clase sobre el pcr la electroracion ,vectores de clonamientos de plasmidos enzimas de restriccion clonacion de un gen , cromatografia,

1. BIOTECNOLOGÍA
2012
Clase 4
Prof. Oriana Salazar
Centro de Ingeniería Bioquímica y
Biotecnología
Dpto. de Ingeniería Química y Biotecnología
Fac. Ciencias Físicas y Matemáticas
Universidad de Chile
20 de Enero 2012

2. Endonucleasas de restricción
permiten fragmentar el DNA
Las secuencias
que son
reconocidas por
las Enzimas de
restricción son
palíndromes
Generan extremos
cohesivos o romos
20 de Enero 2012

3. Otras
enzimas
de
restricción
20 de Enero 2012

4. ELECTROFORESIS DE DNA: TÉCNICA PARA LA SEPARACIÓN
DE FRAGMENTOS DE DNA DE DIFERENTE TAMAÑO
20 de Enero 2012

5. Los fragmentos de
DNA producidos por
corte con una misma
enzima de restricción
pueden ser ligados
para formar
moléculas de DNA
recombinante.
20 de Enero 2012

6. Muchos vectores de clonamiento
son producidos a partir de
plasmidios
• Los plasmidios son DNA circular
extracromosomal que existe naturalmente en
bacterias y en levaduras; se replica en forma
autónoma.
20 de Enero 2012

7. Características de un vector de clonamiento
Sitios de corte por enzimas
de restricción
Gen de resistencia a Gen de resistencia a
ampicilina tetraciclina
Origen de
replicación
20 de Enero 2012

8. Clonamiento de un gen
20 de Enero 2012

9. Transformación de bacterias por
Electroporación
Bacterias huésped
vector
electroporador
Cultivo en placas
20 de Enero 2012

10. Sin embargo el procedimiento de transformación no es
100 % eficiente, por lo tanto se requiere un método
para seleccionar e identificar las bacterias realmente
transformadas con el plasmidio
12 h a 37 ºC
Crecimiento de colonias de
bacterias resistentes al
antibiótico, que por lo tanto
tienen el plasmidio
20 de Enero 2012

11. Cada colonia es un conjunto de
Cada colonia bacterias que tienen el mismo
representa un fragmento del genoma clonado
clon de
bacterias
genéticamente
idénticas.
20 de Enero 2012

12. CELULAS USADAS COMO HUESPEDES DE
CLONAMIENTO
1. Células procariontes:
Ej: Escherichia coli, Bacillus subtilis
Ventajas: crecimiento rápido, cultivo barato, fisiología y
genética bien conocida.
2. Células eucariontes:
Ej. Levaduras, hongos, células de mamíferos en
cultivo, células de insecto en cultivo.
Ventajas: estas células realizan modificaciones post-
traduccionales (ej. Fosforilaciones y glicosilaciones) que
son importantes para la actividad de muchas proteínas
de de Enero 2012
20
eucariontes.

13. Un vector de expresión:
usado para producir
proteínas recombinantes
Plac Olac su gen
favorito terminador
20 de Enero 2012

14. Bacterias bajo estrés metabólico por sobreproducción de una
proteína exógena (recombinante), baja la velocidad de crecimiento
de las bacterias.
Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para las
bacterias.
Es mejor separar la fase de crecimiento de las
células de la fase de expresión del gen heterólogo.
Prot recombinante
IPTG
IPTG = Isopropil
N de céls/ml
β-D galactósido
Análogo de lactosa,
inductor del
operon lac2012
20 de Enero
tiempo

15. Análisis de la producción de la
proteína recombinante
mediante electroforesis
20 de Enero 2012

16. El problema es: ¿Cómo identificar y aislar un
gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?
Gen de
interés
20 de Enero 2012

17. Reacción de
polimerización
de cadenas de
DNA (PCR)
20
ciclos
mas
2.097.152
copias 2012
20 de Enero

18. REQUERIMIENTOS PARA UNA REACCION DE PCR
• Dos oligonucleótidos sintéticos, complementarios a
los extremos del DNA de interes
´5'
3'
3' 5'
• Una enzima DNA polimerasa termoestable (Taq DNA
polimerasa)
• Los cuatro desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP).
• Una secuencia de DNA "blanco“ o molde.
20 de Enero 2012

19. Reacción de Polimerización de cadenas (PCR)
Si el gen que se
quiere aislar está en
el DNA cromosomal
Partidores
complementarios
al DNA de interés
20 de Enero 2012

20. El problema es: ¿Cómo identificar y aislar un
gen determinado desde un genoma que
contiene miles de genes?
Gen de
interés
Dos métodos:
A) PCR
B) Por hibridización en colonias
20 de Enero 2012

21. Traducción reversa de la
secuencia de aminoácidos de una
proteína
20 de Enero 2012