colera

1. bacteria ambiental con diferentes tipos de vidaVibrio cholerae :
Carlos A. Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado, Maritoña
Ramírez, Jorge M. Villaseca y Alejandro Cravioto.
1. Introducción
En 1965 Véron propuso crear la familia Vibrionaceae, en dicha propuesta consideró agrupar aquellos
géneros cuyas especies fueran oxidasa positiva y móviles por un flagelo polar. La familia está
constituida por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio incluye
35 especies de las cuales 26 se han identificado como agentes etiológicos de enfermedad en humanos,
de éstos Vibrio cholerae es una de las especies con mayor importancia clínica y epidemiológica (1).
Los vibrios son proteobacterias-gama, heterótrofas, cuyo hábitat primario son los ecosistemas
acuáticos salobres y marinos, en donde ocupan una gran diversidad de nichos. Están presentes en la
columna de agua y en el sedimento, por lo que se les puede encontrar como bacterias de vida libre,
comensales, saprobias o parásitas (2). Las bacterias de este género son bacilos curvos o rectos, Gram
negativos, anaerobios facultativos, móviles por flagelos polares y no esporulados. Para estimular el
crecimiento de Vibrio spp. se requiere de 5 a 15 mM de NaCl. Sin embargo, V. cholerae puede crecer
sin la adición de NaCl al medio y a un pH alcalino (10-6.0), menor de 6.0 el crecimiento es inhibido
(3).
2. Comportamiento de Vibrio en estado de vida libre
Cuando los vibrios se encuentran en su forma de estado libre (planctónica) nos queda claro que las
condiciones en este hábitat son extremas, ya que el material suspendido en la columna de agua, así
como el contenido de nutrimentos en general es bajo(4). En tal situación adopta una condición
morfológica diferente a la que conocemos, disminuye su tamaño (pueden pasar filtros de hasta 0.2
?m) por lo que en este estado se denominan microvibrios (5).
Diversos estudios señalan que los vibrios tienen preferencia por los ecosistemas acuáticos como
epibionte, asociado tanto a sustratos vivos como abióticos. Su asociación con material suspendido les
asegura que en algún momento pueden ser depositados en el sedimento donde encontrarán mayor
concentración de nutrimentos, por otro lado también se pueden mover hacia niveles superiores a
través de la cadena alimentaria iniciando su viaje con organismos bentónicos filtradores y detritívoros
(6). Se sabe que los vibrios pueden adherirse a diversos organismos acuáticos, V. cholera, por
ejemplo, se asocia con copépodos del plancton, otros del zooplancton, raíces de lirio acuático, algas
etc. (7). También se ha observado que la bacteria sobrevive y crece en dos especies de amibas de
agua dulce.

2. Figura1. Mecanismos de supervivencia de Vibrio cholera en zonas estuarinas.
La adherencia de los vibrios a los sustratos bióticos se considera como una interacción de tipo
comensal, en este caso las bacterias utilizan compuestos de excreción como las llamadas proteínas de
adhesión asociadas a la superficie. Durante este proceso es importante considerar propiedades como la
producción de enzimas como la quinolasa que le confiere a la bacteria la capacidad para actuar como
degradador de la quitina (8,9). Este polímero es muy abundante en los sistemas salobres y marinos,
ya que forma parte del exoesqueleto de crustáceos como la jaiba y el camarón, por lo que representa
una fuente muy rica de carbono y nitrógeno.
3. Vibrio microorganismo patógeno en su hábitat
Es importante analizar los casos en que los vibrios pueden actuar como patógenos de organismos
acuáticos de importancia comercial, o bien que estos organismos puedan ser un vector de patógenos
para el hombre. Al respecto se ha estudiado la relación entre Vibrio y los copépodos, por un lado la
bacteria utiliza la quitina de estos últimos como sustrato y por otro, dado que uno de los sitios de
colonización es el saco ovígero, cuando el copépodo libera los huevos fertilizados al ambiente estos se
constituyen en un vehículo para la diseminación de los vibrios (7).
Con respecto a su participación como patógeno, se ha reportado que V. anguillarum, V. alginoliticus y
V. splendidus son responsables de ocasionar la muerte de larvas de ostión. Se ha estudiado el posible
mecanismo por el cual colonizan y producen la muerte de dichas larvas, los resultados señalan que un
estado de estrés del hospedero da lugar a una respuesta neuroendócrina que incrementa los niveles de
noradrenalina induciendo la liberación de hierro, elemento importante para la reproducción de los
vibrios (10). Se ha establecido que ciertos factores ambientales afectan el comportamiento de la
bacteria, diversos estudios muestran como el incremento de la temperatura influye en el
comportamiento patógeno de diferentes especies de Vibrio sobre ciertos organismos acuáticos (11).
V. coralliilyticus : Pocillopora damicornis
V. splendidus : larvas Crassostrea gigas
V. carcharine : Haliotus tuberculata
V. vullneficus: Angulla anguilla
V. peneaicida : camaron
V. parahaemolyticus: peces

3. 4. Transmisión de Vibrio al humano
Los organismos acuáticos, principalmente los bentónicos filtradores que se consumen crudos, pueden
ser vectores de vibrios patógenos para el hombre. En las costas del Golfo de México V. vulnificus
alcanza concentraciones de hasta 105 UFC g-1 de ostión, con temperaturas >20 ?C y salinidades de 5
a 20 %. En el Pacífico noroeste de Estados Unidos al registrase un incremento de temperatura entre 1-
5 ?C asociados a “El Niño” se produjeron altos niveles de V. parahaemolyticus en ostión (11000 UFC g-
1), un evento similar se reportó para la bahía de Galveston, Texas (12).
Figura 2. Comportamiento biológico de Vibrio, mecanismos de transmisión al humano y al ambiente
acuático.
5. Vibrio cholerae bacteria con habitat primario acuático, patógeno de humanos
En 1935 Gardner y Venkatraman hicieron la primera clasificación de Vibrio cholerae basándose en las
características del antígeno somático (O), asignándose el serogrupo O1 al agente causal del cólera. V.
cholerae también expresa un antígeno flagelar (antígeno H), el cual es igual en todos los miembros de
la especie. Dentro del serogrupo O1, existen tres variedades antigénicas o serotipos (basados en las
diferencias de los componentes del polisacárido del antígeno somático) designadas como Ogawa, Inaba
e Hikojima según su formula antigénica AB, AC y ABC respectivamente. Vibrio cholerae O1 además se
divide en dos biotipos: Clásico y El Tor, que difieren entre sí por pruebas de hemoaglutinación de
eritrocitos de pollo, hemólisis de eritrocitos de carnero, sensibilidad a los bacteriófagos IV (Clásico) y
(V) El Tor, la reacción de Voges–Proskauer (VP) y susceptibilidad a la polimixina B (3).
Los Vibrios que no aglutinan con el suero anti O1 se denominan genéricamente como no-O1 o no
aglutinables (NAG). En 1994 el esquema de tipificación por serología reconocía hasta el serogrupo
O140, en estos se incluían dos particularmente importantes, O139 (“Bengal”), causante de una
epidemia parecida al cólera en el sureste asiático a finales de 1992 y el serogrupo O140 ó “Hakata”, el
cual posee solamente el factor antigénico C (presente en serotipo Inaba), pero carece del factor A, el
cual es específico para el Vibrio cholerae O1, el esquema actual incluye aproximadamente 200
diferentes variedades antigénicas (13).
La diseminación de la enfermedad en India y Bangladesh causada por el serotipo O139 o “Bengal”,
marcó por primera vez que una cepa de Vibrio cholerae no-O1 haya sido asociada a grandes epidemias
(14), aunque continúa estando confinada al Sur-Este Asiático. Vibrio cholerae O139 es responsable de
aproximadamente el 15% de los casos de cólera confirmados en uno de los países endémicos de Asia
(15, 16).

4. 6. Vibrio cholerae bacteria adaptada para sobrevivir en hábitats distintos
El comportamiento epidémico de V. cholera, en su estadio de patógeno del humano, se ha asociado
con los florecimientos de plancton, componente biótico del ambiente acuático que le permite
mantenerse y reproducirse. Durante su estancia en su habitat primario, la bacteria presentan gran
capacidad para responder a cambios ambientales como la temperatura y salinidad, variaciones
cualitativas y cuantitativas de nutrimentos, presencia de depredadores y/o competidores, así como de
la existencia de tóxicos tanto antropogénicos como biogénicos. La propiedad que ha desarrollado el
género Vibrio para detectar y responder ante situaciones emergentes es de gran importancia para su
supervivencia y transmisión. Diferentes estudios han conducido a la identificación de algunos
mecanismos con los cuales la bacteria puede sobrevivir en situaciones extremas (17,18).
Cambios morfológicos ante la disminución de nutrimentos
El proceso que adoptan las bacterias ante la falta de un sustrato generador de energía es denominado
“latencia”. En este estado los vibrios cambian su morfología y adoptan una forma de coco, perdiendo
casi el 90% de su volumen original. Pierden la integridad de las capas externa, peptidoglican, e
interna, reteniendo solo algunos remanentes, por otro lado, comprimen el material nuclear
centralizándolo en la célula y rodeándolo de un denso citoplasma. Se ha observado que estos cambios
están asociados a tasas metabólicas bajas, así mismo se ha demostrado que son reversibles,
recuperándose la bacteria cuando regresa a condiciones favorables (19).
Características externas de la bacteria y papel de un polisacárido extracelular
La alteración de las estructuras externas y la adhesión en esta etapa son de gran significado ecológico.
Se ha citado la presencia de formaciones fibrilares y un incremento en adhesión e hidrofobicidad. En la
respuesta a bajos niveles de nutrimentos se observó la presencia de un polisacárido extracelular
amorfo, observándose que este material le confiere carácter rugoso a sus colonias, además de
resistencia a cambios osmóticos y de estrés oxidativo. Las formas rugosas forman además una matriz
denominada zooglea la cual promueve la agregación celular. Bajo esta situación los vibrios forman
biopelículas en las cuales las bacterias pueden atrapar y adsorber nutrimentos y protegerse de los
depredadores. Se ha observado en V. cholerae una preferencia para formar éstas biopeliculas sobre
sustratos quitinosos, vainas mucilaginosas de las algas y copépodos. A través de la biopelícula las
células están interconectas por medio de prolongaciones que constituyen un glicocalix que se extiende
desde el sustrato hasta la parte externa de la biopelícula (20,21,22).
Latente y no cultivable
Es un estado en que las bacterias ante un estrés son metabólicamente activas pero no capaces de
llevar a cabo división celular. Por el hecho de no poder cultivarlas en medios artificiales a tal estado se
le ha denominado viable no cultivable (VBNC). Se ha propuesto que esta etapa de la bacteria da lugar
a su aparición cíclica, por lo que las bacterias desaparecen en ciertas épocas del año mientras que en
otros aparecen. Esta condición se ha visto asociada a una reducción de nutrimentos, elevada salinidad
o disminución de la temperatura (19,23).
7. V. cholerae, bacteria con dos cromosomas y diferentes estilos de vida
Diversos estudios señalan como algunos miembros del género Vibrio influyen de manera importante en
diferentes ciclos biológicos del ambiente marino. Se ha encontrado que varias especies del mismo

5. género son patógenos importantes para peces, moluscos y mamíferos. Con respecto a V. cholerae aún
se tiene poca información sobre su ecología, la historia natural de la bacteria, incluyendo su presencia
como organismo autóctono en áreas endémicas durante periodos libres de cólera, la existencia de ésta
en periodos inter-epidémicos, los factores ambientales que contribuyeron a su re-emergencia en
América Latina (24), así como a los componentes ambientales que contribuyen a su permanencia en
regiones endémicas de cólera.
En años recientes se encontró que el genoma de V. cholerae y otros integrantes del mismo género,
presenta 4,033460 pares de bases (pb), éste esta constituido por dos cromosomas circulares (25) de
2,961146 pb (cromosoma 1) y 1,072314 pb (cromosoma 2). En conjunto ambos codifican para 3,885
marcos de lectura abierta. La mayoría de los genes que son esenciales para las funciones básicas de la
bacteria (replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de la pared celular), así como de
patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan en el cromosoma mayor. Por otro lado, el cromosoma
pequeño contiene 59% de genes hipotéticos, mientras que en el mayor el 42% de estos no tiene una
función conocida. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y viabilidad de la bacteria
están ubicados en el cromosoma 1 aunque también, y solo presentes en el cromosoma 2, hay genes
que pueden ser esenciales para el funcionamiento normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican
para las proteínas ribosomales L20 y L35 y otros que codifican para diferentes intermediarios de rutas
metabólicas).
La secuencia del genoma de V. cholerae permitió confirmar la presencia de un sistema de captura de
genes (isla de integración) localizado en el cromosoma 2 (125.3 kbp). Entre los genes presentes en
esta isla se encuentran tres que codifican para productos involucrados en la resistencia a los
antimicrobianos (cloramfenicol, acetiltransferasa, proteina para resistencia a la fosfomiocina y la
glutation transferasa), varias enzimas del metabolismo del ADN (MutT, transposasa y una integrasa),
genes de virulencia (hemaglutininas y lipoproteinas) así como tres genes que codifican para productos
similares a las proteínas de `adicción del hospedero” (higA, higB y doc), los cuales son utilizados por
los plásmidos para selección y mantenimiento en las células del hospedero.
El análisis de la secuencia del genoma de V. cholerae mostró que la mayoría de los genes presentaban
gran similitud con los de E. coli (1,454 MLA (Marcos de lectura abierta)). También se encontró que 499
(12.8%) de los MLA tenían alta similitud con otros genes, lo cual sugiere la existencia de duplicaciones
recientes. La mayoría de los MLA duplicados codifican para productos involucrados en funciones de
regulación, quimiotaxis, transportes y adherencia, transposición y patogenicidad. De un total de
aproximadamente 105 duplicaciones, por lo menos un MLA se encuentra en cada cromosoma lo que
sugiere que se han presentado entrecruzamientos recientes entre ambos cromosomas. La extensa
duplicación de genes involucrados principalmente en mantener la homeostasis de la bacteria
(quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la importancia de los productos de estos genes en la
biología de V. cholerae, principalmente en relación a su capacidad para habitar diversos ambientes. Es
probable que dichos ambientes en los que habita la bacteria, condujeron la duplicación y divergencia
de los genes que son utilizados para funciones específicas. Al respecto se considera que los genes de
virulencia están sujetos a presión selectiva, lo cual afecta el número de copias y su localización sobre
el cromosoma. La existencia de varios MLA con funciones aparentemente idénticas en ambos
cromosomas, sugiere la participación de transferencia lateral de genes y eventos de transposición (26).
La estructura de dos cromosomas se ha encontrado en otras especies del género Vibrio, este hecho
sugiere que el contenido de genes del megaplásmido confiere a la bacteria una ventaja evolutiva,
principalmente dentro del ecosistema acuático en donde las diferentes especies de Vibrio son los
microorganismos dominantes. El porque el cromosoma 2 no se ha integrado en el cromosoma mayor
no esta claro, se sugiere que tiene funciones especializadas importantes para la presión selectiva en la
evolución. Una de ellas podría ser el haber acumulado genes que son mejor expresados a un alto o
bajo número de copias que los ubicados sobre el cromosoma 1. Otra posibilidad es que en respuesta a
alteraciones del ambiente solo uno de los cromosomas se transfiera a las células hijas (segregación
aberrante). Aunque estas células con un solo cromosoma pueden ser defectuosas para su replicación
(células latentes) mantienen su actividad metabólica y por lo tanto pueden ser una fuente potencial de
las formas viables pero no cultivables (VBNC) descritas en V. cholerae (23) y otras bacterias. Las
bacterias en estado de latencia también pueden jugar un papel en la formación de biocapas (biofilms)
produciendo quitinasa extracelular, proteasas y otras enzimas degradantes que favorecen la
supervivencia de la bacteria en la biocapa (22).

6. 8. Transporte y metabolismo energético.
V. cholerae puede vivir en diversos hábitats, incluyendo su asociación con zooplancton, puede adquirir
la forma planctónica en la columna de agua, así como patógena en el tracto gastrointestinal del
humano. Por lo que no es sorprendente que la bacteria posea un gran repertorio de proteínas con
enorme especificidad de substratos, mismas que le permitan realizar diferentes funciones catabólicas
que respondan eficientemente a los constantes cambios en los ecosistemas (27). Los genes que
codifican para las enzimas que realizan el transporte y/o degradación de diferentes substratos se
localizan en ambos cromosomas (ribosa y lactato en el cromosoma 2 y trealosa en el 1). Sin embargo,
muchas otras funciones metabólicas se realizan por genes de ambos cromosomas (glicólisis).
En el ambiente acuático, la quitina representa una fuente de carbono y nitrógeno. Esta fuente de
energía es importante para V. Cholerae cuando esta asociado con el zooplancton, el cual tiene un
exoesqueleto quitinoso (27,28). Para el transporte de molibdeno, fosfato y sulfato existen genes en
uno o ambos cromosomas. Los involucrados en el transporte del molibdeno se localizan en el
cromosoma pequeño, y los encargados del transporte del sulfato se encuentran en el cromosoma
mayor. Sin embargo, en ambos cromosomas existen copias de los genes para los transportadores del
fosfato, los cuales son diferentes en cada cromosoma indicando que no son consecuencia de una
duplicación reciente.
9. Regulación intercromosomal
Las vías de regulación activadas en respuesta a señales ambientales y patogénicas se codifican entre
los dos cromosomas. Lo anterior incluye procesos para la supervivencia durante periodos de inanición,
censo por mayoría (quórum sensing) y expresión de la hemolisina (HlyA). En los periodos de carencia
de nutrimentos, V. cholerae y otras bacterias Gram-negativas entran inicialmente en una fase
estacionaria y posteriormente al estado VBNC. El factor sigma j38 (rpoS) es importante para la
supervivencia de V. cholerae pero no para su patogenicidad, sugiriendo que dicho factor tiene una
función muy importante en la iniciación del estado VBNC. Existe una copia de rpoS, localizada en el
cromosoma 1, cerca de oriC RpoS que regula la expresión de proteínas como la catalasa, ciclopropano-
graso-acil-fosfolípido sintetasa y HA/proteasa, las cuales se encuentran en ambos cromosomas. Los
genes implicados en „quorum sensing‟, regulación dependiente de la densidad celular, se encuentran
también sobre ambos cromosomas. El conocimiento de la secuencia del genóma de V. cholerae está
permitiendo entender, de manera más clara, cómo una bacteria de vida libre emerge como patógeno
de enormes consecuencias para el humano.
10. Genes implicados en la virulencia de V. cholerae
El proceso infeccioso causado por V. cholerae es bastante complejo e involucra un gran número de
factores; este patógeno se ayuda de ellos para establecerse y colonizar el epitelio intestinal, para lo
cual expresa varios factores de colonización así como varias potentes enterotoxinas. Los genes cuyos
productos actúan como factores de virulencia se encuentran formando parte de agrupamientos
("clusters"). Anteriormente se creía que estos genes formaban parte del cromosoma bacteriano de las
cepas toxigénicas, pero actualmente se sabe que estos son parte del genoma de fagos de tipo
filamentoso (29,30).
11. Toxinas y factores de colonización de V. cholerae
Una vez que la bacteria se instala en el epitelio intestinal empieza a producir la toxina colérica o CT, la
cual altera el transporte de iones ocasionando la diarrea de tipo secretor que caracteriza el cuadro
clínico del cólera. Los genes que codifican CT (ctxA y ctxB) forman parte de un elemento genético
denominado elemento genético CTX (31, 32), el cual consiste por lo menos de seis genes que integran
la región del core (ctxA, ctxB, zot, ace, cep y orfU), los cuales están flanqueados por dos o más copias
de una secuencia repetitiva (Figura 3).

7. Se han identificado en cepas de V. cholerae otras toxinas importantes, una de ellas llamada Zot
(Zonula Ocludens Toxin) tiene actividad sobre las uniones estrechas, incrementando la permeabilidad
de la mucosa intestinal. Otra más es la toxina Ace (Accesory cholera toxin), ésta es una potente toxina
que ocasiona daño a nivel de membrana en la célula eucariota, originando desequilibrio iónico. Aunque
CT es el principal factor de virulencia, su acción es incrementada por el producto de diferentes genes,
entre los que se encuentran los agrupamientos o clusters TCP (toxin corregulated pilus) y ACF
(accesory colonization factors), cuyos productos actúan como factores de colonización. Ambos clusters
se encuentran formando parte de lo que anteriormente se reportó como la isla de patogenicidad (VPI)
(31,33).
12. CTX?, características y función en la transferencia de genes de virulencia
En 1996 usando la cepa de V. cholerae O1 P27459 (modificada genéticamente por un marcador y
renombrada SM44) se demostró que el elemento CTX constituye en realidad el genoma de un fago
filamentoso (CTX?). El fago puede propagarse en cepas receptoras de V. cholerae, en las cuales el
genoma de CTX? puede integrarse al cromosoma en sitios específicos, o bien mantenerse en forma de
plásmidos . Este fago filamentoso es de ADN de cadena positiva y está compuesto por una región de
4.5 kb llamada central o core (elemento CTX) la cual esta formada por seis genes (29):
ctxA-ctxB: codifican para la subunidad A y B de la toxina de cólera respectivamente.
zot: codifica para la toxina zonula occludens.
cep: codifica para la llamada pilina codificada en el core.
ace: codifica para la enterotoxina accesoria del cólera.
orfU: codifica un producto de función desconocida.
Figura 3. Representación gráfica del fago CTX
La liberación de CTX?, al igual que en otros fagos filamentosos, puede inducirse con luz ultravioleta o
con mitomicina C (34). Una característica observada en este fago es que pude insertarse a una
secuencia de 18 pb denominada attRS (sitio de ligamiento), presente en el cromosoma de algunas
cepas de V. cholerae, o bien no integrarse y comportarse como un plásmido.
La parte central (core) se encuentra flanqueada por una o más copias de la región llamada RS, esta es
una secuencia de repetidos que se ha dividido en RS1 y RS2 de 2.7 y 2.4 kb respectivamente. Esta
región codifica para un sistema de integración sitio específico, presentando por lo menos 4 MLA. Se ha
observado duplicación en tándem del RS y en algunas de todo el elemento CTX. Kimsey y col. (35)
encontraron que RS1 y RS2 presentan diferencias en sus secuencias, lo que conlleva a diferencias
funcionales entre los profagos encontrados en las cepas Clásica y El Tor. En las cepas de V. cholerae
O1 del biotipo Clásico hay una copia del profago CTX en cada uno de los dos cromosomas; mientras
que en las cepas del biotipo El Tor el profago está arreglado en tándem en los dos cromosomas. En las
cepas El Tor el genoma del fago a menudo se encuentra flanqueado por una copia adicional de RS1,
ésta contiene genes adicionales a RS2 (34,35).

8. 13. VPI?, características y funciones
Para la introducción de CTX? en las cepas de V. cholerae es necesaria la presencia de TCP, que como
ya se mencionó es un componente necesario para la colonización intestinal. Recientemente se ha
propuesto que TCP también es codificado por un fago filamentoso denominado VPI? (30). El fago
filamentoso VPI? codifica para TCP (Figura 4), el cual es un importante factor de virulencia así como
receptor del fago CTX?. Al igual que CTX?, VPI? posee DNA de cadena sencilla y positiva, el genoma de
este fago contiene los clusters TCP y ACF, los cuales contienen genes cuyos productos actúan como
importantes factores de virulencia.
En ensayos realizados con anticuerpos anti-TCP se encontró que ésta es la principal proteína de
cubierta del fago VPI?). VPI?, al igual que CTX?, reconoce una secuencia de inserción (att). Otros
genes que conforman el genoma del fago son:
tagA: codifica para una lipoproteína.
aldA: al parecer codifica para una aldehido deshidrogenasa citoplásmica independiente de CoA, tagA y
AldA forman parte del grupo de genes bajo la regulación de ToxR.
Int: codifica para una integrasa.
toxT: forma parte del regulon Tox.
xtn, tagD, y ssrA: son genes cuyos productos son desconocidos.
Figura 4. Representación esquemática del fago TCP
14. Regulación en la expresión de los factores de virulencia
El hábitat natural de las cepas toxigénicas de V. cholerae comprende diferentes ambientes, uno lo
constituye el tracto digestivo del hospedero cuando la bacteria se comporta como patógeno; el otro es
el ambiente acuático cuando actúa como microorganismo de vida libre. El microambiente del tracto
intestinal provee las condiciones óptimas para la expresión de un gran número de factores asociados a
virulencia. CT, TCP y por lo menos otros 17 genes involucrados en el proceso de virulencia están bajo
el control de la cascada regulatoria ToxR-ToxT (36,37,38).
Al activarse ToxR sufre cambios conformacionales que dan como resultado la formación de dímeros
que son estabilizados por la proteína ToxS que activa la transcripción de los genes ctxA y ctxB. ToxR
además activa la transcripción del gen toxT, gen regulador que se encuentra en VPI y que es miembro
de la familia AraC. La expresión de CT y TCP, así como de otros factores de virulencia, difieren entre
las cepas de V. cholerae de los biotipos Clásico y El Tor, lo que ha sugerido la expresión diferencial del
regulón ToxR en los dos biotipos debida a un control biotipo específico sobre la expresión de toxT (39).
Los diferentes sistemas de regulación en V. cholerae conducen a una variación en la expresión de los
genes de virulencia optimizando su permanencia en diferentes ambientes tales como el intestino
humano y el hábitat marino.
15. Eventos involucrados en la generación de cepas epidémicas
Los mecanismos involucrados en la emergencia de nuevas clonas no han sido explicados, se considera
que la combinación entre cambios genéticos y la selección natural causada por factores ambientales no
identificados, así como el estado inmune de la población, influyen de manera importante en este
proceso. Además de determinar la importancia de los factores ambientales dentro de la ecología de V.
cholerae, se requiere conocer más con respecto a los mecanismos utilizados por los fagos filamentosos
(CTX? y VPI?) en la transferencia de genes de virulencia. La existencia de epidemias ocasionadas por

9. V. cholerae O139, de brotes debidos a cepas O37, así como el hallazgo de los genes ctxA, tcpA and
toxR en cepas no O1 ambientales, apoya la hipótesis de que la transferencia horizontal de CTX? puede
presentarse entre cepas O1 ctxA¯ tcpA+ o ctxA+ tcpA¯ y no-O1 ctxA+ or tcpA+, las cuales coexisten
en el ambiente acuático (40,41,42).
Se ha mencionado que la infección de V. cholerae por CTX?, requiere la presencia de TCP, por lo que se
propuso un sistema secuencial de dos pasos para la evolución de cepas epidémicas. Lo anterior sugiere
que las bacterias inicialmente tienen que adquirir TCP a través de la infección por VPI?, para
posteriormente ser infectadas por CTX?. Se sabe que los cultivos de V. cholerae que contienen al fago
en cualquiera de sus formas (lisógenos o plásmidos) producen altos títulos del fago en sus
sobrenadantes, por lo que la propagación del CTX? puede estar asociada con eventos de transferencia
horizontal dando lugar a nuevas cepas toxigénicas (42).
Estudios en nuestro laboratorio (datos no publicados) permitieron observar como el sobrenadante del
cultivo de la cepa epidémica O37 ctxAB+ tcpA+ toxR+ (aislada en Sudan en 1969) expuesto a la luz
solar durante varios minutos liberaba partículas de CTX?. Por otro lado, al incubar una cepa O1 El Tor
(2740-80) ctxAB¯ tcpA+ att+ con estos sobrenadantes, se encontró que se recuperaban lisógenos
2740-80 ctx+. Estos resultados sugieren que cepas de V. cholerae no-O1 ctxA+, pueden naturalmente
ser inducidas para liberar viriones CTX? y de la misma manera lisogenizar cepas O1 no toxigénicas.
Gracias a este tipo de mecanismos las propiedades de virulencia pueden evolucionar a grandes pasos a
través de la transferencia horizontal de grandes bloques de material genético más que a la
acumulación de mutaciones de nucleótidos. Estos eventos de transferencia horizontal de genes,
probablemente se presentan en la naturaleza y es así como contribuyen de manera importante en el
mantenimiento de las áreas endémicas de cólera.
16. Epidemiología
En enero de 1991, después de casi 100 años de no haber sido identificados brotes epidémicos de
cólera en el continente americano (con excepción de la costa del Golfo de México en los Estados
Unidos), se reportó la aparición de cólera epidémico en Perú relacionado con el aislamiento de una
cepa de V. cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Inaba (24). Al año siguiente, en 1992, se aisló una cepa
causante de un brote de cólera en Madrás y en otras ciudades de la India, la bacteria no era del
serogrupo O1 y fue clasificada como O139 (14). La aparición de un nuevo agente causal de un brote
con características epidémicas planteó la enorme posibilidad del surgimiento de nuevas cepas
epidémicas sugiriendo a su vez que el cólera no sólo se debía considerar como una enfermedad
reemergente, sino también emergente. Estos hallazgos dieron lugar a un nuevo enfoque sobre las
perspectivas para el estudio del cólera en el ámbito epidemiológico y molecular (15,16).
Epidemiología molecular del cólera
El conocimiento en la epidemiología del cólera tuvo un gran avance debido a las medidas de control de
la enfermedad y a los adelantos en la biología molecular. Los estudios epidemiológicos de vigilancia y
de tipificación molecular de Vibrio cholerae han permitido a su vez conocer mejor la evolución,
diseminación geográfica y perspectivas globales de la enfermedad.
En 1978 se presentó un primer brote de cólera a lo largo de la costa del Golfo de México en los Estados
Unidos, a este han seguido otros pequeños brotes de la enfermedad observados hasta fechas recientes
(43). Mediante técnicas de southern blot e hibridación, con sondas para la toxina colérica, se demostró
que los aislados de Vibrio cholerae O1 El Tor, obtenidos en dicha área, eran clonales y diferentes de los
vibrios aislados durante la séptima pandemia. Una situación similar se observó en Australia al analizar
cepas de Vibrio cholerae O1 aisladas de pacientes y del medio ambiente. En 1991, cuando el cólera
llegó a Latino América, se utilizaron diferentes técnicas de biología molecular así como el método de
enzimas multilocus (MLEE) para caracterizar las cepas causantes de la epidemia y definir la relación
genética entre éstas y las responsables de la séptima pandemia obtenidas en diferentes partes del
mundo. Los resultados obtenidos mostraron que los aislados de América Latina eran esencialmente
clonales y probablemente una variante de las pertenecientes a la séptima pandemia, pero diferentes a

10. las cepas de los brotes descritos en los Estados Unidos, a las aisladas en Australia y a cepas O1 no
toxigénicas identificadas en los años 80 en diferentes países de América Latina (24).
Un estudio realizado por Evins y cols (44), con una colección de cepas Vibrio cholerae O1 no
toxigénicas, O1 toxigénicas (aisladas desde el inicio de la epidemia en 1991) y variantes toxigénicas
del hemisferio occidental, mostró que por lo menos hubo dos cepas responsables del cólera en América
Latina. El origen de la cepa que ocasionó el nuevo brote de cólera en América es un misterio rodeado
de especulaciones. Se ha propuesto que el microorganismo fue importado por viajeros procedentes de
áreas donde el cólera es endémico, pero por otro lado también se sugiere que la bacteria era un
microorganismo de vida libre nativo de las costas de Perú, el cual emergió por efecto de algún factor
ambiental como un patógeno infeccioso con alto potencial epidémico.
En contraste con lo reportado anteriormente sobre las cepas de Vibrio cholerae O1, las cepas de Vibrio
cholerae no-O1 no presentaban importancia médica o epidemiológica ya que se creía que solo eran
responsables de casos esporádicos de diarrea en humanos. En octubre de 1992 un importante brote de
una enfermedad parecida al cólera, causada por un serogrupo de Vibrio cholerae no-O1, apareció en
India y Bangladesh y rápidamente se diseminó a Pakistán, Nepal, Tailandia, Malasia y China (14, 15).
Estudios serológicos identificaron a estas cepas con el serogrupo O139 con el sinónimo “Bengal” (lo
que indicó el lugar de aislamiento de las primeras cepas, las ciudades costeras de la bahía de Bengala).
Estas cepas producían cantidades similares de toxina colérica a las observadas con V. cholerae O1, por
otro lado también hibridizaban con sondas específicas para los genes ctxA y ctxB y las características
clínicas de la enfermedad causada por estas eran indistinguibles del cólera (16,45,46). Ensayos con el
método de enzimas multilocus demostraron que diferentes cepas de V. cholerae O139 aisladas en el
Sureste Asiático mostraban un perfil electroforético idéntico al del Vibrio cholerae O1 Ogawa biotipo El
Tor aislado en México durante la epidemia (47).
Resultados similares se obtuvieron al analizar cepas representativas del serogrupo O139, aisladas en
diferentes lugares del mundo desde su aparición en 1992, y compararlas con las de una colección de V.
cholerae O1, no-O1 y no-O139, aisladas entre 1969 y 1999. Lo anterior permitió sugerir que V.
cholerae O139 incluye cepas epidémicas y no epidémicas que evolucionaron de diferentes linajes y
derivan de V.cholerae O1 o no-O1 respectivamente. El análisis de 397 aislados de V. cholerae O1,
O139 y otros serogrupos no O1, mostró por un lado la diversidad genética de la bacteria y por otro la
relación genética entre las clonas epidémicas O1 y O139 y serogrupos no O1, así como su estructura
poblacional (48).
Los resultados mostraron además que las cepas O1 y O139, pandémicas junto con una clona del
serogrupo O37 (que en la década de 1960 demostró tener potencial epidémico), conforman un grupo
relacionado genéticamente, sugiriendo que estas clonas surgieron por modificación del linaje que ya
era epidémico o muy relacionado genéticamente al de las clonas epidémicas. La inferencia, por lo
menos en este grupo de cepas, es que la tasa de transferencia horizontal y/o eventos de
recombinación de genes del metabolismo básico son suficientemente altas para prevenir el desarrollo y
el mantenimiento a largo plazo de alelos distintivos. Aún así los linajes clonales que se observaron
pueden persistir por periodos largos de tiempo (hasta décadas), los ejemplos más obvios son las
clonas epidémicas y pandémicas O1 y O139, pero más aún, el análisis identificó numerosas clonas y
linajes clonales de cepas de V. cholerae no O1 con una extensa, distribución geográfica.
En estudios previos se demostró la existencia de recombinación de genes en la región rfb de V.
Cholera, hecho que sugiere la emergencia de nuevos serogrupos con potencial epidémico. En un
estudio realizado en México utilizando el método de enzimas multilocus para determinar el origen
clonal de las cepas estudiadas (48), mostró que las cepas con un mismo serogrupo frecuentemente
son divergentes y genéticamente distantes, lo cual apoya la evidencia anterior de que los genes rfb
están sujetos a una alta frecuencia de recombinación. Estos resultados y el que los genes que codifican
para los principales factores de virulencia se pueden adquirir por transferencia horizontal apoyan la
propuesta de que cualquier V. cholerae se puede transformar en una cepa virulenta y epidémica.
Aunque el conocimiento que se tiene sobre los integrantes del genero Vibrio se ha incrementado
ampliamente en los últimos años, aún existen muchas interrogantes para poder controlar y erradicar
su participación como patógenos del hombre.
17. Referencias

11. RESUMEN
El Colera es una diarrea infecciosa aguda producida por Vibrio cholerae. La transmision se produce
predominantemente a traves de agua o alimentos contaminados. La administracion de antibioticos
puede disminuir la severidad de los sintomas. A partir de 1977, se han caracterizado cepas de
V.cholerae O1 con resistencia multiple a los antibioticos. Los determinantes de resistencia han sido
reportados principalmente asociados a plasmidos e integrones. Historicamente, solo las cepas del
serogrupo O1 habian sido asociadas con epidemias de Colera. En 1992, un nuevo serogrupo, O139,
emergio como la cepa causante de un gran brote de Colera. La diarrea masiva es causada por la toxina
colerica (CT). El operon que codifica CT forma parte del genoma de un bacteriofago lisogenizado en la
bacteria el cual permite interconversion de cepas. Se ha demostrado que el "quorum-sensing" regula
negativamente la expresion de los genes de viru len cia en V. cholerae. El genoma de V. cholerae El
Tor consiste en dos cromosomas circulares y con una pronunciada asimetria en la distribucion de los
genes, en el cual se han detectado varias islas patogenicas (PAIs). Se ha reportado la existencia de
V.cholerae "viable no cultivable" en ambientes acuaticos. Este fenomeno representa una nueva
perspectiva en la vision de la "sobrevivencia" de V.cholerae en el ambiente e incorpora nuevas
implicaciones epidemiologicas. El Colera ha sido catalogado como una "enfermedad emergente y
reemergente", que amenaza a los paises en desarrollo. Los resultados de distintos grupos de
investigadores han establecido que la transferencia horizontal de genes tiene influencia en la
patogenicidad y ha sido importante en la evolucion de V. cholerae. Todavia permanecen sin descifrar
algunos misterios en el origen de las cepas patogenas, pero, con las nuevas tecnologias seguro se
develaran datos significativos que puedan dar luces sobre el origen de la patogenicidad de este
organismo, que fue en un principio una bacteria inocua de estuario.
Palabras clave: Colera, Vibrio cholerae, Colera/metabo - lismo, Colera Toxina/ fisiologia,
Colera/Quorum-sensing, Colera/epidemiologia/ epidemiologia molecular, Vibrio cho
lerae/patogenicidad/fisiologia, Factores de Virulencia.
Cholera and Vibrio cholerae
ABSTRACT
The Cholera is an acute infectious diarrhea produced by Vibrio cholerae. Mainly the transmission takes
place through contaminated water or foods. Antibiotic administration during the acute phase of the
disease can reduce the severity of the symptoms. Since 1977, strains of V. cho lerae O1 with multiple
antibiotic resistances have been characterized. The resistance determinants have been reported mainly
associated to plasmids and integrones. Historically, the serogrupo O1 had been associated with
epidemics of Cholera. In 1992, a new serogrupo, designated O139, emerged as the strain of cause
from a big Cholera outbreak. The massive diarrhea is caused by the choleric toxin (CT). Operon ctxAB,
that codifies the CT, is carried in lisogenic filamentous bacteriophage in the bacterium. "Quorum-
sensing" negatively regulates the expression of the virulence genes in V.cholerae. The genome of
V.cholerae El Tor consists of two circular chromosomes with a pronounced asymmetry in the
distribution of the genes. Several patogenics islands (PAIs) have been detected in the genome of
V.cholerae. In aquatic environments the existence of "viable but non cultivable" V.cholerae, has been
reported. This phenomenon represents a new perspective in the role in survival in the natural
environment with new epidemiological implications. The Cho lera has been catalogued as an
"emergent, re-emergent disease" that threatens developing countries. The results of different
investigators groups have established that horizontal transference of genes had influence in the
pathogenicity and has been important in the evolution of V.cholerae. Several mysteries in the origin of
the pathogenics clones still remain, but, the new technologies will reveal significant data about the
origin of this pathogen, former an estuary innocuous bacterium.
Keywords: Cholera, Vibrio cholerae, Cholera/metabolism, Cholera Toxin/pharmacology/*physiology,
Cholera/Quorum-sensing, Cholera/epidemiology/molecular epidemiology, Vibrio
cholerae/pathogenicity/physiology, Virulence Factors.
Recibido: 25 de junio de 2008 / Aprobado: 21 de septiembre de 2008
El Colera es una enfermedad infecciosa aguda. La etiologia bacteriana del Colera fue confirmada por
Robert Koch en 1833, cuando aislo el "bacillus cholera" del agua durante un brote de Colera en Egipto
(1). Durante el siglo XIX, se propagaron verdaderas oleadas de epidemias de Colera desde el sur de

12. Asia a muchas partes del mundo (2). En 1817 se inicia la primera pandemia de Colera fuera de Asia.
Desde entonces, se han producido 7 pandemias, la septima comenzo en Indonesia en 1961, desde
donde se propago rapidamente al este de Asia, en 1970 llego a Africa, y en 1991 a America (3). El
Colera fue la primera enfermedad para la cual se establecio un sistema de vigilancia y reporte a gran
escala.
TRANSMISIÓN Y CARACTERISTICAS CLINICAS DEL CÓLERA
La transmision del Colera se produce predominantemente a traves de agua o alimentos contaminados
con materia fecal. La transmision de persona a persona es extremadamente rara, probablemente
debido a que el inoculo necesario para causar la enfermedad es alto (4). El cuadro clasico de Colera se
caracteriza por desarrollar bruscamente una intensa diarrea acuosa, habitualmente indolora y con
vomitos. Son heces muy liquidas, con presencia de mucosidad pero sin sangre, adquiriendo un aspecto
caracteristico que comunmente se les denomina "heces de agua de arroz", lo cual produce una
disminucion del volumen sanguineo circulante, acidosis metabolica, agotamiento del potasio y, en
ultimo termino, puede provocar colapso vascular y muerte (5). No todas las personas que se infectan
desarrollan el cuadro clasico de Colera, las infecciones pueden ser asintomaticas hasta en un 75% de
los pacientes. El tratamiento principal para el Colera es la rehidratacion oral o intravenosa (4). Cuando
ocurren brotes epi demicos, la administracion de antibioticos durante la fase aguda de la enfermedad
puede disminuir la severidad de los sintomas, asi como la cantidad y tiempo de excrecion del
microorganismo (6). La tetraciclina fue el primer antibiotico utilizado en el tratamiento, pero tambien
se han suministrado furazolidona, eritromicina, cotrimoxazol, cloranfenicol o norfloxacina (7).
RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS EN V. CHOlERAE
Por mucho tiempo no se reporto resistencia clinicamente significativa en Colera, pero en 1977, se
caracterizaron cepas de V. cholerae O1 El Tor con resistencia multiple a los antibioticos (8), y en
algunos casos se demostro que estaba mediada por plasmidos (9, 10). Existen evidencias que sugieren
que la resistencia a los antibioticos de primera linea fue uno de los factores que contribuyo en la alta
tasa de mortalidad durante la epidemia de Colera en zaire, en 1994, asi como, el incremento de la tasa
de mortalidad durante la epidemia de Guinea-Bissau durante 1996-1997 (11, 12). Los patrones de
resistencia varian dependiendo de la region, de los patrones de uso de los antibioticos y de la fecha del
analisis. Se han reportado cepas de V. cholerae resistente a antibioticos en Argentina, Ecuador,
Mexico, Gua temala y Brasil (13-15). En Venezuela, los aislamientos de V. cholerae desde 1991 hasta
1993 eran sensibles a todos los antibioticos ensayados. A partir del ano 1997, se empezaron a
registrar las primeras cepas con resistencia a algun antibiotico. En el brote 1998-1999 se detectaron
las primeras cepas con multirresistencia (16).
MECANISMOS GENÉTICOS qUE MEDIAN LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
Entre los principales vehiculos para la diseminacion y la adquisicion de nuevos genes que codifican
proteinas que confieren resistencia destacan, los plasmidos, los integrones y los transposones
conjugativos. Los plasmidos son elementos de ADN extracromosomicos, que codifican diversos rasgos
fenotipicos y que pueden ser movilizados por conjugacion entre celulas bacterianas. En V. cholerae, los
determinantes de resistencia han sido reportados principalmente asociados a plasmidos (12, 17, 18).
Estos plasmidos por lo general son gran des, entre 110-170 kb y auto transferibles. Se han reportado
plasmidos que portan los genes que codifican la resistencia hasta siete determinantes de resistencia en
un solo plasmido (17).
Los integrones son elementos geneticos que ad - quieren por mecanismos de recombinacion especifica,
segmentos de DNA exogeno, conocidos como casetes genicos, que usualmente codifican para la
resistencia a antibiotico (19). Existen los integrones de multiple resistencia, los cuales contienen varias
combinaciones de casetes genicos de resistencia a antibioticos y han sido reportados en cepas de V.
cholerae multirresistentes (12, 18, 20-22). Recientemente, ha sido demostrado en V. cholerae, un
nuevo tipo de integron, llamado superintegron, de 126 kb, que tiene 179 casetes genicos en una sola
estructura (23). Los integrones no son auto transferibles, pero se pueden encontrar en plasmidos
conjugativos, asegurando su movilidad (12).
Historicamente, solo las cepas de V. cholerae que pertenecian al serogrupo O1 habian sido asociadas
con epidemias de Colera. Sin embargo, en septiembre de 1992 en Bangladesh, un nuevo serogrupo,
designado O139, emergio como la cepa causante de un gran brote de Colera. Esta cepa de V. cholerae
O139 tenia un pa - tron de resistencia diferente a la cepa de V. choleare O1, era resistente a

13. sulfametoxazole, trimetoprim, cloranfenicol y a niveles bajos de estreptomicina. La resistencia que
mostraba esta cepa esta codificada en un elemento genetico integrado al cromosoma, auto
transferible, de aproximadamente 62 kb, que es similar a los transposones conjugativos, al cual se le
denomino elemento SXT (24). El elemento SXT codifica una integrasa que media su propia integracion
y escision (25). Cuando en 1994 re-emergio la cepa V. cholerae O1 El Tor como la cepa pre dominante
en Asia, esta cepa fue resistente a sulfametoxazole, trimetoprim, cloranfenicol y estreptomicina y los
genes que le conferian esta resistencia se encontraron en un elemento SXT relacionado con el
encontrado en la cepa O139 (26). Los aislamientos mas recientes de V. cholerae O139 en la India,
perdieron la resistencia a sulfametoxazole y trimetoprim (27). La gran mayoria de los aislamientos
clinicos de V. cholerae O1 y O139 de Asia, posteriores a 1993, contienen un elemento SXT relacionado
integrado al cromosoma (28).
CARACTERISTICAS DEL GÉNERO VIBRIO
Actualmente, se reconocen 78 especies de Vibrios distribuidas en cinco grupos; Vibrio, Photobacterium,
Sa linivibrio, Enterovibrio y Grimontia (29-31). Las es - pecies del genero Vibrio son bacilos Gram
negativos, anae robios facultativos, de forma recta o curva, no producen esporas, presentan un
diametro entre 0,5 a 0,8 m y entre 1,4 a 2,4 m de largo (Fig. 1). La ma yoria de las especies
patogenas son moviles por medio de un unico flagelo polar (32). Cerca de la tercera parte de las
especies del genero Vibrio son patogenas para el humano y la enfermedad es por lo general, el
resultado de la ingestion de agua o alimentos contaminados o por la exposicion de heridas a ambientes
acuaticos donde las especies de Vibrio estan presentes (33). Las especies V. cholerae, V.
parahaemolyticus y V. vulnificus son los pa togenos humanos mas importantes.
CARACTERISTICAS DE LA ESPECIE VIBRIO CHOLERAE
V.cholerae es una especie bien definida sobre las bases de pruebas bioquimicas. Pero, la especie no es
homogenea en lo que respecta a su potencial patogeno. La presencia de antigenos somaticos
termoestables O, ha permitido determinar mas de 200 serogrupos de V. cho lerae (34). Solamente dos
de ellos se reconocen como responsables de las epidemias de Colera, el O1 (32) y el O139 (35). Los
serogrupos no-O1/no-O139, suelen aislarse de fuentes ambientales y pueden producir casos
esporadicos de gastroenteritis y de infeccionesextra-intestinales. V. cholerae O1 es considerado el
serogrupo virulento y epidemico por excelencia. Sin embargo, se ha demostrado la seroconversion de
V. cholerae no-O1/no-O139 a O1 (36), y la transformacion natural inducida por quitina de la cepa
epidemica por la adquisicion del casete que codifica el antigeno O139 (37).
Los aislamientos del serogrupo O1 de V. cholerae se han subdividido en tres serotipos: Inaba, Ogawa e
Hikojima, siendo este ultimo muy raro. Las cepas de V. cholerae O1 pueden interconvertir y producir
un cambio de serotipo (36, 38, 39). Los aislamientos de V. cholerae O1 tambien pueden dividirse en
dos biotipos, El Tor y Clasico, sobre la base de varias caracteristicas fenotipicas. Hasta 1936, los
aislamientos de V. cholerae O1 de la epidemia de Colera eran bioquimicamente similares y pertenecian
al biotipo Clasico. El Biotipo El Tor se aislo en 1905 y fue considerado no patogeno hasta 1936. La sep
tima pandemia esta relacionada con el biotipo El Tor, que es el causante de todos los casos de Colera
en el mundo, pues, el biotipo Clasico asociado con la sexta pandemia esta extinto (figura 2).

14. Figura 1. Fotografias de microscopia electronica de barrido y de transmision de V. cholerae. A: La
bacteria presenta forma de coma y un flagelo polar, y habita normalmente ambientes acuaticos; B y C:
Vibrios adheridos a la superficie de la mucosa intestinal.
Figura 2. Clasificacion de los serogrupos de V. cholerae en los grupos epidemico y No-epidemico. Los
serogrupos O1 y O139 son por ahora los unicos serogrupos asociados con epidemias de Colera.

15. EL GENOMA DE VIBRIO CHOLERAE
En el año 2000 se publico la determinacion y analisis de la secuencia genomica completa de V.
cholerae El Tor (40). El genoma consiste en dos cromosomas circulares de 2.961.146 pb (cromosoma
1) y 1.072.314 pb (cromosoma 2). Existe una pronunciada asimetria en la distribucion de los genes
conocidos entre los dos cromosomas. La mayoria de los genes que codifican la replicacion y reparacion
del ADN, transcripcion, traduccion, biosintesis de la pared celular, y una variedad de vias centrales de
catabolismo y biosintesis, estan codificados en el cromosoma 1. La mayoria de los genes esenciales
para la patogenicidad, como la toxina colerica, el pilus co-regulado con toxina, los lipolisacaridos y la
maquinaria de secrecion de proteinas extracelulares, tambien estan localizados en el cromosoma 1. En
contraste, el cromosoma 2 contienen una gran parte (59%) de marcos abiertos de lectura (ORFs)
hipoteticos y ORFs de los que se desconoce su funcion. La secuencia genomica confirma la presencia
de un gran sistema de captura de genes, conocido como isla de integrones. Los casetes de este
superintegron aparentemente codifican funciones adaptativas y se ha determinado una gran diversidad
entre las cepas toxigenicas y no toxigenicas (23, 41). Recientemente se identifico el primer gen de
virulencia funcional en el superintegron (enterotoxina termo estable), lo cual sugiere que el
superintegron es un mecanismo por el cual los miembros de esta especie pueden importar genes
exogenos (42).
Varias evidencias sugieren que este cromosoma 2, fue originalmente un megaplasmido, capturado por
una es pecie ancestral de Vibrio. La estructura de los dos cro mosomas se encuentra en otras especias
de Vibrio, su - giriendo que los genes contenidos en el megaplasmido quizas proveyo al Vibrio una
ventaja evolutiva en el ecosistema acuatico. Los elementos SXT parecen ser una adicion reciente al
genoma de V. cholerae, pues no estan presentes en los aislamientos de la septima pandemia, como
puede ejemplificarse por su ausencia en el genoma de la cepa de V. cholerae N16961, la cepa tipo
utilizada pa ra la determinacion de la secuencia genetica completa del cromosoma por el Institute for
Genome Research (40).
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO CLINICO
V. cholerae sobrevive bien en las muestras fecales si se mantiene la humedad, pero si se produce una
demora de mas de unas pocas horas en el traslado al laboratorio, se debe utilizar el medio de
transporte Cary-Blair. Las heces, tanto frescas como en medio de transporte, deben sembrase en agar
de tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS), que inhibe la mayoria de la flora fecal habitual,
pero soporta el crecimiento de los Vibrios.
Adicionalmente, la muestra debe ser inoculada en un caldo de agua peptonada alcalina (APA), un caldo
de enriquecimiento de pH alto, el cual soporta de manera preferente el crecimiento de Vibrios. Despues
de 6-12 horas de incubacion, el caldo APA debe ser subcultivado en una segunda placa de TCBS. Estas
placas se incuban por 18-24 horas y las colonias de V. cholerae se observaran como amarillas,
brillantes, con el centro ligeramente levantado. La identificacion presuntiva se puede realizar en base a
las caracteristicas de las colonias, las cuales son oxidasa positiva y aglutinan con el antisuero O1 o
O139 (43). En la actualidad se estan utilizando numerosos metodos de biologia molecular tanto para la
identificacion de las especies de Vibrio, como para la determinacion de genes de virulencia y la
deteccion en muestras clinicas y ambientales (44-47).
FACTORES DE VIRULENCIA
A nivel molecular, la patogenesis del colera es un proceso multifactorial que involucra varios genes que
codifican factores de virulencia que ayudan al patogeno para la colonizacion y la expresion coordinada
de la toxina (Tabla 1). La diarrea masiva inducida por V. cholerae es causada por la toxina colerica
(CT) (4), aun cuando se ha reportado que cepas que pierden los genes que codifican para la CT,
todavia pueden causar diarrea.
Tabla 1. Factores de virulencia de Vibrio cholerae

16. TOXINA COLÉRICA
Cada molecula de CT, esta compuesta por cinco subunidades B (de enlace) y una subunidad A (activa).
Las subunidades B se unen a los receptores del gangliosido GM1 en las celulas epiteliales de la mucosa
intestinal. Despues de la union, se separan la subunidad A1 y el componente A2, lo cual facilita la
entrada del componente A1 en la celula. El componente A1 de la toxina colerica estimula la produccion
de la enzima adenilciclasa, involucrada en la produccion del monofosfato ciclico de adenosina (AMPc).
Las altas concentraciones intracelulares de AMPc alteran el transporte activo de los electrolitos a traves
de la membrana celular, lo cual impide la adsorcion de liquido y conduce a su secrecion en el intestino
delgado.
La enterotoxina de V. cholerae esta codificada por los genes ctx. El gen ctxA codifica la subunidad A de
la toxina, y el gen ctxB codifica la subunidad B. Los genes son parte del mismo operon ctxAB. El
transcrito (ARNm) del operon ctx tiene dos sitios de union a ribosoma (RBS), uno en el gen A y otro en
el gen B. Este ultimo es, por lo menos, siete veces mas fuerte que el sitio de la region A. De esta
forma el organismo es capaz de traducir mas proteinas B que A, lo cual se requiere para ensamblar la
toxina en la proporcion apropiada (1A:5B). Los componentes son ensamblados en el periplasma
despues de la traduccion. Cualquier subunidad B extra puede ser excretada por la celula, pero la
subunidad A debe estar adherida a 5 subunidades B, para poder salir de la celula. La subunidad A
intacta no es activa enzimaticamente, y se debe fraccionar en los fragmentos A1 y A2, los cuales estan
unidos por un puente disulfuro (48).
El operon ctxAB, forma parte del genoma del bacteriofago filamentoso CTX, lisogenizado en la
bacteria (40). Este genoma fagico esta compuesto por dos dominios funcionalmente distintos, la region
central o "core" y la region RS2 (49). En la region central se encuentran, entre otros, los genes de la

17. toxina colerica (ctxAB), los genes implicados en la morfogenesis del bacteriofago (psh, cep, orfU, y
ace) y un gen que codifica una proteina necesaria para el ensamblaje del virion (zot). Antes de conocer
este origen fagico, algunos de estos genes se consideraban que codificaban otras toxinas relacionadas
con la patogenesis del Colera, ya que se habia detectado, por ejemplo que el zot (zonula occludens
toxin) aumentaba la permeabilidad de la mucosa intestinal (50) y el ace (accesory cholera enterotoxin)
era capaz de inducir la acumulacion de liquidos (51). La region RS2 incluye los genes necesarios para
la replicacion (rstA), integracion (rstB) y regulacion (rstR) de CTX, tambien contiene dos regiones
intergenicas ig-1 y ig-2 (52). Dentro de las celulas de V. cholerae, el genoma de CTXpuede existir
como la forma replicativa o co mo profago integrado dentro del cromosoma (49). Bajo condiciones
apropiadas, las cepas toxigenicas de V. cho lerae pueden ser inducidas para producir particulas ex
tracelulares de CTX (49, 53). Las cepas ambientales no toxigenicas pueden convertirse por
transduccion con CTX (53).
El profago de CTX esta usualmente flanqueado por un elemento genetico relacionado conocido como
RS1, si milar genetica y funcionalmente a la region RS2 del CTX (52). No se han identificado en
aislamientos na turales de O1 El Tor y O139 profagos solitarios, no flan - queados por RS1 u otro
profago (54). El elemento RS1 por ta un ORF denominado rstC que no esta presente en RS2 (52). RstC
es un anti represor que controla la produccion de particulas de CTX y la expresion de la toxina
colerica (55). Todo esto sugiere una interrelacion entre los progafos RS1 y CTX que promueve una
diseminacion mas eficiente de los genes ctx, mientras, simultaneamente, aumenta el desempeno en
virulencia de aquellas cepas de V. cholerae que portan los genes de TCP.
ISLA DE PATOGENICIDAD
Las islas patogenicas (PAIs) son segmentos de ADN bacteriano que portan uno o mas genes de
virulencia, adquiridos en bloque a partir de una fuente externa. Las PAIs son identificadas por su
diferencia en el porcentaje de contenido de G+C en relacion a la media del cromosoma y por otras
caracteristicas, que sugieren su adquisicion a traves de elementos geneticos moviles (56). La Isla de
patogenicidad 1 de V. cholerae (V. cholerae pathogenicity island, VPI-1) tiene un tamano de 39,5 kb.
Todos los genes en VPI-1 son potencialmente importantes para producir la enfermedad, ya sea que
tengan un rol directo en la patogenesis o indirecto en la transferencia y motilidad de VPI-1. El
elemento VPI-1 contienen genes como tcpA que codifica un importante factor de colonizacion y el
receptor para CTXO, y los genes toxT, tcpP y tcpH que codifican factores reguladores y de virulencia
(57). La identificacion de genes potenciales de una integrasa y una transposasa a cada lado de VPI-1
sugieren la transferencia e integracion de VPI en cepas epidemicas y pandemicas (57).
La isla VPI-2, es una region cromosomal de 57,3 kb con caracteristicas de una isla de patogenicidad
(58). Todas las cepas toxigenicas de V.choleraeO1 y O139 contienen VPI-2, mientras los aislamientos
no toxigenicos no-O1/no-O139 no tienen esta region. VPI-2 codifica varios grupos de genes: un
sistema de restriccion por modificacion tipo 1, el cual podria proteger a la bacteria de la in feccion por
virus (59); un grupo de genes nan.nag ho - mologos a los genes involucrados al metabolismo del acido
sialico, el cual podria actuar en la obtencion de fuente de carbono y nitrogeno (60); una
Neuraminidasa, la cual actua en los gangliosidos de alto orden en el in - testino y convertirlos en
gangliosidos GM1, los cuales sub secuentemente liberarian acidos sialicos (61); y una region con
homologia al fago Mu (58).
El analisis comparativo del genoma de V. cholerae usando la tecnica de microarreglos de DNA,
determino diferencias en el contenido entre la cepa de la sexta pandemia (Clasico) y la septima
pandemia (El Tor). Se han identificado dos regiones designadas como: Isla 1 del Vibrio de la septima
pandemia (Vibrio seventh pandemic island-I, VSP-I) y VSP-II que unicamente estaban presentes en las
cepas de la septima pandemia El Tor (62). VSP-I y VSP-II muestran varias caracteristicas de isla de
patogenicidad. VSP-I es una region de 16 kb y con tiene 11 ORFs, con un contenido de GC de 40%, en
contraste con el promedio para todo el cromosoma del 47% (62). La region VSP-II tiene un tamano de
7.5 kb, y contiene ocho ORFs (62). Estas dos PAIs y VPI-2 se pueden escindir del cromosoma y formar
una molecula in termediaria, circular, la cual es el primer paso para su transferencia horizontal (63).
MOTILIDAD
Se ha sugerido que la motilidad contribuye a la reactogenicidad de los candidatos a vacuna de una
cepa atenuada, por promover la penetracion de la barrera mu cosa (64). El papel de la motilidad en la

18. patogenesis del colera no esta completamente entendido. Los primeros estudios usando mutantes no
motiles, producian resultados conflictivos del rol de la motilidad en la adherencia y enterotoxicidad, en
el modelo de asa ileal de conejo (65). La inhibicion de la motilidad incrementa la trascripcion de toxT
en el biotipo El Tor, pero no previene la induccion de ctxA y tcpA en el intestino de los ratones. Sin
embargo, en el modelo de asa ileal de conejo, la motilidad es necesaria para la expresion completa de
la enterotoxicidad (66). Esto sugiere que la relacion entre la movilidad y la expresion de los factores de
virulencia es compleja.
HEMAGLUTININA / PROTEASA
V. cholerae produce una hemaglutinina/proteasa (HapA), codificada por hapA (67), tambien
involucrada como factor de virulencia. HapA puede degradar proteoliticamente varias proteinas de
importancia fisiologica pa ra el hospedero, incluyendo la mucina (68). HapA perturba la barrera
paracelular en los cultivos de celulas de epitelio intestinal, por la accion en las proteinas asociadas a la
zona ocludens (69) y se ha demostrado que se requiere la expresion de hapA para que V. cholerae
penetre un gel de mucina in vitro (70). Aunque el analisis de los efectos de mutantes del gen hapA en
conejos infantes y ratones lactantes no ha provisto evidencia que HapA es un factor esencial de
virulencia (67), se ha probado que la proteasa HapA contribuye a la reactogenicidad en las vacunas de
colera de cepas atenuadas en humanos (71). La perdida de HapA no afecto la colonizacion en el
modelo de ratones lactantes, sin embargo la motilidad y HapA son necesarios para la expresion total
de la enterotoxicidad en asa ileal de conejo (66).
TOXINA MARTX DE VIBRIO CHOLERAE
La secuencia de nucleotidos del genoma de V. cholerae y su analisis con tecnicas informaticas, ha
revelado la presencia de otras toxinas desconocidas, entre ellas, la Toxina RTX multifuncional
autoprocesada de Vibrio cholerae (multifunctional, autoprocessing RTX toxin, MARTXVc). Esta proteina
es homologa a los miem - bros de la familia de las toxina RTX (Repeats in toxin), que contienen un
motivo de repetidos ricos en GD. Esta codificada por un elemento genetico situado muy cerca del lugar
de insercion del genoma del bacteriofago CTX, aunque su actividad es independiente del elemento
CTX (72). El gen rtxA es el marco abierto de lectura mas largo en el genoma de V. cholerae (40), y se
encuentra tanto en los aislamientos clinicos como los ambientales (73, 74). La MARTXVc es secretada
por un sistema T1SS atipico, compuesto por cuatro componentes (75). Esta toxina rompe los
filamentos de actina del citoesqueleto de un amplio rango de tipos celulares (76). Esta disrupcion se
produce por la inactivacion de las GTPasas pequenas, Rho, Rac y Cdc42 (77). Adicionalmente esta
toxina posee otro dominio responsable del entrecruzamiento (actin cross-linking domain, ACD), el cual
utiliza G-actina como substrato (78).
HEMOLISINA
La mayoria de los aislamientos de V. cholerae O1 biotipo El Tor y no-O1/no-O139 producen una
exotoxina hemolitica, llamada El Tor Hemolisina o V. cholerae citolisina (VCC) (79-81), codificada por
el gene cromosomal hlyA (40). Se ha reportado que VCC es capaz de causar severos efectos
citotoxicos, tales como: lisis celular, vacualizacion e incremento de la apoptosis en celulas del epitelio
intestinal (82-84). Esta hemolisina se puede encontrar como monomero con actividad hemolitica y
como oligomeros que aglutinan eritrocitos. Estas diferentes formas conducen a las celulas inmunes a
diferentes direcciones, los oligomeros inducen la expresion de IgM e IgA, sin embargo, la mayoria de
las celulas tratadas con monomeros resultan en apoptosis (85).
HEMAGLUTININA MANOSA SENSIBLE
Una estrategia bacteriana alternativa para sobrevivir en el ambiente, es la formacion de Biopeliculas.
Estas estructuras son comunidades microbianas que se forman por la adherencia de una bacteria a una
superficie, a la que posteriormente se adicionan multiples capas de interacciones celulas-celulas y
desarrollan una estructura tridimensional, que incluyen canales de agua a traves de los cuales entran
nutrientes y salen productos de desecho (86). En los ambientes acuaticos existen diferentes superficies
sobre las cuales se pueden formar biope liculas. Estas superficies incluyen particulas de minerales en
suspension, plantas, y los exoesqueletos de los crustaceos y zooplancton. V. cholerae O1 El Tor se
puede diferenciar del Clasico por la presencia de un pilus del tipo IV, llamado Hemaglutinina manosa
sensible (mannose-sensitive hemagglutinin, MSHA), codificado por el gen mshA (87), implicado en la

19. formacion de biopeliculas en superficies abioticas y que facilita la supervivencia de la bacteria en
ambientes acuaticos (88).
TOXINA CHOLIX
Esta toxina tiene actividad de ADP-ribosiltransferasa, y es activa contra celulas de mamiferos y crusta
ceos, con actividad especifica contra el factor ribosomal de elongacion tipo 2. Para su accion requiere
de endo citosis mediada por un receptor, traslocacion al cito plasma hospedero, donde produce la
inhibicion de la sintesis proteica por modificacion especifica del factor de elongacion. Se ha propuesto
que este factor juega un rol importante en la supervivencia del microorganismo en el ambiente
acuatico (89).
QUORUM-SENSING
Las bacterias son capaces de producir unas moleculas pequenas difusibles, llamadas auto-inductores.
Estas moleculas se acumulan en el medio cuando ocurre un incremento de la densidad celular, y
regulan la ex presion de un amplio numero de genes, que a su vez controlan una variedad de funciones
fisiologicas, en un proceso que se conoce como "quorum-sensing" (90, 91). Este pro ceso permite a las
bacterias comunicarse, secretando senales quimicas, habilitando asi a la poblacion bacteriana a regular
de forma colectiva la expresion de ge nes, y por lo tanto su desempeno como comunidad. Este "censo-
poblacional", le permite al grupo bacteriano modular la expresion de genes especificos solo en ciertos
momentos de densidad de poblacion, aquellos que serian improductivos que ocurrieran por una
bacteria individual, pero que son efectivos cuando se realizan en grupo. Asi, el "quorum-sensing" es un
proceso que involucra la secrecion y deteccion de autoinductores que les permite a las bacterias
funcionar como un organismo mul ticelular. En V. cholerae se ha demostrado que el "quorum-sensing"
regula negativamente la expresion de los genes de virulencia (92, 93). Los principales autoinductores
en V. choleare son: Colera autoinductor 1 (CAI- 1) y el autoinductor 2 (AI-2), que funcionan de
manera sinergistica para la regulacion de los genes (94). La acumulacion de los auto-inductores
modula la actividad de un regulador central, LuxO, a traves de los receptores de membrana CqsS y
LuxPQ (92). Cuando hay una baja densidad celular, LuxO reprime la expresion de un regulador
maestro "quorum-sensing", HapR, por la activacion de la expresion de un grupo de RNA pequenos
(95). La represion de hapR permite la expresion de tcpP en la isla de patogenicidad de V. cholerae. En
este punto, el resultado es la expresion de los factores de virulencia que le permiten a V. cholerae
colonizar el intestino delgado, multiplicarse y producir la toxina colerica. HapR tambien reprime el
operon vps (Vibrio polyssacharide synthesis), por lo que regula negativamente la formacion de
biopeliculas (96). Adicionalmente, HapR directamente regula po sitivamente la expresion de hapA, lo
cual produce una hemaglutinina/proteasa secretora, responsable de la adherencia de los Vibrios al
epitelio intestinal (97). En resumen, HapR reprime el regulon de virulencia, los genes relacionados con
la formacion de biopeliculas y activa la produccion de proteasa, que puede promover la li beracion de
las celulas de V. cholerae adheridas, lo que facilita el establecimiento de un nuevo punto de in - feccion
en el epitelio gastrointestinal, o alternativamente, promover la salida de V. cholerae del hospedador y
asi en condiciones de alta densidad celular se inhibe la virulencia en la bacteria.
Se ha sugerido que el sistema sensorial de dos com ponentes VarsS/VarA forma parte de un sistema
regulatorio dependiente de "quorum-sensing", el cual modula la expresion de genes en V. cholerae
(98). Mas aun, la expresion de hapR es reprimida en alta densidad celular por si misma, aunque el
significado de esta auto represion no se conoce (99). Tambien se ha identificado un regulador
transcripcional, VqmA, que modula el "quo rum-sensing" de V. cholerae pues activa la expresion de
hapR cuando hay baja densidad de celulas (100). Adicionalmente, se ha reportado que el
"quorumsensing" aumenta la viabilidad de V. cholerae, bajo ciertas condiciones de estres, mediante la
regulacion de la expresion de RpoS (factor sigma de la RNA polimerasa de fase estacionaria) (101). Por
otra parte, se requiere la proteina receptora de AMPc (CRP) para la biosintesis de CAI-1, que afecta la
expresion de multiples genes regulados por HapR (102), poniendose asi de manifiesto la intrincada red
regulatoria que garantiza la sobrevivencia de la bacteria y del hospedero.
EL CÓLERA EN EL MUNDO
La distribucion de las enfermedades infecciosas en el mundo esta variando continuamente, debido a los
cam bios que se producen en el patogeno, en el ambiente y en la poblacion hospedadora. El
incremento de la resistencia a los antibioticos, el sobrecalentamiento del planeta, la globalizacion de
los mercados y las migraciones de poblaciones, son los principales factores que intervienen en el
desarrollo y proliferacion de este grupo de enfermedades. Dentro de este grupo de enfermedades

20. infecciosas se encuentra el Colera, que presenta una mayor incidencia en los paises en desarrollo de
clima tropical, llegando a adquirir caracteristicas epidemicas. El numero de casos de Colera reportados
a la OMS durante el ano 2006 aumento dramaticamente alcanzando los niveles que se observaban
durante el final de los 1990s. Un total de 236.896 casos fueron notificados de 52 paises (Figura 3),
incluyendo 6.311 defunciones (tasa de mortalidad 2,66%), un incremento del 79% comparado con el
numero de casos reportados durante el 2005 (103).
Figura 3. Paises/Areas que reportaron casos de Colera en el 2006.
V. cHOlERAE O 139
A finales de 1992, aparecieron epidemias de Colera en India y Bangladesh, causadas por una cepa que
no se aglutinaba con los antisueros O1 y no-O1 disponibles hasta (35). Esta nueva cepa, a la que se
denomino O139 Bengal (104), se propago rapidamente a los paises vecinos y desplazo los casos de
Colera originados por el serogrupo O1. El cuadro clinico que producia era identico al causado por las
cepas O1. Despues de la aparicion explosiva, su presencia declino paulatinamente hasta 1994, cuando
un nuevo clon de V. cholerae O1 El Tor reemplazo el serogrupo O139 en Calcuta. En 1996, reaparecio
en Calcuta un nuevo clon de V. cholerae O139, siendo el serogrupo dominante durante el pe - riodo
1996-1997 (105). Desde 1998 hasta la actualidad, V. cholerae O139 sigue confinado en el continente
asiatico, principalmente en China.
A partir de estudios moleculares, se ha demostrado que las cepas de V. cholerae O139 estan muy
relacionadas con las cepas O1 El Tor de la septima pandemia, pe ro tienen varias caracteristicas que la
distinguen. Todo ello, ha contribuido a que algunos autores postulen que este nuevo serogrupo O139
se origino a partir de una cepa O1 El Tor que adquirio ADN extra cromosomico (106). Tambien se ha
comprobado un cambio en la estructura y organizacion del profago CTX en las ce - pas O139 (107).
La repentina aparicion del se ro grupo O139 en 1992, su rapida propagacion por el su deste asiatico en
1993, seguido por un periodo de quies cencia durante los anos 1994 y 1995, y su reemergencia y
dominacion durante los anos 1996 y 1997, son pruebas de la impredecible epidemiologia del Colera.
La pandemia actual, que comenzo en Indonesia en el ano 1961 (108), sigue su curso, y despues de
cuarenta anos no muestra una tendencia al descenso. El Colera, presenta diferentes patrones
epidemiologicos, segun la region que afecta. En determinados paises, en su mayoria en vias de
desarrollo, la enfermedad es endemica, y en otros paises aparece en forma de brotes epidemicos
esporadicos. Las dos areas endemicas mas importantes son: Africa y Asia. En cambio, en los paises
desarrollados se detectan casos esporadicos, fundamentalmente importados de areas endemicas o en
las que existe un brote epidemico.

21. EL CÓLERA EN AMÉRICA
La deteccion del Vibrio cholerae O1 en los pacientes de un pueblo costero peruano en enero de 1991,
senalo la llegada de la septima pandemia del Colera a America Latina, la cual se disemino
rapidamente, a razon de aproximadamente un pais por mes (109, 110). Desde 1991 a 1998, America
Latina notifico 1.264.426 casos de Colera con 12.535 defunciones (111). Para el ano 2006, permanece
estable el numero bajo de casos en las Americas, solo se han notificado casos en Norte America;
Canada (2 casos importados) y los Estados Unidos (4 casos importados y 4 casos autoctonos) (103)
(Figura 3).
EL CÓLERA EN VENEzUELA
En Venezuela, el Colera llega en diciembre de 1991 y hasta el ano 1993 se reportaron 5.420 casos, 80
de estos resultaron en muerte (112). Despues de 2 anos (1994-1995) sin haberse reportado ningun
caso de Co le - ra en Venezuela, a principios de junio de 1996 se de tec ta un brote en el estado zulia,
producido por V. cholerae O1 del serotipo Ogawa. El brote continuo su ex pansion y para el ano 1997
el Colera se habia extendido por 14 entidades federales, registrandose 2.557 ca sos con una tasa de
letalidad de 2,3% (113). Luego de va rias semanas sin reporte de casos, a finales del ano 1998 se
detecta un segundo brote de Colera en el estado Delta Amacuro (114), producido por V. cholerae O1
del serotipo Inaba, el cual se extendio a los estados, Su cre, Nueva Esparta, Monagas, Anzoategui y
Miranda (115). Desde el ano 2000 no se han reportado en Ve nezuela nuevos casos de Colera (Figura
4).
Figura 4. Numero de casos de Colera reportados durante los brotes de 1996-1997 y 1998-1999 en
Venezuela. En junio de 1996 se detecta un brote producido por V. cholerae O1 del serotipo Ogawa.
Luego a finales del ano 1998 se detecta un segundo brote de Colera producido por V. cholerae O1 del
serotipo Inaba. Desde el ano 2000 no se han reportado en Venezuela nuevos casos de Colera.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
Las investigaciones epidemiologicas del Colera han estado limitadas por los sistemas de tipificacion
disponibles, tales como, identificacion bioquimica o serologica, los cuales proveian poca informacion
para la discriminacion entre las cepas. Las cepas epidemicas, son por lo ge neral, del serogrupo O1, y
en este serogrupo, solo existen dos biotipos, Clasico y El Tor, y solo dos serotipos Inaba y Ogawa
(Figura 2). La determinacion de los biotipos requiere de pruebas que en ocasiones son dificiles de
desarrollar, y algunos marcadores, como la actividad hemolitica, han cambiado con el tiempo (116). La
electroforesis que discrimina enzimas de multiples lo cus (Multilocus enzyme electrophoresis, MEE)
puede distinguir entre el biotipo Clasico y El Tor y tambien ha agrupado las cepas toxigenicas del

22. biotipo El Tor en cuatro grupos clonales grandes, o tipos electroforeticos (electrophoretic types, ET),
que representan grandes areas geograficas (117). Estas incluyen el clon australiano (ET1), el clon de la
costa del golfo de Mexico (ET2), el clon de la septima pandemia (ET3) y el clon de Latinoamerica
(ET4). Actualmente, con el desarrollo de la epidemiologia molecular se han hecho grandes avances, al
utilizar diferentes tecnicas.
El analisis de los perfiles plasmidicos fue una de las primeras tecnicas de sub-tipificacion utilizada como
marcador epidemiologico efectivo para muchos organismos productores de diarrea (118). Las cepas de
Vibrio cholerae O1 biotipo Clasico contienen ciertos plasmidos (119), pero las cepas de Vibrio cholerae
O1 biotipo El Tor rara vez se ha demostrado la presencia de plasmidos utiles como marcadores
epidemiologicos. En 1982, el biotipo Clasico produjo un brote de Colera y los investigadores usaron el
perfil de plasmidos para probar que 42 cepas del biotipo Clasico aisladas durante este brote fueron
practicamente indistinguibles de los aislamientosobtenidos durante los anos 1916 y 1921 (119). Otro
metodo para subtipificacion aplicado en Colera fue el analisis por "Southern" del ADN celular completo,
utilizando una sonda dirigida a identificar el gen de la subunidad A de la Toxina Colerica. Aunque el
cromosoma bacteriano contiene solo una o dos copias de los genes de toxina co lerica, se pueden
diferenciar los aislamientos de acuerdo al numero y la localizacion de estos genes en el cromosoma. El
uso de esta tecnica permitio determinar que los aislados de V. cholerae O1 toxigenicos del Golfo de
Mexico son diferentes a los aislados de la septima pandemia, al menos en relacion al gen que codifica
CT (120). La fuente del brote original desarrollado en el Pe - ru permanece sin demostrar, sin
embargo, las tecnicas moleculares permitieron definir la cepa epidemica y señalar que estaba
relacionada con los aislamientos de pa cientes de la septima pandemia de otras partes del mundo
(121), aunque fallo en indicar la presencia de la misma cepa en otra parte del mundo.
Los genes que codifican el ARN ribosomal (ARNr) son secuencias conservadas durante la evolucion y se
encuentran en copias multiples en todos los cromosomas de todas las bacterias (122), pero muestran
gran diversidad, tanto en su localizacion dentro del cromosoma, como en secuencia de nucleotidos en
ciertas regiones variables. Esta caracteristica ha sido utilizada para la Ribotipificacion de V. cholerae
(15). Este esquema pro pone 27 Ribotipos diferentes con la enzima de restriccion BglI. La aplicacion de
la Ribotipificacion permitio distinguir las cepas de la epidemia de Latino America, y los aislados de la
Costa del Golfo, de las otras cepas que causaron la septima epidemia de Colera en el resto del Mundo.
Estas ultimas pertenecen a los ribotipos 3 al 8. La mayoria de las cepas aisladas en la epidemia de
Latino America pertenecen al Ribotipo 5, en Mexico las cepas aisladas entre 1991 y 1993, pertenecen a
los ribotipos 5 y 6a (15, 123). Las cepas de Vibrio cholerae O1 resistentes a antibioticos aisladas en
Mexico, Guatemala y Brazil, pertenecen al Ribotipo 6a (15), este Ribotipo no se encontro entre los
aislamientos del Peru, los cuales fueron sensibles a todos los antibioticos probados (124). La
Ribotipificacion de V. cholerae aisladas en di ferentes partes del mundo, desde 1941, demostro que: (i)
los biotipos Clasico y El Tor son clones diferentes; (ii), la pandemia de Colera no es una epidemia de
una sola cepa alrededor del mundo debida a un solo clon, sino mas bien, es la ocurrencia simultanea
de varias epidemias, con varios clones involucrados; y (iii), las olas de epidemias debidas al biotipo El
Tor pueden deberse a la emergencia de nuevos clones (125). El estudio de 75 cepas de V. cholerae O1,
aisladas en Pe ru en el periodo 1991-1999 evidencio la existencia de tres ribotipos diferentes,
observandose la aparicion cons tante y mayoritaria de uno de los ribotipos (126).
Recientemente se ha utilizado la tecnica de electroforesis en campo pulsado (Pulsed Field Gel
Electropho - resis, PFGE) que permite discriminar polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restriccion (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) para los estudios epidemiologicos a nivel
molecular. La PFGE per - mite la separacion de fragmentos grandes de ADN, generados por la digestion
del ADN genomico con una endonucleasa de restriccion que corta el ADN de forma infrecuente,
generando pocos fragmentos. La utilizacion de esta tecnica en V. cholerae O1 con la enzima de
restriccion Not-I permitio una identificacion rapida de las cepas, de manera mas efectiva que la
ribotipificacion (127). En primera instancia, todos los aislamientos de la epidemia en Latinoamerica
tenian un patron de PFGE identico (127). Posteriormente, encontraron 8 tipos di - ferenciados por
PFGE en 50 cepas de V. cholerae O1 ais ladas en Peru, desde 1991 a 1995 (124). Los autores es timan
que los cambios geneticos en la cepa responsable de la epidemia en Latinoamerica estan ocurriendo
mas frecuentemente que lo que se habia reportado previamente. Se han reportado 9 genotipos
diferentes en las cepas de V. cholerae aisladas en Iran, demostrando una gran diversidad en los
aislamientos del serotipo O1 (128). Cuando se utilizo esta tecnica para la comparacion de V. cholerae
O1 y O139, tambien se demostro que ambas cepas tienen un origen clonal (129). Esta tecnica fue
utilizada para investigar el origen de los casos domesticos no relacionados epidemiologicamente en
Japon, encontrando que 86,1% de los casos pertenecian a un mismo clon, a diferencia de los casos

23. importados los cuales se pudieron separar en 13 subtipos diferentes, sugiriendo que una cepa de V.
cholerae O1 se habia diseminado en varias partes de Japon y esporadicamente producia Colera (130).
La tecnica conocida como Amplificacion al Azar de ADN Polimorfico (Random Amplification of
Polymorphic DNA, RAPD), utiliza diferentes juegos de iniciadores con secuencias arbitrarias y al azar,
para permitir la amplificacion de regiones del ADN de la cepa en analisis. La hibridacion de los
iniciadores se realiza en condiciones de baja estrictez, por lo que pueden encontrar regiones a las
cuales aparearse y permitir la amplificacion de varios fragmentos del genoma. Bajo condi ciones
estandarizadas, este metodo produce distintos patrones para cada muestra analizada, que pueden ser
comparados con los patrones de otras muestras (131-133). Sin em bargo, se ha reportado que cuando
se utilizan diferentes preparaciones de ADN (ADN de diferente calidad) y diferentes fuentes de enzimas
e iniciadores, esto produce diferencias en el patron de bandas observado y una baja reproducibilidad,
por lo que el metodo RAPD no es adecuado para la creacion de una base de datos para la identificacion
de cepas de V. cholerae (134). Pero, debido a su sim plicidad y capacidad discriminatoria, esta tecnica
es util en la deteccion de diversidad genetica entre microorganismos procesados al mismo tiempo.
Con el desarrollo de las tecnicas moleculares, han apa recido nuevas metodologias, como el tipiado se
se cuencias multilocus (Multilocus Sequence Typing, MLST), que analizan la variabilidad genica
mediante secuenciacion del ADN. Sobre la base del analisis de las variaciones en las secuencias de
genes, se ha sugerido que las ultimas dos pandemias de Colera podrian estar causadas por clones
independientes, que emergieron de V. cholerae ambientales, no toxigenicos, no- O1(135). Esta tecnica
permite hacer inferencias de ca racter evolutivo de forma global, pero no es util para conocer la
epidemiologia a corto plazo.
EL VIBRIO CHOLERAE Y EL AMBIENTE
En vista que la historia del Colera se ha caracterizado por oleadas epidemicas, hasta principios de 1980
se pensaba que V. cholerae era un microorganismo altamente adaptado a su huesped y que no
"sobrevivia" mas de pocas horas o dias fuera del intestino humano. Se ha propuesto el termino de
"viables no cultivables" para describir el estado en el cual las bacterias son detectables por contaje
directo de celulas viables, pero no son cultivables (136). Se ha reportado la existencia de V. cholerae
"viable no cultivable", en respuesta al agotamiento de nutrientes u otras condiciones ambientales
desfavorables (137). Este fenomeno representa una nueva perspectiva en la vision de la
"sobrevivencia" de V. cholerae en el ambiente, ya que permanece viable en los ambientes acuaticos y
es capaz de transformarse al estado cultivable cuando las condiciones le son favorables (138).
Se ha descrito que V. cholerae puede adherirse a la quitina de los caparazones de algunos crustaceos y
coloniza las superficies de algas, fitoplancton, copepodos y raices de plantas acuaticas (105, 139). Se
ha sugerido que V. cholerae adherido a plancton, entra en una estado "viable no cultivable" como parte
de su mecanismo para "sobrevivir" en el ambiente. Las implicaciones epidemiologicas del estado
"viable no cultivable" son considerables, pues cuando es inoculado en el asa ileal de co nejo o probado
en voluntarios humanos, causa acumulacion de una gran cantidad de fluido y diarrea, respectivamente
(139).
VACUNACIÓN
La observacion que la infeccion natural de Colera confiere inmunidad efectiva y de largo plazo ha
conducido a realizar esfuerzos para el desarrollo de vacunas. Una vacuna inyectable elaborada con
organismos muertos, fue desarrollada poco despues del descubrimiento de V. cholerae durante los
anos 1880 y fue am pliamente utilizada en todo el mundo, siendo un requisito para los viajeros
internacionales. Sin embargo, no era costo efectiva como un sistema de intervencion en salud publica,
porque la proteccion era corta, 6 meses, estaba asociada con dolor local, reaccion inflamatoria y no
prevenia la diseminacion de la enfermedad (140). Tambien han sido utilizadas como vacunas
diferentes fracciones purificadas de lipopolisacarido, con exitos variables. La toxina colerica puede ser
convertida en toxoide en presencia de formalina y de gluraladehido, pero es un antigeno pobre y su
uso ha resultado en una proteccion de bajo nivel. En la actualidad, las investigaciones mas recientes
estan dirigidas al desarrollo de vacunas orales, que produzcan una proteccion substancial sin efectos
adversos (141). Las vacunas orales no previenen todos los casos de colera debido a que la inmunidad
local intestinal puede ser sobrepasada por un alto inoculo bacteriano, pero puede disminuir el riesgo
tanto como 80% si se utiliza de forma regular. Ademas, un programa de vacunacion podria trabajar de
forma sinergistica con los programas de sanitacion, por lo que el inoculo necesario para causar la
enfermedad aumentaria, y el numero de organismos patogenos en el ambiente podrian descender. asi,

24. los programas de vacunacion y sanitacion no deben ser vistos como estrategias alternativas de
prevencion sino mas bien como complementarias.
EL CÓLERA UNA ENFERMEDAD EMERGENTE Y REEMERGENTE
La epidemiologia moderna comenzo con el trabajo realizado por John Snow. Su laborioso estudio le
condujo a descubrir la forma de transmision de la enfermedad desde las aguas contaminadas de un
pozo de agua, del cual se abastecieron los enfermos, aun antes que se conociera la existencia de la
bacteria (142). Con su trabajo, Snow definio las caracteristicas epidemiologicas del Colera y establecio
las bases para su prevencion y control. las caracteristicas de la epidemiologia del Colera son (i) un alto
grado de agrupamiento de los casos por localidad o estacion, (ii) altas tasa de infeccion en los ninos de
1 a 5 anos en las areas donde la enfermedad es endemica, (iii) los patrones de resistencia a los
antibioticos cambian frecuentemente y de ano en ano, (iv) existe una diversidad clonal de las cepas y
(v) la proteccion contra la enfermedad se logra por mejoras en las condiciones sanitarias y en la
inmunidad existente. el Colera ha sido catalogado como una "enfermedad emergente y reemergente"
que amenaza a los paises en desarrollo (143).
Existen varios eventos que resaltan la importancia epidemiologica de esta enfermedad que incluyen la
reemergencia del Colera en latinoamerica en 1991 (109, 144), el brote explosivo de Colera entre los
refugiados de ruanda en Goma zaire, el cual resulto en cerca de 70.000 casos y 12.000 muertes en
1994, y la emergencia de V. cholerae o139 en el sub continente indio durante 1992-1995 (104). Cabe
destacar que, las cepas de la septima pandemia estan en continua evolucion y es razonable esperar
que evolucionen en nuevos clones patogenicos a traves de la adquisicion de nuevos factores de
virulencia o adaptacion.
CONCLUSIÓN
Los estudios recientes han acelerado el entendimiento del Colera. los resultados de distintos grupos de
in vestigadores han establecido que el genoma de V. cho lerae esta salpicado de elementos geneticos
de origen •gexterno•h. la transferencia horizontal de genes tie ne influencia en la patogenicidad y ha
sido importante en la evolucion de cepas de V. cholerae, como se evidencio en la aparicion del brote
del serogrupo o139. Todavia permanecen sin descifrar varios misterios en el origen de las cepas
patogenas, pero con las nuevas tecnologias de la proteomica y pos-proteomica, esperamos que se
develen datos significativos que puedan dar lu - ces sobre el origen de este patogeno, que fue en un
prin cipio una bacteria inocua de estuario.
REFERENCIAS