Este documento describe un proyecto de tesis de doctorado que investigará el efecto adyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. en el tejido estriado de Rattus rattus var albinus. El estudio extraerá y concentrará saponinas de S. saponaria para inyectar a tres grupos de ratas a diferentes concentraciones y evaluar parámetros inflamatorios e histoquímicos. Los resultados buscan determinar si las saponinas actúan como adyuvantes de vacunas en el músculo estriado.

1. “Efecto adyuvante de vacunas de las
saponinas de Sapindus saponaria L. en
músculo estriado de Rattus rattus var
albinus”
PROYECTO DE TESIS DE
DOCTORADO
CIENCIAS BIOMEDICAS
AUTOR
M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva
ASESOR
Dr. Ramón Piminchumo Carranza
Escuela de PostGrado/UNT
TRUJILLO – 2007

2. Sapindus saponaria L.

8. Sapogenina
(L-Hederina)

9. ANTECEDENTES Y
FUNDAMENTACION DEL TRABAJO
 Se ha investigado científicamente las
sustancias presentes tanto en plantas
(Fitoquímica) como animales
(Zooquímica)1. Las saponinas, se han
utilizado por sus propiedades
detergentes2. Las saponinas de
saponaria o jabonera, son agentes
limpiadores de la contaminación por
vertidos tóxicos y poseen virtudes
hemostáticas3. De Sapindus
saponaria se ha aislado la Saponina
L-Hederina4.

10. ANTECEDENTES Y
FUNDAMENTACION DEL TRABAJO
 En Perú, de Sapindus
saponaria L., desde
épocas precolombinas se
ha utilizado el pericarpio
del fruto maduro por su
alto contenido de
saponinas5.

11. ANTECEDENTES Y
FUNDAMENTACION DEL TRABAJO
 La Asociación Argentina de Químicos
Cosméticos6 reporta la actividad
antihialuronidasa de las saponinas de
Sapindus saponaria L. y la eficacia en
el tratamiento cosmético de la
lipoesclerosis. En Colombia; se ha
reportado que saponinas de Ruscus,
estimularían el metabolismo celular,
la multiplicación celular y micro
circulación cutánea7.

12. ANTECEDENTES Y
FUNDAMENTACION DEL TRABAJO
 En Santiago de Cuba, reportan la
utilidad de las saponinas como
adyuvantes inmunológicos en el
campo de la salud veterinaria8. En La
Habana, han reportado la actividad in
vitro frente a L. infantum de las
saponinas hederacolchisida A y α y β-
Hederina, y que Yuccasaponina MC3,
inhibe al 100% el crecimiento de
promastigotes de Leishmania
mexicana amazonensis9.

13. ANTECEDENTES Y
FUNDAMENTACION DEL TRABAJO
 En Chile, se ha anunciado la
creación de una industria para la
extracción y comercialización de
saponinas, para refinación del
cobre10. El Tratado de Libre
Comercio (TLC) Perú-USA11,
incluiría saponinas con arancel
base 4 y canasta 4. El TPD
Colombia-USA12, también incluye
saponinas.

14. INVESTIGACIONES PREVIAS
DEL AUTOR EN EL TEMA
 En 2005, con el proyecto "Saponinas
de Sapindus saponaria L.: Extracción
por fraccionamiento de espuma y
secado por radiación infrarroja".
Concluimos que 1) La velocidad de
burbujeo no influye en la pureza de
las saponinas, 2) La altura de
columna de fraccionamiento influye
en la pureza de las saponinas, y 3) No
fue posible secar la espuma con
radiación infrarroja en las
condiciones experimentales.

15. INVESTIGACIONES PREVIAS
DEL AUTOR EN EL TEMA
 En 2006, con el proyecto "Efecto del grado de
vacío en la operación de evaporación a 40 °C
para concentrar el producto del
fraccionamiento de espuma de las saponinas
de Sapindus saponaria", concluimos que 1)
Es posible concentrar los extractos de
saponinas de Sapindus saponaria L.
“Choloque” mediante evaporación al vacío, y
2) Por cada 180 mm de Hg de reducción de
presión se puede obtener concentrados
estadísticamente diferenciados con un 95%
de seguridad.

16. JUSTIFICACION Y
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
 En nuestros laboratorios se ha
utilizado la cáscara del fruto
maduro, para desarrollar una
tecnología de obtención de un
extracto concentrado de
saponinas, para aplicaciones
científico-tecnológicas que a
futuro demanden la producción
industrial y la industrialización
del producto.

17. JUSTIFICACION Y
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
 Continuando las investigaciones del Centro
de Investigaciones de Energía Solar en
Santiago de Cuba, sobre ADYUVANTES
INMUNOLÓGICOS8 y su búsqueda de nuevas
sustancias con actividad
adyuvante/inmunopotenciadora en el marco
de la investigación inmunológica actual y con
la finalidad de proponer como fuente de
sustancias con propiedades
inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L.
”Choloque” es necesario explicar
científicamente el mecanismo de la actividad
de las saponinas de esta especie vegetal. Los
resultados permitirán un mejor enfoque
científico, tecnológico y ecológico de
promoción de su cultivo.

18. JUSTIFICACION Y
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
 Adyuvante es una sustancia distinta
de un antígeno que potencia la
activación de los linfocitos T al
favorecer la acumulación y activación
de otros leucocitos, denominados
células accesorias, en el lugar de
exposición al antígeno. En las células
accesorias, los adyuvantes aumentan
la expresión de coestimulantes y
citocinas que activan a los linfocitos T
y pueden prolongar también la
expresión de complejos péptido-CPH
en la superficie de las CPA13.

19. Problema científico
 ¿Cuál es el Efecto de las
saponinas de Sapindus
saponaria L. en músculo
estriado de Rattus rattus var
albinus?

20. HIPOTESIS DEL TRABAJO
 “Las saponinas de Sapindus
saponaria L. actuando como
adyuvantes en el tejido estriado
de Rattus rattus var albinus,
favorecen la acumulación y
activación de células accesorias
en la zona de depósito”.

21. Objetivo general
Determinar el efecto
adyuvante de las
saponinas de Sapindus
saponaria L. en tejido
estriado de Rattus rattus
var albinus.

22. Objetivos específicos
Ensayar la respuesta coadyuvante de
las saponinas de Sapindus saponaria
L. a tres concentraciones diferentes
en solución salina fisiológica en
músculo estriado de Rattus rattus var
albinus.
Realizar el análisis histoquímico, es
decir cuantificar los IL y CD.
Determinar estadísticamente la
significancia de los resultados
obtenidos.

23. Relevancia técnica y
socioeconómica del tema
propuesto
En la preparación del extracto se aplica una
tecnología desarrollada en nuestros
laboratorios, adecuada a nuestra realidad y
por tanto fácil de aplicar a nivel de planta
piloto con un mínimo de inversión.
Sapindus saponaria L. puede convertirse en
una planta agroindustrial y de reforestación
de nuestros valles costeños, incluidas las
zonas urbanas, por su follaje perenne y
abundante; sus frutos y semillas pueden
tener aplicación industrial, incluida la química
farmacéutica. Existen otras líneas de
investigación potencial, aún por iniciar.

24. Diseño de investigación
 Material de estudio
Concentrado de saponinas de
Sapindus saponaria L.
preparado en el laboratorio de
Análisis Instrumental; solución
salina fisiológica; Rattus rattus
var albinus, tres grupos testigo
y tres grupos ensayo. Cada
grupo estará constituido por 10
especimenes cada uno.

25. Diseño experimental:
Diseño clásico
Dos grupos de Rattus rattus
var albinus testigo y
experimental, serán inyectados
con solución salina fisiológica
y solución de saponinas (tres
concentraciones diferentes) en
solución salina fisiológica,
respectivamente. Se realizarán
las observaciones antes y
después de la inyección.

26. Extracción y concentración de
saponinas
Se preparará un extracto
acuoso concentrado de
saponinas de la cáscara
del fruto seco de
Sapindus saponaria L.

27. Muestra para extracción

28. Fraccionamiento y concentración

29. Ensayo inflamatorio
1. Inyección intramuscular
 Se depilará el área de inyección de cada
espécimen.
 Se inyectará a cada espécimen la
solución experimental correspondiente
(según grupo y dosis) y se observará la
aparición de signos en el área:
inflamación, color, calor.
 Se documentará esta etapa mediante
fotografías. Para esto se colocará junto
al animal una regla para llevar la cuenta
de la dimensión del área.

30. Zona depilada para inyectar

31. Ensayo inflamatorio
2. Biopsia del tejido de la zona de depósito
 Se tomará una muestra de tejido y se
observará en una lámina la infiltración (si
la hubiera).
 Se hará un conteo de células,
especialmente neutrófilos. Se comparará
con una muestra patrón (con inyección
de solución salina fisiológica).
 Si el animal es sacrificado, se observará
la zona de depósito.

32. Ensayo inflamatorio
3. Pruebas histoquímicas
 Se tomará una muestra y se observará
las respuestas histoquímicas, se
cuantificará los IL y CD.
4. Comparación con un coadyuvante patrón
 Se inyectará coadyuvantes patrones13, 14:
Hidróxido de aluminio, fosfato de
aluminio, fosfato cálcico, BCG.
 Se documentará todas las evidencias que
permitan realizar la comparación.
 Si se no se dan los signos del paso 1 se
continuará directamente con el 3.

33. Análisis estadístico
 Se realizará el ANOVA15 con las
prueba de MSD y Dunnett para
determinar si existe o no diferencia
significativa entre las respuestas
grupo experimental y testigo,
mediante el software16 SPSS v 10.

34. Resultados esperados
 El análisis de datos
permitirá concluir si las
saponinas de Sapindus
saponaria L. tienen efecto
coadyuvante de vacunas en
músculo estriado de Rattus
rattus var albinus .

35. Impacto o beneficios esperados
 Ante la resistencia al uso de
coadyuvantes como el mercurio,
hay una gran potencialidad
aplicativa del extracto concentrado
de saponinas de Sapindus
saponaria L.; todo esto enmarcado
en una alternativa de desarrollo de
una tecnología propia que permita
explotar nuestros recursos
naturales respetando el medio
ambiente.

36. Infraestructura y medios físicos
a utilizar
 Laboratorios:
 Laboratorio de Química Física y
Laboratorio de Análisis Instrumental de
la Sección de Química e
Instrumentación, Departamento de
Bioquímica
 Laboratorio de Toxicología,
Departamento de Farmacología.
 Equipos de laboratorio:
 Columna de fraccionamiento de espuma
 Equipo de destilación al vacío
 Espectrofotómetro UV/Vis HP 8452A
 Microscopio óptico binocular

37. Tipo de investigación
 De acuerdo al fin que se
persigue: Aplicada
 De acuerdo al diseño de
investigación: Explicativa

38. Localización
 Localidad: Trujillo
 Institución: Universidad
Nacional de Trujillo

39. Referencias bibliográficas
1. Martínez, A. Manual de Farmacognosia y Fotoquímica.
Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de
Antioquia, Medellín (Colombia) 1997. [En línea].
<http://huitoto.udea.edu.co/~farmacogfit>.
2. Evans, W. Trease-Evans, Farmacognosis. 13ª ed. Ed.
Nueva Editorial Interamericana, S.A. de C.V. México
D.F. (México). 1989. pp 519-520.
3. [En línea].
<http://www.revik.com/cosmetologia/enciclopedia.htm>
4. [En línea].
<http://fbio.uh.cu/webfv/articulos/metabolismo%20secu
ndario.doc>
5. Almenara, O. Físico-Químca. Ed. Empresa Editorial
Humbolt, S.A. Lima (Perú). 1984. pp. 192-194.
6. [En línea].
<http://www.abc-cosmetologia.org.br/biblioteca/descr_
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40. Referencias bibliográficas
7. [Em línea].
http://www.sic.gov.co/propiedad/Estudios/vigilancia/Vigilancia_Crem
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8. Morris, H. J.; Martínez, Cl, Abdala, R. T.; Campos, D. Adyuvantes
inmunológicos. [En línea].
<http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03001999000200010
&script=sci_arttext>
9. [En línea].
http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol36_s_02/F%20Producciones%20Pla
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10. [En línea]. http://www.puc.cl/autoridades/rector/discurso02.PDF
11. [En línea].
http://www.tlcperuusa.com/uploads/Oferta%20de%20Peru%20a%2
0EEUU%20con%20formato%205.pdf
12. [En línea]
<http://www.sice.oas.org/TPD/AND_USA/COL_USA/Draft_text_050
806_s/Lista%20de%20Desgravacion%20de%20Colombia%20(indu
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41. Referencias bibliográficas
13. Abbas A; Andrew H. Lichtman. Inmunología
celular y molecular. 5ª ed. Ed. Elsevier España
S.A. Madrid: 2004. 363-365, 477.
14. [En línea] .
http://www.aeped.es/vacunas/pav/modulo1/PD
Fs/Vacunas2.pdf
15. Walpole, RE., Raymond H. Myers y Sharon
L. Myers. Probabilidad y Estadística para
Ingenieros. Ed. Prentice - Hall
Hispanoamericana, S.A. México: 1999. 483.
16. Pérez, C. Técnicas Estadísticas con SPSS. Ed.
Pearson Educación, S.A. Madrid: 2001. 370 –
372.

42. Por una tecnología propia
y ecológica
 A ustedes
Muchas gracias