Conferencia: Saccharomyces cerevisiae. Dra. Alicia González Manjarrez

1. SIN DUDA Saccharomyces cerevisiae ES EL MEJOR AMIGO DEL HOMBRE Facultad de Ciencias 20 de Enero de 2011

2. 55 regiones duplicadas 376 pares de genes homólogos Identidad varía entre el 24 y el 100%, con un promedio de 63% Representan el 50% del genoma La duplicación en Saccharomyces cerevisiae Kellis, et al. (2004). Detalle del cromosoma 4

3. Dos levaduras diploides ancestrales, cada una con 5000 genes (8 cromosomas), se fusionaron para formar un tetraploide. Después de la duplicación, estas especies se hicieron diploides (sufrieron un decaimiento de identidad de secuencia) al perderse 85% de las copias duplicadas, y quedaron con 5800 genes, muchos duplicados. La levadura, un poliploide degenerado Pérdida balanceada y complementaria en las regiones pareadas, dejando al menos una copia de cada gen del conjunto génico ancestral Divergencia, 1.5 x 10 8 años Duplicación genoma, 10 8 años Fisiología de la levadura ancestral, más parecida a la de Kluyveromyces . Sintenia conservada

4. Diferencia fisiológica entre S. cerevisiae y otras levaduras, su habilidad para fermentar azúcares bajo condiciones aerobias y anaerobias , produciendo etanol. ¿Qué ventajas representó la duplicación? Aparición de un nuevo nicho ecológico Retención de vías glucolíticas Duplicación coincide con el tiempo en que las angiospermas se hicieron más abundantes Determinante en su adaptación evolutiva al crecimiento anaerobio: - Varios duplicados, regulados de manera distinta en condiciones aerobias y anaerobias - Otros codifican para transportadores de azúcares.

5. ¿Cómo se originan los genes? 1. Duplicación de genes preexistentes 2. Transferencia horizontal 3. Material no codificante

6. 72 % 16% descendientes de una duplicación g enómica 16 % Hace ≈ 10 8 años Duplicaci ón Genómica 28 % en mas de una copia 72 % 4n 2n

8. A B C D E F G H LEVADURA ANCESTRAL  150 m.a. Wolfe & Shields (1997) Nat ure 2n A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H Kluyveromyces lactis (aerobio estricto ) ANCESTRO DE Saccharomyces  10 0 m.a. 2n 4n Saccharomyces cerevisiae (anaerobio facultativo) A B C D E F G H A B C D E F G H 2n duplicaci ón genómica El ANCESTRO DE S.cerevisiae : UNA LEVADURA TETRAPLOIDE ¿LA RETENCION DE CIERTOS PARALOGOS ES UNA ADAPTACION AL METABOLISMO FACULTATIVO?

9. Lynch et al. (2001) Genetics Nonfunctionalization Neofunctionalization Subfunctionalization Sobre el destino de genes duplicados…… deletereous mutagenesis conservation 90% pierden la función 9% subfuncionalización 1% neofuncionalización

10. DUPLICACION GENICA Y EVOLUCION PREGUNTAS Cuando se retienen las dos copias de un gen duplicado: SUBESPECIALIZACION O REDUNDANCIA? SUBESPECIALIZACION Como evoluciona la proteina? Que papel juega la oligomerizacion en la diversificacion? Como evolucionan los elementos cis? Como se comportan los elementos trans que son comunes a los dos promotores, pero dan respuestas transcripcionales distintas? Y el ancestro????

11. DUPLICACION GENICA EVOLUCION ALT1-ALT2 LUIS ROBLEDO GEORGINA PEÑALOSA BAT1-BAT2 MARITRINI COLON FABIOLA HERNANDEZ JAMES GONZALEZ DIVERSIFICACION DE PROMOTORES HUGO HERNANDEZ CRISTINA ARANDA HETERO-OLOGOMERIZACION GEOVANI LOPEZ MARIANA DUHNE JOAO SANCHEZ COLABORADORES: LINA RIEGO - SLP ALEXANDER DE LUNA – GTO HECTOR QUEZADA – CARDIOLOGIA GABRIEL DEL RIO IFC RELOCALIZACION GEOVANI LOPEZ MIRELLE FLORES JOAO SANCHEZ ANCESTROS KARLA LOPEZ MARITRINI COLON ADRIANA NEBREDA LABORATORIO 301 DE ORIENTE ALICIA GONZALEZ-CRISTINA ARANDA

12. EXISTEN VARIOS MODELOS QUE EXPLICAN LA APARICION, MANTENIMIENTO Y EVOLUCION DE PARALOGOS MODELO DE Neofuncionalizacion PROPUESTO POR OHNO (1970) 1.-Un solo gen es suficiente para realizar la función, las copias extras son redundantes. 2.- Si la copia extra se fija en la población, el gen original mantendra su función y la copia nueva se pseudogenizara al acumular mutaciones neutrales de pérdida de función. 3.- Ocasionalmente el gen en proceso de pseudogenización puede acumular substituciones y adquirir una nueva función, que se mantendrá por selección positiva. MODELO DE Duplicación-degeneración-complementación PROPUESTO POR Force et al (1999) 1.- Ambas copias acumulan mutaciones degenerativas que resultan en que ninguna de las dos copias puede mantener la función, ambas copias se subfuncionalizan y se mantienen por selección. Ambas copias se requieren para llevar a cabo la función original. LOS CASOS DE GDH1-GDH3 Y LYS20-LYS21

13. NADP-GDH  -ketoglutarate L-glutamate L-glutamine citrate oxalacetate malate fumarate succinate NH 4 + NH 4 + NAD-GDH GS NH 4 + Gdh1 / Gdh3 Gdh2 GOGAT Glt1 Gln1 METABOLISMO CENTRAL DE NITROGENO glutaminasa aminotransferasa

14. CULTURE TIME (h) NADP-GDH ACTIVITY (U/mg) GDH1 GDH3 [glucose] [ethanol] GDH1,gdh3  GDH3,gdh1   6 G d h 1 p  6 G d h 3 p p H 5 . 8 0 1 2 3 4 5 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 NADP-GDH (U mg) -1 ) [  - c e t o g l u t a r a t o ] ( m M ) G D H W T  6 G d h 1 p  6 G d h 3 p [  - k e t o g l u t a r a t e ] ( m M ) NADP - GDH ACTIVITY (U/mg) GDH3 ACT1 G E GDH1 y GDH3 HAN DIVERSIFICADO:EXPRESION, PROPIEDADES CINETICAS, FORMAS OLIGOMERICAS

15. Identificación de interacciones proteína-proteína mediante el uso de fragmentos de la GFP Bi molecular F luorescence C omplementation (BiFC) Lys20Vn-His Lys21Vc-Kan Lys20Vn-His / Lys21Vc-Kan Lys20Vc-His / Lys21Vn-Kan L21 Geovani López et al L20 L20 L20 L21 L21

16. En glucosa la expresion de GDH3 se reprime por remodelacion de cromatina en etanol se dereprime p GDH3 3 2 1 4 * LacZ 3 2 1 2 3 4 G E 0.00 0.20 L 50 bp 0.00 0.10 0.20 DNA 0.10 MNase (U/ml) 800 600 400 300 200 700 500 1230 G E 5' 3' probe 800 600 400 300 200 700 500 1230 L 50 bp 0.00 0.10 DNA 0.20 0.00 0.10 0.20 G E MNase (U/ml) G E 3' 5' probe •••• •••• •••• +1

17. Función respiratoria  - KG citrato Glu  - KG citrate Glu TCA cycle  - KG succinato citrato Glu  - KG succinate citrate Gdh3p Glu pyruvate glucosa ethanol etanol acetyl-CoA acetyl-CoA Gdh1p ADP + Pi DeLuna et al. (2001) J Biol Chem Riego et al. (2002) BBRC Avendaño et al. (2006) Mol Microbiol Gdh1p La retención de GDH1 y GDH3 es una adaptación al metabolismo factultativo

18. LA APORTACION DE NUESTRO GRUPO: 1.- GDH1 y GDH3 se mantienen diversificando el perfil de expresión y las propiedades cinéticas de sus productos, y manteniendo la misma localización subcelular todo esto permite la formación de hetero-oligómeros ¿selección positiva? 2.- La distribucion de genes en los bloques dió como resultado la distribución de algunas copias de parálogos localizados en zonas de zonas de cromatina condensada y por tanto con promotores cerrados a la expresión

19. EL DOGMA DE Gln3 Gln3 UNICAMENTE DETERMINA LA RESPUESTA A LA CALIDAD DE LA FUENTE DE NITROGENO Pries, R., et al . (2002) Euk Cell 1(5)663; Beck, T. & Hall, M. Nature 402:689

20. LA EXPRESIÓN DE GDH1 Y ASN1 SE ACTIVA POR Gln3 DE MANERA NO ORTODOXA DAL5 SE REGULA DE MANERA ORTODOXA (DOGMATICA) Glutamine Proline ACT1 WT gln3  ure2  G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2  hap4  a b c WT gln3  ure2  DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3  ure2  WT gln3  ure2  Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1

21. EL DOGMA DEL COMPLEJO HAP El COMPLEJO HAP SIEMPRE ESTA CONSTITUIDO POR 4 SUBUNIDADES CODIFICADAS POR HAP2, HAP3, HAP5 Y HAP4. Hap2-3-5 CONSTITUYEN EL DOMINIO DE UNION AL DNA Hap4 CONSTITUYE EL DOMINIO DE ACTIVACION Hap2-3-4-5 DETERMINA LA ACTIVACION DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA RESPIRATORIA

22. CYC1 (citocromo C) SE REGULA POR HAP DE MANERA ORTODOXA (DOGMATICA) Glutamine Proline ACT1 WT gln3  ure2  G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2  hap4  a b c WT gln3  ure2  DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3  ure2  WT gln3  ure2  Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1

23. LA EXPRESIÓN DE GDH1 Y ASN1 DEPENDE DEL COMPLEJO HAP2-3-5 HAP4 NO PARTICIPA ¿QUIEN ACTUA COMO DOMINIO DE ACTIVACION? Glutamine Proline ACT1 WT gln3  ure2  G E-15 E-24 G E-15 E-24 G E-15 E-24 WT hap2  hap4  a b c WT gln3  ure2  DAL5 ASN1 GDH1 1 0.4 1.1 1 0.8 GDH3 1 0.6 1 1 0.8 1 15 1 2 WT gln3  ure2  WT gln3  ure2  Glutamine Proline ACT1 DAL5 ASN1 GDH1 1 0.7 1 0.8 GDH3 1 2 1 1 1 0.6 0.8 1 0.5 0.8 1 15 1 0.2 2 Glutamine ACT1 CYC1 ASN1 GDH3 GDH1 1 1 2 1 1 1 1 11 12 1 5 6 1 1 1 0.7 1 1 1 1 4 4 ACT1 ACT1 GLUCOSE ETHANOL 1 1 1

24. Hap2 RECLUTA A Gln3 A LOS PROMOTORES DE ASN1 y GDH1

25. ASN1 Y GDH1 TIENEN UNA ORGANIZACION QUE SUGIERE EL SITIO DE UNION DE HAP2-3-5-Gln3

26. UNA MUTANTE cis AFECTADA EN LAS TRES CAJAS GATAAG DE GDH1 PRESENTA UN FENOTIPO EQUIVALENTE AL DE UNA MUTANTE gln3   Y NO UNE A Gln3-Myc 13

27. Gln3-Myc13 COINMUNOPRECIPITA CON Hap2-TAP HAP2-TAP2  GLN3-myc 13 Myc Ab TAP Ab WCE Hap2-TAP

28. PARA EL CASO DE GDH3 ¿QUIEN FUNCIONA COMO DOMINIO DE ACTIVACION DE Hap2-Hap3-Hap5??? ¿Rtg3? -895 -378 (1) ATTGG ATG +1 (3) CTTATC -393 (5) GTTATC -253 GDH1 -1158 ATG +1 GATAAA (2) -452 (3) CTTAT (4) CTTATCGATAAG (5) -214 GDH3 (1) TTTATC -928 -845 CCAAT (1) GATAAA (1) -634 GATAAA (2) -518 (4) CTTATC -358 -351 CCAAT (2) -278 CCAAT (3) -284 (2) ATTGG CCAAT (3) -240 (6) TTTATC -173 GGTAC (1) -224 GGTAC (1) -46 GTCAC (2) -5

29. Hap2-3-5-Gln3 CONSTITUYE UN ACTIVADOR NUEVO YA QUE PROVOCA UNA RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL PECULIAR: ACTIVA LA EXPRESION DE UN GRUPO DE GENES EN GLUTAMINA COMO FUENTE DE NITROGENO POR LO TANTO…………………….. Gln3 TIENE OTRA FUNCION ADEMAS DE LA DESCRITA ¿CUAL ES EL GRUPO DE GENES REGULADO POR Hap2-3-5-Gln3 ? ???? EL PRESTAMO DE DOMINIOS PERMITE AMPLIAR EL REPERTORIO DE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES!!!!!!!!!!! ¿QUE TAN FRECUENTE ES EL PRESTAMO DE DOMINIOS? CONCLUSIONES

30. 1 30 1 1.7 1 2 1 5 1 1 1 2 1 2.3 1 1 1 1 1 6 1 1 1 2 1 11 1 1 1 1.7 DAL5 DAL1 GDH2 DUR1,2 HIS3 HIS4 1 3.2 1 2.3 GLN3 GCN4 1 3 1 1.2 ACT1 GDH1 1 3 1 1 1 2.5 a Gln3 y Gcn4 determinan la expresión de genes catabólicos y biosintéticos en condiciones de derepresión de N y deprivación de AA Gln3- regulador catabolismo Gcn4-regulador biosíntesis WT gln3  gcn4  3-AT - + - + - + GABA

31. DAL5 DAL1 gcn4Δ GLN3-myc 13 gln3Δ GCN4-myc13 GLN3-myc 13 DAL5 LEU4 DAL5 LEU4 DAL5 LEU4 GCN4-myc 13 DAL5 LEU4 GDH2 ATG -175 -350 -525 -700 DAL1 LEU4 gln3Δ GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4Δ GLN3-myc 13 DAL1 LEU4 DAL1 LEU4 DAL1 LEU4 ATG -175 -350 -525 -700 ATG -150 -300 -450 -600 GLN3-myc 13 LEU4 GDH2 gln3Δ GCN4-myc 13 LEU4 GDH2 GCN4-myc 13 GDH2 LEU4 gcn4Δ GLN3-myc 13 GDH2 LEU4 GLN3-myc 13 GABA-3AT (a) (b) (c) DUR1,2 DUR1,2 LEU4 -100 -200 -300 -400 ATG gln3Δ GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4Δ GLN3-myc 13 GLN3-myc 13 DUR1,2 DUR1,2 DUR1,2 LEU4 LEU4 LEU4 (d) Gln3 recluta a Gcn4 a los promotores catabólicos Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso y conservado Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso no conservado Sitio de union de Gcn4 (TGACTC) consenso y conservado Sitio de union de Gcn4 () (TGACTC) consenso no conservado INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab INPUT Myc Ab HA Ab no Ab

32. GDH1 GLN3-myc 13 gcn4Δ GLN3-myc 13 GDH1 gln3Δ GCN4-myc 13 GCN4-myc 13 HIS4 GLN3-myc 13 GCN4-myc 13 gcn4Δ GLN3-myc 13 gln3Δ GCN4-myc 13 LEU4 HIS3 HIS3 ATG -225 -450 -675 ATG -75 -150 -225 -300 ATG -50 -100 -150 -200 LEU4 HIS3 LEU4 HIS3 LEU4 LEU4 HIS3 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab HIS4 LEU4 HIS4 LEU4 LEU4 gcn4Δ GLN3-myc 13 HIS4 GLN3-myc 13 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab gln3Δ GCN4-myc 13 LEU4 GDH1 GCN4-myc 13 GDH1 LEU4 GDH1 LEU4 INPUT Myc Ab HA Ab no Ab GABA 3-AT (a) (b) (c) LEU4 HIS4 -900 Gln3 y Gcn4 se unen cooperativamente a los promotores biosintéticos Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso y conservado Sitio de union de Gln3 (GATAAG) consenso no conservado Sitio de union de Gcn4 (TGACTC) consenso y conservado Sitio de union de Gcn4 () (TGACTC) consenso no conservado

33. GLN3-myc 13 Gln3 y Gcn4 forman parte del mismo complejo transcripcional y determinan de manera conjunta la expresión de genes catabólicos y biosintéticos + − − − − + − − − − − +  -GCN4  -HA GLN3-myc 13  -MYC WCE

34. Gcn4-Gln3 CONSTITUYE UN ACTIVADOR NUEVO YA QUE PROVOCA UNA RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL PECULIAR: ACTIVA LA EXPRESION DE UN GRUPO DE GENES BIOSINTETICOS Y CATABOLICOS EN GABA 3-AT ¿CUAL ES EL GRUPO DE GENES REGULADO POR Gcn4-Gln3 ? ???? EL PRESTAMO DE DOMINIOS PERMITE AMPLIAR EL REPERTORIO DE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES!!!!!!!!!!! ¿QUE TAN FRECUENTE ES EL PRESTAMO DE DOMINIOS? CONCLUSIONES

35. MODELO DE Especializacion o solución de conflicto adaptativo propuesto Por Hughes (1994). Si el gen original realiza dos funciones que no pueden mejorarse de manera independiente sin afectar a la contraparte, despues de la duplicación cada una de las copias se especializa y mantiene por selección positiva. EL CASO DE BAT1-BAT2 y ALT1-ALT2

36. BAT1 y BAT2 CODIFICAN AMINOTRANSFERASAS DE AMINOACIDOS DE CADENA RAMIFICADA BAT1 BAT1 BAT2 BAT2 KIV KIV KMV KMV KIC Leu Val Val Ile Ile BAT1 Leu KIC

37. Bat1 - caracter biosintético Bat2 - caracter catabólico Bat1 localiza en mitocondria Bat2 localiza en citosol Bat1 y Bat2 HAN DIVERSIFICADO SU FUNCION

38. 1.-Las mutantes bat1  son braditrofas de valina 2.-Las mutantes bat2   estan alteradas en el catabolismo de V y I 3.-Bat1 y Bat2 son parcialmente redundantes + V + I + L + VIL + V + I + L + VIL NH 4 +

39. BAT1 - PERFIL DE EXPRESION BIOSINTETICO BAT2 - PERFIL DE EXPRESION CATABOLICO EL PERFIL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA SIGUE EL PERFIL DE EXPRESION Leu3 ES UN MODULADOR POSITIVO DE BAT1 Y MODULADOR NEGATIVO DE BAT2 NH 4 GABA VIL Val Ileu Leu SCR1 BAT2 SCR1 BAT1 GLN wt gcn4 Δ gln3 Δ leu3 Δ gln3/leu3 Δ Glutamina GABA wt gcn4 Δ gln3 Δ leu3 Δ gln3/leu3 Δ BAT1 BAT2 SCR1

40. + V + I + L + VIL 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 1 4 0 . 1 6 0 . 1 8 0 . 2 0 Growth rate (  ) + V + I + L + VIL NH 4 + KlBat1 es una proteína bifuncional El perfil de expresión de KLBAT1 es biosintético KlBAT1 KlSCR1 NH 4 GABA GLN VIL NH 4 VIL GABA VIL GLN VIL Klbat1  WT S. cerevisiae  1 1.2 1.6 0.3 0.4 0.6 1.6 0 0 w t k l b a t 1 

41. KlBAT1 no complementa mutantes bat2  glucose ammonium glucose VIL

42. Kl Bat1 es una enzima bifuncional La doble función de KlBat1 se ha distribuido entre las dos enzimas parálogas (Bat1 y Bat2) presentes en S. cerevisiae BAT1 y BAT2 han diversificado 1.- perfil de expresión 2.- localización subcelular diferencial de sus productos No pueden formar hetero-oligomeros Bat1 es indispensable para sintetizar la poza de V mitocondrial Bat1 y Bat2 se requieren para catabolizar VIL ¿selección positiva? La retención de BAT1 y BAT2 es una adaptación al metabolismo facultativo

43. DUPLICACION GENICA EVOLUCION ALT1-ALT2 LUIS ROBLEDO GEORGINA PEÑALOSA BAT1-BAT2 MARITRINI COLON FABIOLA HERNANDEZ JAMES GONZALEZ DIVERSIFICACION DE PROMOTORES HUGO HERNANDEZ CRISTINA ARANDA HETERO-OLOGOMERIZACION GEOVANI LOPEZ MARIANA DUHNE JOAO SANCHEZ COLABORADORES: LINA RIEGO - SLP ALEXANDER DE LUNA – GTO HECTOR QUEZADA – CARDIOLOGIA GABRIEL DEL RIO IFC RELOCALIZACION GEOVANI LOPEZ MIRELLE FLORES JOAO SANCHEZ ANCESTROS KARLA LOPEZ MARITRINI COLON ADRIANA NEBREDA LABORATORIO 301 DE ORIENTE ALICIA GONZALEZ-CRISTINA ARANDA

44. Gene Duplication and Diversification in the Yeast Saccharomyces cerevisiae : Differential Gene Expression of Paralogous Pairs

45. No hay verdades absolutas; todas las verdades son verdades a medias. El error consiste en tratarlas como verdades absolutas. Alfred North Whitehead Di álogos (1953)