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no
deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que
su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considera-
blemente su utilidad clínica.
La coloración de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de signi-
ficado clínico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada
por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en
caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras
(gram-positivo).
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses.
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (con-
tienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produ-
ce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma
de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfhídrico.
El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes,
de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).
En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente
el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y
proctoscopía.
El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en
estos tres medios que contienen el azúcar lactosa (como agente diferencial) es el
siguiente:

44
Efectúe el coprocultivo así:
1- Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-
tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2- Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).
3- Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,
incubar a 36°C por 18 a 24 horas, en la incubadora, con esa temperatura con-
trolada diariamente (ver figura 4, pág. 45).
COLOR
ANTES DE
INOCULAR
rosado
rosado
ligeramente
amarillento
verde claro
rojo
MEDIO
MacConkey
SS
Hektoen
XLD
COLONIAS
CON ÁCIDO
SULFHÍDRICO
no cambian
negro
negro
negro
COLONIAS
LACTOSA-
NEGATIVO
incoloras
incoloras
verde
azuladas
rojas
COLONIAS
LACTOSA-
POSITIVO
rojo (rosado)
rojo
anaranjado-
salmón
amarillas

45
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVOFig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras:
I N O C U L A R
Rutina
HektoenXLD ó SSMacConkey
Diseminar por estrías, incubar a 36o
C
Heces frescas
Medios:
Seleccionar colonias según el caso,
trasladar a TSI/LIA/urea
Material de
proctoscopía,
biospia intestinal
Hisopo rectal Sedimento de
enema salino
Opcional

46
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1- Después de incubadas, observar cuidadosamente las dos o tres cajas de cada
paciente simultáneamente. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumi-
ne las cajas por detrás y observarlas utilizando una lupa corriente. Marcar
por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sos-
pechosas así: Primero escoger en el MacConkey una colonia por cada tipo de
colonias lactosa-negativo (incoloras), empezando por las colonias más peque-
ñas (más o menos 1 mm de diámetro). Si el paciente es un niño menor de un
año, se marcará adicionalmente en el MacConkey una colonia típica de
Escherichia coli (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa), de la parte
de la caja donde las colonias están más separadas y ponerle con crayón graso
por detrás “C” al lado. Examinar el SS de la misma forma. En este medio el
crecimiento será más escaso pues es más inhibidor. Marcar por detrás una
colonia por cada tipo de colonias lactosa-negativo (incoloras) empezando por
las más pequeñas, e incluyendo una colonia con centro negro (ácido
sulfhídrico) si las hay. Si se inoculó Hektoen, marcar una colonia pequeña
verde azulado (lactosa-negativo).
Fig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSASFig. 5 OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Marcar colonias
sospechosas por
detrás de la caja de Petri
CRAYÓN
GRASO

47
2- El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer los
sub-cultivos con asa en aguja o recta así:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio
estereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y
frías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose en
el borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha
(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamen-
te hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficie
de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)
con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y
luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exacta-
mente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y
luego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear
y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres
veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una
estría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colo-
nia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proce-
da así:
Tome la caja ya marcada de MacConkey, XLD o SS Hektoen entre los dedos
pulgar, índice y medio de la mano izquierda (retraiga los dedos anular y me-
ñique). Colóquela verticalmente a manera que la luz pase por detrás a través
de la caja, tome su asa recta agarrada como un lápiz con la mano derecha,
apoye firmemente los dedos anular y meñique en la palma de su mano iz-
quierda que sostiene la caja.Acerque cuidadosamente el asa y toque con mucho
cuidado la colonia seleccionada sin pincharla ni tocar otras colonias cercanas.
(ver figura 6, pág. 48). Inocule simultáneamente una pareja de TSI/LIAy urea
agar según ya se describió. Estos tres medios en tubo deben tener 2.5 cm de
fondo y 3.8 cm de superficie inclinada para que funcionen correctamente,
Rotular ambos tubos y colocarlos por pareja en gradillas. Si el MacConkey
sólo presenta colonias lactosa-positivo (rojas) descártelo. Lo mismo se hará
con el Hektoen que sólo presenta colonias lactosa-positivo (anaranjado sal-
món), o el XLD que sólo presenta colonias amarillas. Reincube la caja de SS
otras 24 horas a temperatura ambiente para investigar la presencia de Yersinia
enterocolitica.

48
Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALESFig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3- Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli,
niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
4- Examine las reacciones coloreadas en el TSI/LIA simultáneamente; tome
ambos tubos juntos hacia abajo con la mano derecha y obsérvelos contra la
luz. Interprete resultados de acuerdo a la siguiente tabla.

49
Reacción ya
incubada
Medio sin
inocular
TSI
(rojo)
LIA
(morado)
ácido
sulfhídrico
(h) (-a+++)
negro
negro
A=ácido
Amarillo
Amarillo
K=alcalino
rojo
violeta
R=rojo
no
aplicable
Superficie
roja
N=neutro
no
aplicable
antre
amarillo
y morado
Gas (g)
(-a+++)
burbujas
o
rupturas
burbujas
o
rupturas
Urea de Christensen: (amarillo ligeramente anaranjado), positivo = rosado fuerte;
negativo = no hay cambio
Bacteria
Shigella spp.
Salmonella sp.
Yersinia enterocolitica
TSI
K/A,g-,h-
K/A,g+,h++
A/A,g-,h-
LIA
K/A (N),g-,h-
K/K,g+,h+
A (K)/A,g-,h-
UREA
-
-
+
Reacción ya
incubada
Medio sin
inocular
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, ácido sulfhídrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:
TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o
TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, h-
Las reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy útiles para la identificación
de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla
actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioquímicas en general.
Reacciones a las cuales debe ponerse especial atención:

50
5- Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de
niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia
coli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. de
Maryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). El
informe final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógena
del grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prue-
ba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y produc-
toras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la
aglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenos
en los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya o
caldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prue-
ba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, des-
crito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella o
Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe
redactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli
enteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridas
para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y
aceleran el trabajo.

51
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA
Enterobacteria
Escherichia coli
Shigella spp.*
Salmonella typhi*
Salmonella spp.*
Arizona hinshawii*
Yersinia enterocolitica*
Citrobacter sp.
Edwarsiella tarda
Klebsiella sp.
Enterobacter sp.
Serratia sp.
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Morganella morganii
(antes Proteus morganii)
Providencia sp.
LIA
K/KóN, g-ó+, h-
K/A, g-, h-
K/K, g-, h-(+)
K/KóN, g-, h+ (-)
K/KóN, g-, h+ (-)
A(K)/A, g-, h-
K/A, g-ó+, h+ó-
K/K, g-ó+, h+
KóN/KóN, g+ó, h-
KóN/KóN, g+(-), h-
KóN/KóN, g-, h-
R/A, g-, h-(+)
R/A, g-, h-(+)
KóR/A, g-, h-
R/A, g-, h-
UREA
-
-
-
-
-
+
+ ó -
-
+
-(+)
- ó +
+
+
+
-
TSI
A(K)/A, g+ (-), h-
K/A, g-, h-
K/A, g-, h+ (poco)
K/A, g-, h+++(-)
K(A)/A, g+, h+++
A/A, g-, h-
K(A)/A, g+, h+++(-)
K/A, g+, h+++
(indol +)
A/A, g++, h-
(mucosidad ++)
A/A, g++, h-
KóA/A, g-, h-
A(K)/A, g+, h+++
K(A)/A, g+, h+++
K/A, g-(+), h-
K/A, g+ ó-, h
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
paréntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarse
constantemente.
+
-

52
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA:
TSI y LIA = K/A,g-,h-
Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es caracte-
rístico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la más
frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni
ácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) de
la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-
miento del TSI sospechoso, o del LIA así:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón graso
por detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos
de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA
con reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la mis-
ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospe-
chosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.
Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro
de un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri).Aglutine
tomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA)
con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalo
pequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera
de obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente después
de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición de
aglutinación franca y obvia.
Sólo tomar en cuenta aglutinaciones que ocurren antes de 1 minuto después
de mezclar. Si aglutina reportar Shigella B en el libro de trabajo. Si no aglutina siga
aglutinando pero siempre en este orden para ahorrarse trabajo y anti-sueros, que
son muy caros:
1- Shigella flexneri, grupo B - La más frecuente en Guatemala
2- Shigella sonnei, grupo D - La segunda más frecuente en
Guatemala
3- Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidémica, debe
darse alerta al médico.
4- Shigella boydii, grupo C - Muy rara vez se aisla en el país.

53
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA:
La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines
prácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación an-
tigua simplificada así:
- Salmonella typhi: causa fiebre tifoidea con diseminación genera-
lizada de la bacteria (puede aislarse de heces,
médula ósea, sangre, orina, etc).
- Salmonella enteritidis: causa infección intestinal y puede diseminarse
a la sangre.
- Salmonella choleraesuis: rara, causa infección en animales y rara vez
en el hombre.
Salmonella typhi presenta en TSI dos características muy importantes para
su identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y
aglutinación:
1- No produce gas.
2- Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,
a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el
inclinado).
3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
4- Es citrato-negativo.
5- Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.
El agar inclinado de citrato de Simmons es un medio verde que se prepara
inclinado con las mismas medidas del TSI/LIA. Debe inocularse con una asada del
crecimiento de los tubos TSI o LIA sospechosos de Salmonella, luego se incuba a
36°C de 18 a 24 horas y los cambios de color se interpretan así:
verde = negativo
azul = positivo

54
Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
(+) = positivo lento, más de 3 días de incubación.
En resumen, para diferenciar e identificar Salmonella siga estos pasos:
1- Identifique las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y
Salmonella spp. según la tabla. Es muy importante notar la reacción toda
morado-violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo
cual es típico del género Salmonella. Anote la cantidad de ácido sulfhídrico
en el TSI.
2- Ordene sus TSI/LIA/urea en la gradilla de tubos para aglutinación y, según
ya se explicó, aglutine todos los TSI con una gota de antisuero comercial
polivalente de Salmonella.
3- Si la reacción es positiva, inocule un tubo de citrato de Simmons e incube,
simultáneamente inocule la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4- Si el laboratorio cuenta con el set de antisueros de grupo de Salmonella, aglutine
sólo los tubos con aglutinación franca en el antisuero polivalente a Salmonella
en los antisueros de grupo. Algunos grupos frecuentes en Guatemala son B,
G, y C1. Salmonella typhi pertenece al grupo D, por lo que aglutinación positi-
va a este grupo, además de las otras pruebas sencillas confirma esta especie.
Si se investiga el grupo, éste debe informarse, por ejemplo:
Se aisló Salmonella enteritidis del grupo B.
Idealmente el laboratorio podrá confirmar con más seguridad y mayor
Ácido sulhídrico
(TSI)
+ débil
+++
+ (sólo 60%)
Gas
(TSI)
-
+
+
Citrato
-
+
(+)
Prueba
Especie
Salmonella typhi
Salmonella enteritidis

55
trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de múltiples pruebas
bioquímicas miniaturizadas, por ejemplo API, según las condiciones de trabajo.
INFORME:
El informe del coprocultivo debe constar de 3 partes:
1- Título: coprocultivo, cultivo de biopsia colónica, etc. De preferencia debe es-
cribirse con mayúsculas y centrado.
2- Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en cla-
ve, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deberá
transcribir con el texto correcto, según la próxima tabla. Incluir el grupo de
Salmonella si se efectuó. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo,
sólo la especie, par ejemplo: Se aisló Shigella flexneri.
3- Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibióticos de utili-
dad clínica para tratar infecciones por enterobacterias.
Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:
S/A = susceptibilidad antimicrobiana.
RESULTADO
Coprocultivo negativo
de adulto
Coprocultivo negativo de
niño menor de un año
Coprocultivo positivo
TEXTO (Secretaria)
No se aislan enteropatógenos, desarrollan
bacterias de la microbiota normal
Negativo para Shigella, Salmonella y
Escherichia coli enteropatógena
Se aisló Shigella dysenteriae. S/A
Se aisló Shigella flexneri. S/A
Se aisló Shigella boydii. S/A
Se aisló Shigella sonnei. S/A
Se aisló Salmonella typhi. S/A
Se aisló Salmonella enteritidis del grupo ____. S/A
Se aisló Salmonella choleraesuis. S/A
Se aisló Arizona hinshawii. S/A
Se aisló Yersinia enterocolitica. S/A
CLAVE
en libro de trabajo
(técnico)
NP
N-SSE
Shigella A
Shigella B
Shigella C
Shigella D
Salmonella typhi
Salmonella grupo ____
Arizona
Yersinia

56
PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS
(ENTEROTEST)
PARA COLECCIÓN DE MUESTRAS DUODENALES
El objetivo de este procedimiento es obtener una muestra de la bilis del pa-
ciente para cultivar específicamente Salmonella typhi; también puede usarse para
examinar en fresco su contenido para trofozoitos de Giardia lamblia, huevos de
Clonorchis sinensis, o larvas de Strongyloides stercoralis. El pH de la parte distal de la
cuerda debe ser alcalino, si llegó al duodeno. El procedimiento consiste en dar al
paciente (en ayunas) una cuerda de nylon absorbente (de 90 a 140 cm para adulto y
67 cm para niños) dentro de una cápsula, la cual debe tragarse con agua. Un extre-
mo de la cuerda se pega por fuera a la cara del paciente con cinta adhesiva y el otro
distal debe llegar hasta el duodeno, donde permanece cuatro horas para empapar-
se de bilis. El paciente sólo debe beber agua, mínimo un vaso por hora.
Procedimiento:
1- El médico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una trac-
ción rápida pero suave. Luego cortar con tijeras estériles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga asépticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
2- El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra para el aislamiento de
Salmonella. Agitar e incubar 24 horas a 36° C.
3- Después de la incubación, inocular por estrías una asada del caldo tetra-
tionato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aeróbicamente a
36° C.
4- Trasladar las colonias lactosa-negativo (incoloras) a TSI, LIA, urea y citrato,
incubar 18 a 24 horas a 36° C.
5- Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antígeno Vi y gru-
po D, según ya se explicó.
Medio de cultivo:
Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante según
las instrucciones en el frasco de la base en polvo, así:

57
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, ca-
lentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45° C y luego agregar: 10 ml de
solución de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solución acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estériles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estériles con tapón de rosca. El medio debe quedar verde con pre-
cipitado blanco.
LA EPIDEMIOLOGÍA Y ETIOLOGÍA DE LA DIARREA
Adaptado de:
World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.
Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology
of Diarrhea. Geneva.
Usualmente se define a la diarrea como la eliminación de tres o más
evacuaciones intestinales líquidas o blandas en un período de 24 horas.
Existen tres tipos de diarrea:
Diarrea aguda, líquida
Disentería
Diarrea persistente
El problema que representan las enfermedades diarréicas
La diarrea es una de las causas principales de enfermedad y muerte en
los niños menores de 5 años de los países en desarrollo, en donde ocurren
aproximadamente 1.3 mil millones de episodios y 3.2 millones de muertes al
año por diarrea. En promedio, estos niños padecen 3.3 episodios de diarrea
por año, pero en algunas áreas, el promedio pasa de nueve episodios por año.
Es común que donde los episodios son frecuentes, los niños pasen el 15% de
sus vidas con diarrea. Dentro de este grupo de edad, los niños menores de
dos años, son los que sufren la mayor morbilidad y mortalidad. Se estima que
aproximadamente 80-90% de las muertes por diarrea ocurre en niños meno-
res de dos años. La causa principal de muertes por diarrea aguda es la
deshidratación, la cual resulta por la pérdida de líquidos y electrolitos. Otras
causas importantes de muerte son disentería, desnutrición y otras infecciones
serias, como neumonía.

58
Disentería
Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en
las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importan-
tes incluyen anorexia, pérdida de peso rápida y daños a la mucosa intestinal
causados por la bacteria invasora.
La mayoría de los casos de disentería aguda en niños, son causados por
Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente
Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba
histolytica, puede causar disentería seria en adultos jóvenes, pero es una causa
muy rara en niños. En alrededor de 90% de los casos de infección intestinal
por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas.
Los pacientes con disentería causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Ba-
cilo de Shiga), están a menudo clínicamente muy enfermos. Este síndrome
clínico casi siempre incluye fiebre alta, síntomas tóxicos y cólicos abdomina-
les intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaña de complicaciones graves, como el síndrome hemolítico urémico.
Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este
enteropatógeno. Esto ocurrió en Centroamérica en los años 1969 y 1970. La
terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y
duración de la disentería y de la fiebre, así como la excreción del patógeno.
EPIDEMIOLOGÍA
Transmisión de los agentes que causan diarrea
Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan
por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestión de agua o alimentos conta-
minados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales.
Varios comportamientos específicos de las personas contribuyen a la
propagación de los enteropatógenos y por consiguiente incrementan el ries-
go de sufrir diarrea. Estos incluyen:
- Falta de lactancia materna exclusiva durante los primeros 4-6
meses de vida.

59
- Usar biberones para alimentar a los niños.
- Guardar alimentos a temperatura ambiente.
- Beber agua contaminada con bacterias fecales.
- No lavarse las manos después de defecar, después de desechar las
heces de los niños o de limpiar los pañales y antes de preparar o
servir alimentos.
- No desechar higiénicamente las heces (incluyendo las de los
lactantes).
Epidemias
En las áreas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el año, au-
menta su frecuencia durante los meses secos y más fríos, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estación lluviosa y más cálida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrón estacional de la dia-
rrea aguda líquida.
Hay dos enteropatógenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que
provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos
los grupos de edad son altas. Desde 1961, el cólera causado por el biotipo
Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a países de Asia, el Mediterráneo
Oriental, Africa, y a algunos países de Europa. Desde 1991, ha causado epide-
mias en prácticamente todos los países de América Latina y casos sin
diseminación secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo período
de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de
disentería grave en Centro América (69-70) y, más recientemente, en Africa
Central y Sur de Asia.
ETIOLOGÍA
Enteropatógenos importantes:
Virus: Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxigénica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum

60
Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarrea
aguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo
Patógeno Porcentaje de Antimicrobianos
casos recomendados en
base clínica*
Virus Rotavirus 15-25 Ninguno***
Bacterias Escherichia coli 10-20 Ninguno
enterotoxigénica
Shigella 5-15 Trimetoprim-
sulfametoxazol,
Ácido nalidíxico
Campylobacter jejuni 10-15 Ninguno
Vibrio cholerae 01 5-10** Tetraciclina,
Doxiciclina,
otros
Salmonella (no tifoidea) 1-5 Ninguno***
Escherichia coli 1-5 Ninguno
enteropatógena
Protozoos Cryptosporidium parvum 5-15 Ninguno***
Ningún patógeno 20-30 Ninguno***
aislado
* Para cepas sensibles
** En áreas endémicas; puede ser más alto durante epidemias
*** Ningún antimicrobiano efectivo

61
Otros patógenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en
niños en los países en desarrollo es mínima, o no está bien definida. Estos
incluyen:
Virus: agente Norwalk
adenovirus entéricos
Bacterias: Aeromonas hydrophila
Escherichia coli enteroagregativa
Escherichia coli enteroinvasora
Escherichia coli enterohemorrágica
Plesiomonas shigelloides
Vibrio cholerae que no es 01
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
Protozoos: Giardia lamblia
Entamoeba histolytica
Isospora belli
Cyclospora cayetanensis
Mecanismos Patogénicos de los Agentes Etiológicos de Diarrea
Los enteropatógenos causan diarrea por varios mecanismos, algunos de
los cuales se revisan a continuación.
Virus
Los rotavirus se replican dentro de las células epiteliales maduras que
cubren la porción superior de las vellosidades intestinales, causando destruc-
ción celular y acortamiento de las vellosidades.
Bacterias
Adherencia a la mucosa
Producción de toxinas que causan secreción intestinal
Invasión de la mucosa
Protozoos
Adherencia a la mucosa
Invasión de la mucosa

62
Shigella
Shigella es la causa más importante de disentería, encontrándose en al-
rededor de 60% de todos los episodios y en prácticamente en todos los episo-
dios graves de esta forma de diarrea; también pueden causar diarrea líquida.
S. flexneri es la especie más prevalente en países en desarrollo, sin em-
bargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de
la disentería más grave. La destrucción tisular y posiblemente la diarrea lí-
quida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de
Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae
tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisión de persona a
persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con
antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es común la resistencia
antimicrobiana. Puede haber resistencia a múltiples antimicrobianos especial-
mente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos más útiles son
trimetoprim-sulfametoxazol y ácido nalidíxico; en algunas áreas también es
efectiva la ampicilina.

63
CAPÍTULO 4
COPROCULTIVO PARA CÓLERA
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria
causante del cólera. Esta bacteria se adquiere por ingestión de bebidas o alimentos
contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a
la producción de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos.
En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la
forma clínica del cólera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a
“agua de arroz”) y vómitos. Esto provoca en el paciente deshidratación severa que
puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratación y antibióticos.
El cólera ha sido endémico en la India y en otros países desde la más remota
antigüedad. En 1961 se inició la séptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991
apareció en Perú y a partir de allí se ha diseminado a varios países de Latinoamérica,
donde ahora es una infección endémica, más frecuente durante la época lluviosa.
Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 según su antígeno
somático), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que
aún no se ha detectado en Latinoamérica. Generalmente si la epidemia se inicia
con el serotipo Inaba, después de algún tiempo se transforma en Ogawa, debido a
cambio de antígenos. Esta clasificación sólo tiene interés epidemiológico. Existen
dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clásico. En Latinoamérica, durante la presente
pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias
con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o
asintomáticos; también sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más re-
sistente a los agentes químicos.
El tratamiento principal del cólera es evitar la muerte por deshidratación, por
medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por vía oral y si
es necesario por vía intravenosa. El tratamiento con antibióticos ayuda a la recupe-
ración, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, además evita portadores de la
bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en niños el trimetoprim-
sulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la
furazolidona.

64
El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V.
cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indi-
cativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto.
MUESTRA:
Las muestras adecuadas para efectuar el diagnóstico bacteriológico de el có-
lera son: heces diarréicas (principalmente con apariencia de “agua de arroz”), hisopo
rectal o vómitos. Deben recolectarse de preferencia dentro de las primeras 24 horas
de la enfermedad y previo a la administración de antibióticos. Si las muestras de
heces frescas van a ser procesadas en un tiempo adecuado (antes de dos horas),
deben recolectarse en un recipiente de vidrio o plástico bien limpio, de preferencia
estéril, y enviarse inmediatamente al laboratorio. En caso contrario deben inocu-
larse dos hisopos con material fecal en el medio de transporte Cary-Blair, que
debe enviarse al laboratorio de referencia sin necesidad de refrigeración. En
el medio hospitalario no es necesario usar inútilmente el medio de transporte
Cary-Blair, ya que la muestra de heces frescas debe remitirse al laboratorio para su
cultivo directo inmediato.
PROCEDIMIENTO:
Existen muchas variantes en la marcha bacteriológica a seguir para el aisla-
miento e identificación de Vibrio cholerae 01. La marcha simplificada propuesta es,
en la experiencia del autor, efectiva y sencilla (ver figura 7, pág. 67). V. cholerae 01
puede aislarse directamente de las heces, pero se logran resultados mucho mejores
si previamente se hace un enriquecimiento en el caldo selectivo alcalino llamado
agua pepto nada alcalina o APA. En este caldo el agente etiológico del cólera proli-
fera en la superficie, pues resiste la alcalinidad extrema del medio (pH 9.0 a 9.2), y
otras bacterias de la microbiota fecal se destruyen, por lo que se obtienen cultivos
casi puros.
1. Inocular masivamente un tubo con 5 ml de agua peptonada alcalina,
con un hisopo estéril bien cargado de heces o vómito. Sacar el hisopo y
agitar muy bien el tubo, luego incubar verticalmente y con el tapón lige-
ramente suelto, solamente por 5 a 8 horas a 36° C.
2. Si se trata de heces, inocular directamente cajas de agar MacConkey,
XLD o SS e idealmente Hektoen para el aislamiento de Shigella y
Salmonella, ya que las infecciones intestinales causadas por estos dos
géneros, clínicamente pueden semejar cólera.

65
3. Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuida-
dosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas
concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del
medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de
buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventual-
mente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinónimo: sucrosa). Contiene dos
indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo
en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colo-
nias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, también producen
colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia
epidemiológica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positi-
vo, también pueden producir colonias amarillas, pero de morfología distinta a las
que produce V. cholerae 01.
1. Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de co-
lonias grandes (de 2 a 3 mm de diámetro), de color amarillo canario
(sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colo-
nias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selecti-
vo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.
2. Si hay crecimiento típico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desa-
rrollará un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incolo-
ras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolíticas. En el área de la
caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona
de decoloración del medio que semeja hemólisis; probablemente se debe
al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemólisis específica a
los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01
del biotipo eltor; en todo caso, es una característica adicional que ayuda
a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.
3. Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las

66
colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es
inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las
colonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden sus-
pender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiable
a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
4. Si se obtiene una reacción de aglutinación positiva, franca e inmediata,
generalmente con presencia de grumos grandes, se ha demostrado la
presencia de V. cholerae 01. Proceder a aglutinar el crecimiento típico del
agar sangre de carnero en antisueros anti-serotipo Inaba y anti-serotipo
Ogawa; generalmente la aglutinación es más fina, pero evidente. Esto
último no es crucial, pero si deseable. La prueba de oxidasa es positiva;
debe hacerse en caso de duda o confirmación.
5. Si el laboratorio no cuenta con antisuero polivalente anti-V. cholerae 01,
se deberá seleccionar una colonia típica del TCBS, y subcultivar en TSI y
LIA. En estos medios la reacción después de 18 a 24 horas de incubación,
generalmente es TSI: K/A (A/A); LIA: K/K-N, sin gas ni ácido
sulfhídrico en ambos tubos. El tubo de TSI debe remitirse al laboratorio
de referencia donde se efectúa la confirmación.
6. Efectuar prueba de susceptibilidad a los antibióticos, según el método
de Bauer-Kirby. Sólo deben colocarse los siguientes discos: tetraciclina y
trimetoprim-sulfametoxazol, son indispensables; ampicilina o algún otro
antibiótico, son optativos. Interpretar los diámetros de los halos de inhi-
bición igual que para enterobacterias. Es deseable, pero no indispensa-
ble, colocar en el centro de la caja de agar Mueller-Hinton, un disco con
50 UI de polimixina-B. La resistencia con ausencia de zona de inhibición
a este antibiótico, indica que la cepa aislada de V. cholerae 01, pertenece
al biotipo eltor. Esto es de esperarse en Latinoamérica, ya que el biotipo
clásico no está actualmente presente. Si se detecta una cepa susceptible
a polimixina-B, debe remitirse al laboratorio nacional de referencia per-
tinente, para que confirme este hallazgo de interés nacional. El biotipo
eltor presenta una prueba de Voges-Proskauer positiva.

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Fig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARAFig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA
AISLAMIENTO DEAISLAMIENTO DEAISLAMIENTO DEAISLAMIENTO DEAISLAMIENTO DE Vibrio choleraeVibrio choleraeVibrio choleraeVibrio choleraeVibrio cholerae 0101010101
Nota:Nota:Nota:Nota:Nota: El diagnóstico definitivo se puede obtener en 24 horas
ASC Colonias:
- Grandes
- No hemolíticas
Hacer frote
Gram: bacilos
gram-negativo, algunos curvos.
Aglutinar,sipositivodarinforme
STATSTATSTATSTATSTAT: Vibrio cholerae 01
Hisopo rectalHeces líquidas Vómitos
1. InocularconhisopoestérilbiencargadobiencargadobiencargadobiencargadobiencargadountuboconAPA,
descartar el hisopo y agitar
2. Incubar 5-6 horas5-6 horas5-6 horas5-6 horas5-6 horas a 36
o
C
No agitar
Vibro cholerae
en la superficiesuperficiesuperficiesuperficiesuperficie
del APA
3. Tomar inóculo de la
superficiesuperficiesuperficiesuperficiesuperficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
5. Incubar 18-24 horas18-24 horas18-24 horas18-24 horas18-24 horas
a 36
o
C
Muestras:
APA
TCBS
Colonias:
- Amarillas
- Grandes
- Planas
Sembrar antibiograma
6.Interpretar simultáneamente

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INFORME:
En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una técnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para aho-
rrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el re-
porte de un cultivo positivo. Se recomienda informar así, lo más pronto posible, y
al lugar más indicado:
1. Inmediatamente después de una prueba de aglutinación franca a partir
del agar sangre de carnero:
Se aisló Vibrio cholerae O1.
2. Después de aglutinación positiva con antisuero polivalente anti-V.
cholerae 01 y luego aglutinación positiva con antisuero de serotipo Ogawa
o Inaba:
Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Inaba (u Ogawa).
3. Después de interpretar la prueba de susceptibilidad, pero posteriormente
a haber enviado un reporte preliminar:
Se aisló Vibrio cholerae 01, serotipo Ogawa (o Inaba), biotipo eltor.
Susceptible a: ... ; Resitente a: ...
FÓRMULAS:
1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):
Peptona ...................................................................... 10 gramos
Cloruro de sodio....................................................... 10 gramos
Agua destilada.......................................................... 1,000 ml
Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidróxido de sodio 1N.
Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapón de rosca.
Autoclavear 15 minutos a 121° C (15 libras de presión por pulgada cuadrada).

69
2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:
Tioglicolato de sodio................................................ 1.5 gramos
Fosfato dibásico de sodio ........................................ 1.1 gramos
(Na2HPO4)
Cloruro de sodio....................................................... 5.0 gramos
Agar. ........................................................................... 5.0 gramos
Agua destilada.......................................................... 991.0 ml
Disolver los ingredientes en el agua por calentamiento, y con agitación constante.
Enfriar a 50 grados centígrados, y adicionar 9 ml de cloruro de calcio al 1%, recien-
temente preparado (0.1 gramos de cloruro de calcio + 10 ml de agua). Ajustar pH a
8.4 con hidróxido de sodio 1N, y distribuir 6 ml en tubos de 13x100 con tapón de
rosca, a manera de dejar un pequeño espacio de aire entre el tapón y el medio.
Autoclavear a 100 grados centígrados en Baño de María hirviendo, por 15 minutos.
Enroscar bien el tapón y almacenar en refrigeración y oscuridad.

71
CAPÍTULO 5
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. Apartir
de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea
humana. C. jejuni es más frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estu-
dios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de niños menores
de cinco años de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10
por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Lati-
no-américa; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos varía
del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un
medio de cultivo y condiciones de incubación especiales, su búsqueda no se efec-
túa rutinariamente, lo cual debería hacerse debido a su importancia epidemiológica.
Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en
forma de “S”. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la célula, lo que le
proporciona un movimiento rápido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera
de dardo. Es una bacteria estrictamente microaerofílica, oxidasa-positivo, que no
fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centígrados, pero se utiliza
su capacidad diferencial (termófila) de crecer mejor a 42 grados centígrados, para
su aislamiento.
La infección intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vómitos. Puede haber sangre macroscópica en las heces,
especialmente en las muestras pediátricas. La infección se adquiere por vía oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infección puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues también puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuen-
te en animales domésticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, además
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis séptica, meningitis y otras
infecciones.
El diagnóstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por
la observación directa de bacterias con “movimiento de dardo” en las heces con

72
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abun-
dantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnóstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificación de C. jejuni.
MUESTRA:
En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos
especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de
dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con
orina. También puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculación se efectúa inmedia-
tamente.
CONDICIONES NECESARIAS:
El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los
siguientes aspectos:
1. Un agar sangre de carnero selectivo, recientemente preparado. Se
recomienda el Agar Skirrow modificado, que contiene como inhibi-
dores: vancomicina (10 mg/lt), polimixina-B (2,500 UI/lt) y trimeto-
prim (5 mg/lt). Idealmente debe prepararse con la siguiente base:
Blood Agar Base No. 2 (Oxoid), adicionada de 10% de sangre de
carnero desfibrinada/estéril. La sangre de carnero remueve formas
tóxicas de oxígeno en el medio de cultivo. La mezcla de antibió-
ticos que hacen al medio selectivo para C. jejuni puede obtenerse comer-
cialmente.
2. Incubación en microaerofilia estricta. Idealmente: 5% de oxígeno, 10%
de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno. La forma más fácil y efecti-
va de lograr esta atmósfera, es usar el jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico
ni indicador. Según las instrucciones del productor, usar el sobre rojo
generador de anaerobiosis (BBL). La incubación en jarro con candela no
es adecuada, pues proporciona una atmósfera con demasiado oxígeno
(12%-17%) para permitir el crecimiento de C. jejuni.
3. Incubación a 42° C por 48 horas. Inhibe la microbiota intestinal,
y permite el crecimiento termófilo de Campylobacter jejuni, C. coli y
C. laridis.

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