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Introducción
Significa "Escribir en Colores“.
Los componentes de una mezcla pueden
Cromatografía presentar una tendencia diferente a
permanecer en cualquiera de las fases
involucradas.
Es la separación de dos o más
compuestos químicos en un medio.
Aspectos históricos de la
cromatografía
La técnica de cromatografía aparece en
1850.
 El químico F.F.Runge, que trabajaba con
tintas, descubre que los cationes orgánicos se
podían separar por migración cuando se
colocaba una solución que los contenía sobre
un material poroso, como papel.
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Aspectos históricos de la Aspectos históricos de la
cromatografía cromatografía
 En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la  A partir de 1940 los métodos cromatográficos
cromatografía de columna para separar adquieren extensión mundial.
extractos vegetales coloreados. En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía. cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión
y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel
 En 1930 Lederer consigue separar los por sus trabajos en 1948.
colorantes de la yema de huevo.
 Para el mismo tiempo la cromatografía
 Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca comienza a aplicarse en el campo de la
desarrollan la cromatografía en el campo de la bioquímica.
química orgánica e inorgánica. Martin consigue separar algunos aminoácidos
Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, acetilados.
1938, 1939 respectivamente.
Conceptos generales Tipos de cromatografía
 La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas  Cromatografía plana: La fase estacionaria se
asociadas al principio de retención selectiva. sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
 Permite separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos Las principales técnicas son:
componentes. Cromatografía en papel
 Posee: Cromatografía en capa fina
 Fase móvil: consiste en un fluido (gas, líquido o fluido  Cromatografía en columna: La fase estacionaria
supercrítico).
 Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en se sitúa dentro de una columna.
un sólido. Según el fluido empleado como fase móvil se
 Los componentes de la mezcla interaccionan en forma distinguen:
diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil. Cromatografía de líquidos
 Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas Cromatografía de gases
velocidades y se van separando. Cromatografía de fluidos supercríticos`
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Aspectos históricos de los distintos Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía tipos de cromatografía
 Cromatografía en papel Cromatografía en capa fina
Fue desarrolla por Martin. Fue originada en 1938 por los trabajos de los
Tiene como soporte un papel de celulosa. investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.
Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas.
poder utilizar cantidades pequeñas de muestra En este tipo de cromatografía la fase
(miligramos y microgramos). estacionaria se extiende sobre un soporte
inerte (silica).
Stahl estandarizó el método para elaborar
capas finas por métodos mecánicos.
Cromatografía de columna Términos relacionados con el proceso
 Consiste en la aplicación de una muestra Matriz de la columna
compleja a una columna de cristal.
Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en Longitud de la columna
el solvente.
Volumen de la columna: volumen total
Se bombea una gran cantidad de solvente a través de
la columna. de gel.
 Las diferentes mezclas se van retrasando de manera
distinta según sus interacciones con la matriz. ‘Run Throught’: volumen de muestra mas
 Se pueden separar de acuerdo a su carga, su solvente.
hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a
grupos químicos particulares.
 La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar
mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
Esta técnica apareció durante la II Guerra
Mundial.
Tenía la finalidad de separar los elementos
alcalinotérreos y los elementos de transición.
En 1938 Taylor y Urey utilizan este método
para separar isótopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de
intercambio iónico.
Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de intercambio iónico
 Se realiza sobre matrices que tienen una carga Funcionamiento
neta.
 Carga negativa: intercambio de cationes
En unas condiciones determinadas serán retenidas
 Carga positiva: intercambio de aniones
en la columna las muestras que tengan una carga
complementaria a la de la matriz de la gel, siendo
 La carga de la matriz de la columna así como la eluidas las restantes.
carga de la muestra dependerá del pH del
solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la Para eluir las muestras retenidas se puede variar la
concentración de iones). carga iónica del solvente o su pH de forma que se
alcance el punto isoeléctrico de la muestra de
 Se usa en la separación de moléculas grandes interés o el de la matriz, neutralizando de este
(proteínas y ácidos nucleicos). modo la fuerza que retiene a la muestra en la
Cuando las separaciones exigen condiciones químicas columna.
fuertes se emplean intercambiadores iónicos
inorgánicos.
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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía Cromatografía de exclusión
 Cromatografía de gel-filtración  La cromatografía de exclusión molecular o de filtración
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como en gel, separa las muestras en base a su tamaño.
fase estacionaria geles se puede separar polímeros  La matriz de la columna esta formada por un polímero
sintéticos de alto peso molecular. entrecruzado con poros de tamaños determinados.
 Cromatografía de afinidad.  Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la
Porath en 1967 utiliza un péptido o proteína unida columna con mayor velocidad que las de tamaño
covalentemente a un ligando y la utiliza para la pequeño.
separación de moléculas proteicas.  Las muestras de menor tamaño, entran en los poros y
se mueven a lo largo de la columna lentamente porque
 Cromatografía de gas. tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en
Es una de las técnicas más utilizadas e importantes. el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo
 Ha revolucionado el campo de la química analítica. largo de la columna.
Cromatografía de exclusión Características de las matrices
 Hay diferentes tamaños de partícula para Deben ser estables.
un gel: Tener bajo contenido en grupos iónicos.
a menor tamaño mayor resolución y menor Uniformidad de poro y tamaño.
gasto en la columna. Los compuestos utilizados pueden ser
 Este técnica se emplea en la separación derivados de:
de proteínas de alimentos, determinación Dextranos (Sephadex)
de glucosa y fructosa en zumos de fruta, Agarosa (Sepharosa)
etc. Acrilamidas (Biogel P)
Esferas de vidrio
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Cromatografía de afinidad Ligandos de afinidad
 Permite la separación de mezclas por su afinidad o  Son las moléculas bioquímicas que se encuentran
capacidad de unión a un determinado ligando. ancladas químicamente sobre el soporte sólido
 Las muestras que se retienen en la columna son inerte, y son las responsables de la adsorción
aquellas que se unen específicamente a un ligando que específica de los solutos-analitos.
previamente se ha unido covalentemente a la matriz de  Se clasifican según su:
la columna.  Naturaleza - pueden ser macromoléculas biológicas o bien
 Después de que las muestra que no se unen al ligando moléculas de bajo peso molecular.
son lavadas o eluídas a través de la columna, la muestra  Actuación - se fundamenta en la selectividad de la retención
que condiciona las características de la cromatografía de
de interés que ha quedado retenida en la columna se afinidad. Se distinguen dos grandes grupos:
eluye (se libera) mediante el empleo de una solución  Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan
que contiene bien ligando libre u otro compuesto que reversiblemente a un solo soluto.
rompa la interacción entre el ligando y la proteína  Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de
compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.
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Electroforesis
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Introducción Conceptos generales
 La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el  La electroforesis es un proceso que se utiliza
químico sueco Arne Tiselius.
 Gana el Premio Nóbel en 1948 por los trabajos realizados. para separar macromoléculas en una solución.
 La electroforesis es una técnica analítica de separación Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga
de fundamento cinético basada en el movimiento o neta son colocadas en un campo eléctrico, estas
migración de las macromoléculas disueltas en un experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que
determinado medio a través de una matriz o soporte
reticulado como resultado de la aplicación de un campo posee carga opuesta.
eléctrico.  Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán
 El comportamiento de la molécula viene dado por su hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
movilidad electroforética: positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo
 La movilidad depende de la carga, tamaño y forma. positivo).
 Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra
un ión.
Conceptos generales Conceptos generales
 Los iones comenzarán a moverse formando
un frente cuya anchura aumentará con el
tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos
reducir el movimiento de las moléculas empleando
un medio que oponga mas resistencia a dicho
movimiento.
Una forma común de hacer esto es formar un gel.
 El gel consiste de un polímero soluble de muy alto
peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma
La fricción con el solvente dificultaran este movimiento originando un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.
una fuerza que se opone , por otro lado, las moléculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que
poseen energía cinética propia denominado difusión.
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Conceptos generales
 La velocidad de migración (v) de la
partícula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el
gradiente de potencial eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente
de fricción (f) relativo a la talla y forma de
la molécula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
V = q E / f
Métodos electroforéticos zonales Tipos de soportes
 Son los más comunes, dada su alta papel (celulosa)
aplicabilidad en diferentes campos.
 Son útiles para lograr la separación de almidón
mezclas complejas.
poliacrilamida
 Se aplican pequeñas cantidades de la
muestra a un soporte sólido. agarosa
 Los soportes son en general polímeros y acetato de celulosa
forman un gel poroso que restringe el
movimiento de las moléculas a través del
medio durante la electroforesis y disminuyen
los flujos de convección del solvente.
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Electroforesis de gel Electroforesis de gel
 La electroforesis en gel se utiliza en la
detección, control de pureza, caracterización,
cuantificación (por comparación con controles), Los geles más comunes son agarosa y
preparación y purificación (por extracción de poliacrilamida.
bandas desde el gel) de diferentes moléculas. La electroforesis en gel tiene dos
 Esta técnica tiene como ventaja su capacidad mecanismos de separación:
de separar macromoléculas de interés en la
industria biotecnológica y química. por la relación carga/tamaño
Ha sido un método muy útil para la separación de por tamaño
proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA
y RNA) con gran resolución.
Electroforesis de agarosa Electroforesis de poliacrilamida
 Permite separar moléculas de DNA, cuando Los geles de poliacrilamida se forman por
éstas son sometidas a un campo eléctrico y la polimerización de la acrilamida por
atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. acción de:
 La agarosa es un polisacárido (originalmente Agente entrecruzador ('cross-linking'): bis-
obtenido de algas, como el agar-agar, pero de acrilamida
composición homogénea), cuyas disoluciones
Catalizador: TEMED (N,N,N,N'-
(típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad
tetrametilnediamina)
de permanecer liquidas por encima de 50
grados C y formar un gel, semisólido al Iniciador: ión persulfato que se añade en forma
de persulfato amónico
enfriarse.
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Clasificación
 Electroforesis desnaturalizante
La más común: somete a las proteínas a migración
asegurando la completa desnaturalización (pérdida de
la estructura tridimensional).
La migración es proporcional a la carga y al tamaño de
la molécula pero no a su forma.
El agente desnaturalizante más empleado es el
sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
 Electroforesis nativa
Es la que somete a las proteínas a migración sin
desnaturalización.
Las proteínas migran en función de su carga, de su
tamaño y de su forma.
SDS-PAGE Electroforesis capilar
 Es una técnica alterna a la electroforesis convencional.
 Surge debido a que la velocidad de separación y
resolución de los compuestos mejora a medida que
aumenta el campo eléctrico aplicado.
 Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un
diámetro interno inferior a 0.1 mm y una longitud de 50
cm a 1 m.
 El mecanismo de separación está basado en las
relaciones carga/masa de los analitos.
 Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos
entre otras sustancias.
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