Práctica de laboratorio de Ing. Bioquímica 1: Aislamiento de microorganismos de importancia industrial

1. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE
SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BOLÓGICAS
Escuela de Genética y Biotecnología
PRÀCTICA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
CURSO: Ingeniería Bioquímica
PROFESOR: Mg Mario Alcarraz
HORARIO: Martes 8-10pm
Viernes 6-8 pm
ESTUDIANTE:
Cortez Pacheco, Renzo
Poma Acevedo, Astrid
Ramirez Gomero, Angel
Reyes Vásquez, Jhakelin Gloria
Ríos Matos, Dora
“AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA Y LIPOLÍTICA”
2016

2. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son las fuentes más comunes de enzimas comerciales debido a que
presentan propiedades fisiológicas y bioquímicas, que facilitan las condiciones de cultivo y la
manipulación celular. Entre las enzimas microbianas, las proteasas y lipasas son de las más importantes
para la industria, y constituyen más del 60% del mercado de enzimas industriales. Estas enzimas son
usada en diversos campos de la industria, como el procesamiento de los alimentos, desarrollo de
farmacéuticos, proceso del cuero, recuperación de la plata en películas de rayos-x(Dias, Abreu,
Silvestre, & Schwan, 2010).
El incremento del uso de enzimas en la industria, ha llevado a la búsqueda de enzimas más específicas
para cada tipo de industria, enzimas que realicen su actividad sobre algunos sustratos específicos
mientras no interfieran con los demás, optimizando de esta manera el proceso industrial. Por este
motivo se buscan enzimas que presenten estabilidad bajo los diferentes factores en la industria, como
el sistema de producción, el proceso de purificación, temperatura, pH y sustrato(Dias, Vilela, Silvestre,
& Schwan, 2008).
En los últimos años ha habido un aumento en la búsqueda de nuevos microrganismos con potencial
enzimático industrial, debido a esto, se ha ampliado el rango de búsquedas de microorganismos,
esperando, que en lugares donde exista degradación de proteínas y lípidos de manera natural,
encontremos microorganismos con uso potencial en la industria enzimática proteasa y lipasa. Es sabido
que en los camales del Perú, existe una gran población bacteriana que se acumula día a día por los
bajos niveles de limpieza y bioseguridad, llegando a reportarse casos de intoxicación y adquisición de
parásitos por parte de los trabajadores (Solís Quispe, Tello Chumpitaz, Quinte Sarmiento, & Ramírez
Flores, 2007). Debido a esto, los camales son un lugar idóneo para encontrar microorganismo con
actividad proteolítica y lipasa. De igual forma, en las avícolas, o centro de distribución de carne de
pollo, donde se matan diariamente cientos de estos animales, es posible encontrar bacterias con
actividad lipasa y proteolítica.
El presente informe describe el trabajo de aislamiento de microorganismos con actividad proteolítica y
lipasa, de muestras de un camal y una tienda de pollos respectivamente.

3. OBJETIVOS
 Aislar y seleccionar microorganismos proteolíticos y lipolíticos con importancia industrial.
 Evidenciar la actividad proteolítica y lipolítica de los microorganismos obtenidos en el
muestreo través de la visualización de halos.
PROCEDIMIENTO
1) Muestras analizadas
1.1 Muestra para encontrar microorganismos proteolíticos
Lugar de recolección: Canaleta del camal de Barranca, Lima.
Observación: Líquido negruzco con partículas, tejido gelatinoso en su interior. Olor a descompuesto.
1.2 Muestra para encontrar microorganismos lipolíticos
Lugar de recolección: Sitio de venta de pollos
Observación: Color verdoso, tejido vivo en suspensión. También se tiene un líquido de contacto con
tejido en descomposición de ave, color beige a marrón. El olor es fecal. A este se le añadió
aproximadamente 20ml de leche en descomposición.
2) Protocolo empleado
a) Homogenizar bien la muestra, luego extraer 1 ml y colocar en un tubo con 9 ml de solución salina
(NaCl al 8% en 1 L). Homogenizar el contenido del tubo.
b) Realizar diluciones sucesivas:
Del tubo -1, se extraen0.1 ml y se colocan en el tubo -3. Homogenizar bien y extraer 0.1 ml para
colocar en el tubo -5. Se homogeniza bien y se extraen 0.1 ml para colocar en el tubo -7.
Homogenizar bien, y extraer 1 ml para colocar en el tubo -8. Homogenizar bien y extraer 1 ml para
colocar en el tubo -9.
c) Extraer inóculos de 0.1 ml de los tubos -7, -8 y -9 y colocar en placas Petri con agar suplementado
con:
* Para microorganismos proteolíticos: Agar caseína y Agar leche.
* Para microorganismos lipolíticos: Agar suplementado con mantequilla y Agar Tween 80.
d) Se colocan en una incubadora a 30°C durante 48 horas, luego de las cuales se procede a hacer la
lectura. Las colonias dan positivo a estas pruebas diferenciales si forman halos de degradación.

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS
Aislamiento y selección de microrganismos lipolíticos:
El crecimiento de los organismos en ambos los medios suplementados con Tween 80 y mantequilla fue
excesivo, a pesar de haber realizado varias diluciones. Se observó una alta concentración de
microorganismos debido probablemente a la proliferación de estos durante el almacenaje de la
muestra. Se espera la presencia de halos alrededor de los organismos lipolíticos, es decir, un cambio de
color (generalmente más claro) en el agar alrededor de la cepa, que evidencie la actividad enzimática
lipolítica. No es posible la observación de estos, ni la identificación de los microorganismos de interés,
debido a la incontable cantidad de colonias y su aspecto pastoso, en estas condiciones también es
difícil determinar qué medio podría ser más adecuado para su crecimiento y los análisis posteriores.
Agar Tween
Agar mantequilla
-8-7 -9
-8 -9-7
Figura 1.- En la imagen se muestra las placas en las que se realizó el aislamiento de
microorganismos por diseminación. En la primera fila se encuentran las placas con medo
suplementado por agar Tween, mientras en la segunda fila por agar mantequilla. La
concentración de la muestra empleada para estas siembras se encuentra indicada en la
imagen, por números de color amarillo sobre cada placa.

5. Dilución Agar Mantequilla Agar Tween
-7
-8
-9
Figura 2.- En la tabla se muestra las imágenes de cada placa con la dilución de la muestra que
se empleó junto con el tipo de medio suplementado empleado. Se ve gran población
bacteriana para gran parte de las placas, sin embargo no se observa a simple vista una
colonia con un halo representativo.

6. Aislamiento y selección de microorganismos proteolíticos :
En los medios suplementados con caseína y leche también se observó gran crecimiento, presencia de
colonias pequeñas, pastosas y opacas. Es posible suponer que en la placa hayan proliferado no solo los
organismos de interés, debido a la constitución compleja del agar leche, es probable encontrar
proteolíticos y lipolíticos, sin embargo, no es posible su identiicación, la ingente cantidad de colonias no
permite la identificación de halos ni el aislamiento de los organismos de interés.
-8-7 -9
-8 -9-7
Agar Leche
Agar Caseína
Figura 3.- En la imagen se muestra las placas en las que se realizó el aislamiento de
microorganismos por diseminación de muestras del camal de Barranca. En la primera fila se
encuentran las placas con medo suplementado por agar leche, mientras en la segunda fila
por agar caseína. La concentración de la muestra empleada para estas siembras se encuentra
indicada en la imagen, por números de color amarillo sobre cada placa.

7. Dilución Agar Leche Agar Caseína
-7
-8
-9
Figura 4.- En la tabla se muestra las imágenes de cada placa con la dilución de la muestra que
se empleó junto con el tipo de medio suplementado empleado. Se ve crecimiento de colonias
de microorganismos, sin embargo, no se llega a ver halos significativos que nos hagan
sospechar de su actividad.

8. Réplica:
El aislamiento posterior se realizó en las inmediaciones del laboratorio, y solo se aislaron cepas con
presunta actividad enzimática, ya sea lipolítica o proteolítica, provenientes de las primeras placas, estas
se aislaron mediante la técnica de puntura en agar tributirina (lipolíticos) y agar caseína (proteolíticos).
Se observó crecimiento de la cepa y halos de degradación de más de 2mm alrededor de estas,
evidencia notoria de la actividad enzimática.
Figura 5.- En la imagen se muestran tres placas, que para diferenciarlas han sido señalas como L1, L2 y P.
Siendo las placas L1 y L2, aquellas donde se aislaron microorganismos lipolíticos que crecieron en agar
tributirina, y fueron aislados de las colonias que crecieron en las placas provenientes de la muestra de la
tienda avícola. En la placa P, se observa microrganismos con actividad proteolítica evidenciada por halos
cortos en el agar caseína, siendo estos microorganismos aislados de las placas de las muestras del camal
de Barranca.
L1 L2 P

9. DISCUSIÓN
Mantenimiento de la muestra
De acuerdo a los objetivos planteados en la primera experiencia percibida no se pudo aislar los
microorganismos proteolíticos y lipolíticos de interés, sin embargo con la debidas precauciones esto se
logró al realizar una réplica de estas. En la primera experiencia debido a factores como las condiciones
de la muestra principalmente no se logró el objetivo, pues la conservación de ambas, no cumplieron
con los requisitos de transporte para garantizar la estabilidad de sus propiedades biológicas (Bauzá,
2003) referimos a esto específicamente pues al ser un medio rico en nutrientes el transporte y la
conservación inadecuada, por ejemplo no alamacenarlos abajas temperaturas (4° C) favorecen la
sobrepoblación de otros organismos oportunistas que no poseen la capacidad lipolítica y proteolítica
que estamos buscando y que además tienen mayor probabilidades de subsistir en medios mínimos.
Recolección de muestra
En los mataderos se obtienen diariamente una serie de subproductos de la matanza tales como sangre,
huesos, pezuñas esto llega a representar caso el 40 % del peso del animal vivo muchos de los
mataderos tratan esto como un residuo industrial que se convierte en un potencial contaminante sobre
todo si se vierte en un ambiente acuático sin embargo esta puede ser aprovechada pues contiene hasta
un 70% de contenido proteico lo cual propicia el crecimiento de bacterias capaces de usarla como
sustrato (Zamora Rodriguez, 2003) entre otras bacterias. Las muestra de donde se puedan extraer
muestras con bacterias productoras de lipasas o que posean la capacidad de utilizar lípidos como
sustratos son generalmente aquellos que contribuyen a provocar alteraciones de sabor y olor por la
liberación de ácidos grasos libres este es característico por un olor fuertemente rancio a pesar de estar
en pequeñas en concentraciones delatando la presencia de bacterias psicrotróficas, así como hongos y
levaduras con actividades lipolíticas Las lipasas bacterianas termo estables son de particular interés,
debido a que alteran productos almacenados durante períodos largos, tales como queso y mantequilla
(V. Saturnino, 2006).
Método de aislamiento
Las muestras fueron sometidas al protocolo ya mencionado efectuando primero diluciones decimales
según la experiencia hasta 10-9 de los cuales se siembran los tubos -7, -8 , -9 para ambos casos pues el
método se base en una cantidad conocida de muestra, en dos medios de cultivo selectivo específico en
los cuales la actividad ya sea proteolítica o lipolíticas se va a ver evidenciada con la formación de un
halo claro producto de la hidrólisis por la actividad de las correspondientes enzimas.
Bacterias proteolíticas
La diluciones decimales fueron hechas en una solución salina (NaCl) al 8% para darle las condiciones
fisiológicas necesarias, sin embargo para aislar este tipo de bacterias con mayor efectividad se
recomienda un medio mucho más enriquecido y mayores cuidados como el utilizar el Caldo soya
tripticaseína e incubar para desestresar a las bacterias antes de realizar las diluciones en Buffer fosfato
(Speck, 1976), porque dando mayores cuidados se pueden tener mejores resultados.
Luego de realizar las diluciones se procede a estimar la actividad proteolítica en el medio tanto Agar
caseína como Agar leche, dos fuentes de proteínas con diferente estructura. Para el caso del Agar
caseína, siendo el suplemento un conjunto heterogéneo de aminoácidos y una proteína insoluble

10. opaca la constitución semi cristalina lo cual permite observar un halo en el caso las bacterias que
posean la enzima proteasa (Swaisgood, 1993), la caseína contenida en el agar precipitará dejando
como evidencia puntos blanquecinos dentro del halo, esto se puede observar en la réplica cultivada
por puntura. Las placas fueron incubadas a 30°C por 48h , sin embargo al tratarse del sustrato caseína
se recomienda la temperatura de 21°C por 72h (Speck, 1976) sin embargo el autor acota que según el
tipo de muestra a procesar esta temperatura puede variar .
Para el caso del Agar Leche este es ampliamente usado para la selección de microorganismos
productores de proteasas, preparado con leche descremada al 1% (Ramírez, 2009) .La capacidad
hidrolítica de las cepas se reconoció mediante la formación de halos traslúcidos alrededor de las
colonias puesto que la leche descremada posee caseína unida a Calcio en su estructura lo que impide
que precipite fácilmente, pero así como está la leche posee también muchas otras estructuras
proteicas que podrían ser aprovechadas por las bacterias con este tipo de actividad. Las placas fueron
incubadas a 30°C por 48h , la temperatura es adecuada pues se encuentra en el rango de 28-30°C y el
tiempo adecuado también (Ramírez, 2009)
Respecto al pH utilizado para ambas muestras se utilizó un Ph ligeramente básico (7.8) sin embargo
referencias plantean el pH alcalino de entre 9-12 para que las bacterias de efluentes de curtiembre se
desarrollen pues más del 75% de estas se desarrollaron con normalidad a estas condiciones de pH
(M.Alcarraz, 2012).
Bacterias lipolíticas
Las bacterias que realizan esta actividad posee lipasas cuyo el rol biológico consiste en iniciar el
metabolismo de las grasas y aceites reduciéndolos a ácidos grasos libres realmente metabolizables y
glicerol. Por esto el método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de
cultivo selectivo específico que contiene triglicéridos, aprovechando la capacidad de este grupo
microbiano de utilizar como nutrientes a los ácidos grasos mediante la lipólisis enzimática. Pues los
triglicéridos no se absorben intactos dentro de la célula, así que la hidrólisis inicial ocurre
extracelularmente. Por esta razón, las lipasas microbianas generalmente son excretadas por la célula, y
se encuentran como enzimas extracelulares lo que generan el halo traslucido que se espera ver
alrededor de la colonia.
Para esto se realizan las diluciones decimales en solución salina (NaCl) al 8% sin embargo se
recomienda nuevamente para evitar el estrés celular que genera la inactividad de ciertas bacterias
frente a su sustrato, el usar agua peptonada (V. Saturnino, 2006).
Las diluciones correspondientes son cultivadas en dos tipos de medio Agar Mantequilla y Agar Twenn
80 .Para el caso del agar suplementado con mantequilla es ampliamente usado desde los inicios de la
microbiología pues cuando las cadenas de triglicéridos que las conforman comienzan a romperse en
pequeños componentes como el ácido butírico y el di-acetil es cuando la mantequilla comienza a
ponerse rancia por lo que puede ser utilizado para el conteo de bacterias lipolíticas entre otros usos
(Olivas E and Alarcón, 2001) la mantequilla como medio genera en el agar pequeños glóbulos formados
de fosfolípidos y proteínas que proveen a la grasa de la leche una masa uniforme.
En el caso del medio Twenn 80 este medio esta conformado por un porcentaje de lecitina el cual es el
nombre común para un tipo de fosfolípidos la cual es una buena fuente de estos el cual es también

11. ampliamente usado en el “screening” de bacterias lipolíticas (Rivera, C y Garcia, F 2007) para mejor
resultados y la evidencia de un halo claro con mayor contraste entre el Medio y el halo es la utilización
del Agar Rojo Neutro o el Agar Tributirina que nos proporcionan una mejor evidencia del halo (V.
Saturnino, 2006). El medio contaba con un pH dado por la concentración de ácidos grasos , el pH para
este tipo de cultivos vira al acido gracias a la acumulación de ácidos grasos libres otra razón por la que
utilizar un tipo de tinción es ampliamente eficiente lo mismo es recomendable para el caso del Agar
Mantequilla ambas muestras fueron incubadas a 30°C por 48h en el caso de Agar Mantequilla según la
evidencia encontrada se recomienda que sea un poco mayo es decir a 35°C por el mismo tiempo (V.
Saturnino, 2006). En el caso del Medio Tween 80 se recomienda una temperatura superior de 55°C por
24h puesto que la temperatura ayuda a acelerar el metabolismo celular de estas bacterias y el halo se
hace más prominente (Jaeger,KE. 1999).
Respecto a la segunda experiencia (replica)
Después de haber obtenido un resultado desfavorable debido a sobrepoblación y a la contaminación
del cultivo debido a las condiciones ya presentadas de la muestra , se resolvió realizar una segunda
experiencia con algunas de las colonias que presentaba vestigios de halo tanto para lipolíticas como
para proteolíticas , así realizando el mismo protocolo cambiando solo el método de cultivo pues el
anterior fue realizado por diseminación y el de la segunda experiencia fue realizado por puntura se
puede observar un halo prominente alrededor de la colonia siendo estas las presuntas bacterias de
interés por fin aisladas .
CONCLUSIÓNES
Los resultados de las estrategias de cultivo usadas en este estudio enfatizan la importancia de la
optimización del medio para ganar la máxima eficiencia de aislamiento de microorganismos

12. BIBLIOGRAFÍA
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Panamericana. 1983.
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Doctorado. Universidad de Gerona, Departamento de Ingeniería Química Agraria y Tecnología
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