Guia practica microbiologia

ASOCIACIÓN
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
SEMESTRE 2013-I
IV CICLO
GUIA DE PRÁCTICA
DE
MICROBIOLOGIA MÉDICA

ASOCIACIÓN
UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA
INDICE
Página
Recomendaciones generales 3
Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4
Métodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7
Coloración diferencial de Gram 9
Coloración diferencial de Ziehl-Neelsen 11
Coloración especial: coloración de Leishman y Vago 12
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17
Metabolismo bacteriano 19
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma) 27
Reacción antígeno – anticuerpo: Aglutinación 29
Fagocitosis 31
Reacción de Precipitación 32
Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33
Preparación de Antígenos bacterianos 35
Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38
Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Género Streptococcus 40
Aislamiento e Identificación de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46
Estudio microbiológico de la flora normal de la Secreción Bucofaríngea 48
Aislamiento e Identificación de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50
Aislamiento e identificación de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54
Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56
Serología
Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo 59
Estudio e Identificación de Vibrio cholerae 62
Estudio e Identificación del Genero Leptospira 64
Estudio e Identificación de Bartonella 66
Estudio e Identificación de Treponema – Prueba de VDRL ó RPR 67
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68
Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71
Estudio e Identificación de Hongos Ambientales 74
Estudio e Identificación de Hongos Dermatofitos 78
Estudio de Hongos Levaduriformes: Observación de cortes histopatológicos 81
Estudio de Hongos Dimórficos: Observación de cortes histopatológicos 83
ANEXOS: SEMINARIOS:
Genética Microbiana e Ingeniería Genética 86
Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunación 87
Antibióticos y quimioterápicos 88
Enfermedades de transmisión sexual. SIDA 89
Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90

ASOCIACIÓN
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO
DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas,
mandil, plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores.
2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que se
tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instruccionescontrarias
Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodón los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden láminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabón.
12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.
El Profesor Responsable del Curso

ASOCIACIÓN
SIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA
PRÁCTICA N° 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio
compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
Láminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Láminas coloreadas
Suero fisiológico
Pipeta Pasteur
Plumón indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cm)
Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO
Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera
Tornillos macro y micrométrico
Revolver
Platina
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.
2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos
de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.

7
ASOCIACIÓN
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA
PRACTICA N° 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES
Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes
ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.
B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina
(ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicoscomo elazulde metileno,
cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes
derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -
Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana
Láminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriológica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China

8
Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloración
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersión
COLORACIÓN AZUL DE METILENO:
1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor
2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltansobreun fondo oscuro.
Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos
2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados

9
ASOCIACIÓN
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorantees
llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl
Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la
mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
 Muestra con mezcla de bacterias
 Solución fisiológica al 0.85%
 Láminas portaobjetos
 Asa bacteriológica de Kolle en aro
 Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina básica (colorante de contraste)
 Mechero de Bunsen
 Varillas para coloración
 Microscopio de luz con objetivo de inmersión
 Aceite de cedro
 Xylol
 Papel lente

10
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del
frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama
débil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución de
bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorarhastaque
no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.

11
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 3
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido de
lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada)quees
soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar enla célula yen
esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
 Láminas con frotices de bacilo tuberculoso
 Set de coloración Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)
 Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
7. Secar y observar con lente de inmersión.
RESULTADO
Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistentes se
tiñen de color azul.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

12
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 4
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los
colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos
presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de
microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
 Frotis de sangre con Bartonella
 Solución de colorante Leishman
 Agua destilada tamponada
 Microscopio con lentes de 100X
 Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.
2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIÓN DE VAGO
Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el
método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.

13
MATERIALES
 Lámina portaobjetos
 Palito mondadientes
 Set de coloración de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
 Asa de siembra en aro
 Microscopio con lentes de 100X
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro
Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que seencuentraformando parte
de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

14
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 5
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES,
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios
especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Segúnsu utilizaciónpuedenser:simples,
enriquecidos, selectivos y diferenciales.
MATERIALES
 Probetas de 100 ml.
 Balones de 250 ml.
 Tiras de Papel indicador de pH
 Frasco con solución NaOH (N/10)
 Frasco con solución HCl (N/10)
 Pinzas rectas
 Bagetas de vidrio
 Goteros de vidrio
 Trípodes con malla de Asbesto
 Tubos de 16x150 mm
 Tubos de 13x100 mm
 Placas Petri
 Frascos estériles
 Agua destilada
 Tubo con sangre citratada
Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo
 Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g
 Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g
 Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g
 Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g
 Agua destilada 100 ml Agua destilada 100 ml
 pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g
pH 7.0 - 7.4
Caldo peptonado
 Peptona 2.0 g
 Cloruro de sodio 1.0 g
 5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.
 6.0 gr. de Agar SS deshidratado.
 6.5 gr. de Agar TSI.
 2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons
 2.1 gr. de Agar Urea.
 1.7 gr. de Caldo MR VP
 3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

15
PREPARACION
I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al
calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es ácido
agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solución de
HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121ºC por 15 Minutos.
Controlar la esterilidad incubando a 37ºC por 24 horas. Luego dejar en refrigeración hasta su
utilización.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego
agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH ó HCl.
Luego envasar y esterilizar a 121ºC por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubación a
37ºC por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.
II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar
enfriar hasta una temperatura de 45ºC y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.
Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas
Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en
refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80ºC
hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y realizar control de
esterilidad y dejarlo después en refrigeración.
III. MEDIOS SELECTIVOS
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su
completa disolución. Autoclavar a 121º C por 15 Minutos y repartir en placas estériles.
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor
hasta su completa disolución. Repartir luego en placas estériles. No necesita autoclavar.
IV. MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azúcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir
hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a121º
C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final
tendrá un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá un color
verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolución y
autoclavar. Después adicionar 5 ml de Solución de Urea al 40% esterilizada por filtración;

16
mezclar homogéneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendrá
un color amarillo.
4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de
13x100mm y autoclavar a 121º C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolución
y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121º C por 15 min., y dejar enfriar los
tubos en plano inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C. Materiales que usaron para la preparación.

17
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 6
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las
24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos
y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por elcual se pone
en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias
técnicas de siembra, siendo las más usadas : La siembra por estría, por dispersión-agotamiento,
por inoculación y por puntura.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO : Diámetro en milímetros.
CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.
CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
 Tubos con suero fisiológico estéril
 Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
 Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
 Placas con Agar nutritivo
 Placas con Agar Mac Conkey
 Placas con Agar hipertónico de Chapman
 Tubos con Agar Sabouraud
 Tubos de 16x150 con medio hipertónico
de Chapman
 Torundas estériles
 Asas de siembra en aro y punta
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.

18
Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de
la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º y
continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con ayuda
del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacterianae introducirlo
hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA:
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de
cultivos sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA
SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION
AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIÓN
CARACTERISTICA
DE LA COLONIA
OBSERVACION DE
COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
FORMA
ELEVACIÓN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAÑO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS

19
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características
de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la
caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a niveldegénero y
especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y
sirvan como marcadores de identificación.
En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la
colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e
indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
específicos.
I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un
medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final
de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de hidratos de
carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades deácidos
mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible porelcambio
de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+
) se
manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.
A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos yproducir sulfuro de hidrógeno
(H2S).
El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es
el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en
este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentación de glucosa únicamente.
2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentación de carbohidratos.

20
Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba
del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
 Tubo con medio TSI en plano inclinado.
 Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la
superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se
encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada yla cantidad
de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la
utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que enelfondo,
por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.
3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos,porlo que
el tubo permanece amarillo.
4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización
oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+
), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )
2.
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,
fórmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos
frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para
mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo),
superando el sistema amortiguador del pH del medio.

21
3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la
glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil-
carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del
KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción
catalítica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
 Cepa bacteriana MR positivo y negativo
 Cepa bacteriana VP positivo y negativo
 Reactivo Rojo de metilo
 Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
 Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y
negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,
cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se
manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftoly0.2
ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos.Es
importante añadir los reactivos en el orden específico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los
cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco(NH3). El indol
puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en
forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que
contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

22
MATERIALES
 Cepa indol positivo y negativo.
 Medio líquido peptonado y/o Medio SIM
 Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino
benzaldehido).
 Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero
que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta
una prueba negativa.
III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia
Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distintade la fermentaciónde
los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su
metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta
característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye
uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye
citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única
fuente de nitrógeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de
amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversióndelNH3en
hidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado elazulde
bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES
 Cepa control citrato positivo y negativo.
 Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnivca de estría en cada tubo la
cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

23
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio
inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)
Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseenla enzimaureasa
que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:
O
║
NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH ═ (NH4)2 CO3
Ureasa
El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una
alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
 Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )
 Medio Agar urea según Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocularenel
fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.
Prueba negativa: El medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo
de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente
reacción:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa
negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).

24
MATERIALES
 Cepas Control: S. aureus, Streptococcus ó Enterococcus
 Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%
 Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados
falsos positivos.
PRUEBA EN LÁMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia
bien aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.
d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que
puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la
prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder
su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso
que ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO
DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia
son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30’, éstas
no son catalasa positivas.
VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro yactúan como el último eslabón de
la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de
agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios
facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzimao sonanaerobios
estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o
tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa

25
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los
discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIÓN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un
intenso color azul oscuro.
AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)
Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina
descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de gases
(CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).
Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la
superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH
del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad
al color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo
del tubo es amarillo y la superficie alcalina
Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta la
glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.
b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie
violeta/fondo amarillo).
c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
d) Producción de gas: ruptura del medio.
e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.
VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustanciastóxicas
que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre,
produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse
en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C

26
INTERPRETACIÓN
Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento delmedio
debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos del tipo de la biliverdina
Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara
alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
MEDIO DE
CULTIVO
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA
TSI
(Fermentación-
H2S)
VP
VOGES-
PROSKAUER
MR
ROJO DE
METILO
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
LIA
(Agar Lisina
Hierro)
HEMOLISINA

27
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 8
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:
 Método de dilución
 Método de Difusión en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los
antibióticos.
2. Interpretar los resultados del método utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la concentración
inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro”
bacteriano.
Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se
puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico
bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o
quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste ensembrar la
muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel
filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se observan las
zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el
disco difiere para los distintos fármacos.
MATERIALES
 Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya
 Tubos con caldo nutritivo
 Tubos con Agar semisólido
 Tubos con cultivo bacteriano
 Asas de siembra

28
 Torundas estériles
 Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).
 Pinzas
 Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano alrededorde
los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentesantimicrobianos
utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede
responder a dosis altas del antibiótico.
La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su capacidadde
difusión en el Agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano Código Resistente Sensible Antimicrobiano Código Resistente Sensible
Gram negativo Gram positivo
Amikacina AK-MK ≤ 14 ≥17 Ac.nalidixico NA ≤ 21 ≥ 16
Amoxicilina +
clavulanico AM ≤ 13 ≥ 18 Cefepima FEP ≤ 14 ≥ 18
Ampicilina AMP ≤ 13 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21
Cefalotina CFM ≤ 14 ≥18 Clindamicina CM-DA ≤ 14 ≥17
Cefotaxima CTX ≤ 14 ≥ 23 Cloranfeicol C ≤ 12 ≥18
Ceftazidima CAZ ≤ 14 ≥ 20 Eritromicina E ≤ 13 ≥18
Ceftriaxona CRO ≤ 13 ≥17 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15
Cefuroxina RBA ≤ 14 ≥18 Nitrofurantoina FD ≤ 14 ≥17
Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Norfloxacin NOR ≤ 12 ≥17
Cloranfenicol C ≤ 12 ≥18 Oxacilina AO ≤ 10 ≥13
Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Penicilina P ≤ 19 ≥20
Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Rifampicina RIF ≤ 16 ≥ 20
Tetraciclina T ≤ 14 ≥19 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18
Tobramicina NN ≤ 12 ≥15 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19
Vancomicina V ≤ 9 ≥12
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la práctica
desarrollada.

29
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 9
REACCION ANTIGENO – ANTICUERPO: AGLUTINACIÓN
La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción antígeno-anticuerpo en el
que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas puedenser
bacterias, eritrocitos, partículas de látex, bentonita, etc., yse encuentran recubiertasenforma natural
o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con
antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple
vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana,uno de
los más simples es la aglutinación en lámina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del
antígeno con el suero del paciente en una lámina. Esta técnica ofrece un método de muestreo rápido
para análisis de rutina.
MATERIALES
 Lámina para aglutinación ( láminas excavadas)
 Antígeno bacteriano
 Suero de paciente
 Pipetas serológicas de 0.2 ml
 Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lámina de
vidrio excavada.
2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero de un mismo paciente.
3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.
4. Hacer rotar suavemente la lámina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tiendenaagruparse en
la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO:
Realizar una aglutinación cualitativa y una cuantitativa

30
Aglutinación cuantitativa
REACTIVOS
TUBOS
1 2 3 4 5
ANTISUERO 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005
ANTIGENO AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO
TITULO 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
RESULTADO:
Título del suero: ………………………………………………………….
Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en práctica

31
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 10
FAGOCITOSIS
La línea celular de defensa está íntimamente asociada con la línea humoral. La fagocitosis o el
englobamiento de partículas extrañas por ciertas células es un fenómeno no específico, pero se
incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos o complementos. Entre las células
fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos (monocitos libres). A estas
sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antígenos más susceptibles a la fagocitosis se
les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS “IN VITRO”
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difíciles de realizar, en comparación conotraspruebas
serológicas, pero en ciertos sistemas es la única a ser utilizada. El antígeno y la sangre total
(conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de
estas mezclan se colorean.
El índice fagocítico es el número promedio de partículas ingeridas por cada 100 Neutrófilos de la
sangre.
MATERIAL
 Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o
Klebsiella
 Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA
sódica al 1%
 Una jeringa de 5 ml con aguja N° 20
 Pipetas Pasteur con perilla de jebe
 Colorante Wright
 Agua tamponada
 Baño María a 37°C
 Centrífuga
 Gradilla
 Microscopio con objetivo de inmersión
 Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodérmica recolectar 5 ml de sangre venosa.
2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
4. Llevar los tubos a Baño María por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glóbulos blancos de cada
tubo.
7. Realizar los frotices y colorear con Wright:
 Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.
 Añadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.
 Después de 15 minutos, lavar con agua de caño.
 Secar y observar con objetivo de inmersión.
RESULTADO
Se observará la presencia de gérmenes intracelulares que han sido fagocitados.

32
ASOCIACIÓN
PRACTICA N° 11
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reacción antígeno- anticuerpo, en el que el antígeno es de naturaleza soluble. Cuando se
mezcla un antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de
equivalencia y visibles por lo general macroscópicamente. Las reacciones de precipitación pueden
realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada técnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentración de Inmunoglobulinas en el
suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja
gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antígeno, procediéndose
luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observándose la formación de un halo circular
de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración antigénica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada también método de Ouchterloni, es útil para comparar antígenos, detectar anticuerpos
precipitantes, anticuerpos antinucleares y antígenos en enfermedades.Enestaprueba se emplea Agar
semi-sólido en portaobjetos, en el cual se efectúan perforaciones, los cuales se llenan con los
elementos reaccionantes (antígeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horasde incubaciónatemperatura
ambiente, observamos la aparición de bandas de precipitación.
MATERIALES
 Suero positivo
 Antígeno
 Láminas de vidrio con Agar noble al 1%
 Placas Petri
 Pipetas capilares
 Láminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
2. Depositar en los orificios periféricos los antígenos a estudiar.
3. Colocar las láminas en una cámara húmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitación que se forman:
Identidad total : Las bandas de precipitación se unen.
Identidad parcial : Se observa un espolón.
No identidad : Las bandas se cruzan.

33
INMUNOELECTROFORESIS
Es útil para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, permitiendo medir e identificar
componentes séricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinación de la electroforesis con la inmunodifusión. En una primera fase los
antígenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su
movilidad en un campo eléctrico, luego de una corrida electroforética, se coloca el antisuero en una
especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las proteínas que han migrado. Luego
de incubar, se forman bandas de precipitación frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.
PRACTICA N° 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA
INTRODUCCION
En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos para la detección de antígenos virales
como de anticuerpos específicos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacióno la
prueba de Fijación de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada
utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromogénicos, las que producen una
reacción de color. Estas pruebas se conocen como “Análisis de Inmunoabsorbencia Ligada a
Enzimas” (enzime- linked immunosorbent assay) ó ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es
necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran número de muestras
simultáneamente en forma rápida y automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinación de Anticuerpo en fase sólida
 Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo ó perla, esto consiste en absorber la superficie de la
placa con el anticuerpo específico antiviral o anticuerpo de captura.
 Luego se añade la muestra clínica, si esta contiene antígeno viral se unirá al anticuerpo de
captura
 Esta unión se detectará mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas más
usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina ó biotina- aviclina.
 Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el
antígeno.
 Añadir el sustrato de la enzima.
 Observar la presencia de color.
LECTURA
 El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colorímetro o un
espectrofotómetro.
 A mayor cantidad de antígeno presente en la muestra, más intenso será el color observado.

34
ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA
(Ensayo Inmunoenzimático para la detección de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia humana
HIV-1 grupo O y HIV-2)
SUSTRATO A
20 ul.
Cromogénico
PLACAS CON SUEROS CONJUGADO
(Ag-Ac color
celeste) SOLUCION
GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS + (Peroxidasa con Ig G + SUSTRATO B + DE
DEL VHI DE PACIENTE
Antihumana) 5ul C/
pozo Buffer Peróxido PARADA
Hidrogeno 100
ul
CONTROL + INCUBAR INCUBAR
30 min a 30 min a
37° 37°
CONTROL +
Absorber
CONTROL -
LAVAR LAVAR
twin
salino
twin
salino
CONTROL - 1/10 1/10
(5 veces)
CONTROL -
PACIENTE
PACIENTE
SECAR SECAR
PACIENTE la placa la placa
(tomado de Wiener lab.)

35
ASOCIACIÓN
MICROBIOLOGIA MÉDICA
PRACTICA N° 13
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antígeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce
la formación de anticuerpos o la aparición de fenómenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en
presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo específico, dando lugar a
fenómenos perceptibles.
Los Antígenos más comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,
hematíes, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antígeno en dosis adecuadas y
generalmente progresivas con las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formación de anticuerpos que los protejan contra
determinados procesos infecciosos. Este método conocido como vacunaciónconfiere inmunidad
adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales serán empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, tétanos, etc.,
en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una
inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificación de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de
clasificación, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las
Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.
I. PREPARACION DE ANTIGENOSBACTERIANOSSOMATICOSY FLAGELARES
A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A. MATERIAL
 Cultivo bacteriano en medio sólido y en desarrollo confluente
 Cultivo bacteriano en medio líquido (caldo nutritivo)
 Pipetas graduadas estériles de 5 cc.
 Suero fisiológico estéril, repartido en frascos de 100 cc.
 Embudos y gasa, estériles para filtrar
 Acido fénico concentrado en tubos de 13x100 ml.
 Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.
 Pipetas de Pasteur, estériles
 Escala de MacFarland (tubo Nº 3)
 Pipetas graduadas de 1 ml.
 Tubos vacíos estériles de 16x150 ml.

36
 Algodón y Alcohol yodado
 Agar nutritivo en placas y tubos
B. PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiológico estéril a los cultivos
bacterianos presentados en medio sólido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar
3. Filtrar a través de gasa estéril
4. Separar la suspensión en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
5. Para preparar el Antígeno somático "O", medir la cantidad de suspensión bacteriana
de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una
concentración de 0.5%.
Se puede así mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antígeno a la
ebullición durante dos horas, o tratándolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antígeno flagelar "H", inactivar las fracciones somáticas en el otro
tubo de suspensión bacteriana, agregando formol puro hastaalcanzaruna concentración
del 0.5%
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108
gérmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de
suero fisiológico, gotas de cada uno de los antígenos concentrados hasta alcanzar una
turbidez similar al tubo Nº3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Método turbidimétrico de cálculo bacteriano, que consiste en diluir el antígeno y
apreciar la turbidez obtenida comparándola con la de los tubos patrones de un nefelómetro o
determinándola con exactitud mediante un Espectrofotómetro.
El Nefelómetro más conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solución de Cloruro de Bario al 1%
Otra de Ácido sulfúrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacíos y estériles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cl2Ba 1%
0.1 cc.
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
H2SO4 1% 9.9 cc. 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0
Bacterias
por cc.
3.0 x
108
6.0 x
108
9.0 x
108
1.2 x
109
1.5 x
109
1.8 x
109 2.1 x
109
2.4 x
109
2.7
x
109
3.0
x
109

37
La unión de ambos reactivos químicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al
homogenizarse da una turbidez que es más intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario
empleado. A cada tubo corresponde una concentración de gérmenes determinada, de acuerdo a lo
señalado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antígenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la
finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observación a las 18 ó 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la práctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc.,
1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antígeno, con intervalo de 4 a 5 días.
2. Realizar la sangría después de 4 días de la última inyección.
E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIÓN (DEMOSTRACION)

38
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,
agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S.aureus,S.
epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S.
aureus produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
 Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado
 Placas Petri con Agar sangre (AS)
 Tubos con Caldo plasma
 Set de colorantes para Gram
 Asa de platino en aro
 Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar sangre,
por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las
características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman
(tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una colonia
de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba de la
coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y
como indicador de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina

39
RESULTADOS:
1. Características macroscópicas de la muestra:
2. Resultado de la coloración realizada
3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus coagula
el plasma.
4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparición de
burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de
S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.
6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es sensible
y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamaño de la
colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
MH
o
Manitol
salado
AS
(Agar
sangre)
COAGULASA CATALASA GRAM Característica
morfológica

40
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificaciónde Lancefield
en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis);
H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con
la coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son
patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del
cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permitediferenciar
algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glóbulos
rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucede en la hemolisis
tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo
de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina.Elgrupo deestreptococos
alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en
presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las
especies de Streptococcus.
MATERIAL
 Cultivo de Streptococcus en medio de
caldo BHI
 Placas con Agar sangre de carnero
 Torunda estéril y bajalengua
 Tubos con Thioglicolato
 Tubos con caldo Inulina
 Discos de Bacitracina
 Discos de Optochin
 Solución de Desoxicolato al 2%
 Tubo con ClNa al 6.5%
 Set de colorantes de Gram- Kopeloff
 Asas de Kolle, pinzas
 Microscopio, aceite de inmersión.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce
turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y
agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetos y
colorear por Gram.

41
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el disco
de Optochin,
4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.
5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
7. Realizar la prueba de la catalasa
8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias
de lisarse en presencia de sales biliares
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S. pneumoniae
son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la Bacitracina
y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de
Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa que las
colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el
efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y
ácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial de oxido-
reducción del medio.
6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)
7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
ORGANISMO
SENSIBILIDAD CAMP Hidrólisis
De
Metabo
lismo
de la
Inulina
Desarro
llo en
NaCl
6.5%
Lisis por Bilis
Bacitra
cina
Opto
chin
Hipu
rato
Escu
lina
Desoxi
colato Sodio
- hemolíticos
GRUPO A
S. pyogenes
S R N N N N N N
GRUPO B
S. agalactiae
R* R P P N N P* N
GRUPO C, F, G R R N N N N N N
- hemolíticos
GRUPO Viridans R* R N N N* N N N
S. pneumoniae R S N N N P N P*
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reacción variable

42
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO
NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstas N.
gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En
muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de
metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate,que
le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de 7.2 a
7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfológicamente similares.
La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono: Glucosa,
maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el laboratorio.
Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recolección correcta de la muestra.
b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.
c) Selección del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
 Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria
 Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
 Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
 Reactivo de Citocromo- oxidasa
 Reactivo de catalasa
 Set de coloración de Gram

43
 Colorante de Azul de metileno
 Microscopio
 Asas de siembra en aro y punta
 Solución de alcohol yodado
 Algodón y Xilol.
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circulares de
bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas sicorrespondena
N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero, circulares,
translúcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota delreactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2-3 minutosel
cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lámina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVO
MUESTRA
COLONIAS TAMAÑO GRAM AZUL DE
METILENO
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
OXIDASA CATALASA

44
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:
GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que
pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedades en el
hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se
encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se presenta
como un bacilo rectilíneo, Grampositivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, las colonias
son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en
largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
MATERIALES
 Placas Petri con Agar nutritivo
 Placas Petri con Agar sangre
 Tubos con Caldo nutritivo
 Tubos con Agar semisólido
 Tubos con gelatina
 Láminas para frotices
 Set de coloración de Hiss para cápsula
 Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas
 Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersión

45
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersión
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especiespatógenas
y ß- hemolíticas en las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido
En Gelatina: sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el
centro del bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro.
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO BACILLUS
ESPECIE PATÓGENA ESPECIE SAPROFITA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semisólido
Hemolisis
Hidrólisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentación salicina
Movilidad

46
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
LISTERIA
INTRODUCCION
El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y
presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V ó
de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición,enelsuelo,
en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los
ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, desarrolla
bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL
 Tubos con Caldo nutritivo
 Tubos con medios semisólidos (Motilidad)
 Placas Petri con Agar sangre
 Placas Petri con Agar nutritivo
 Tubos de 13x100 con:
 Agar urea de Christensen
 Citrato de Simmons
 Caldo rojo de fenol con glucosa
 Caldo rojo de fenol con sacarosa
 Caldo rojo de fenol con lactosa
 Caldo rojo de fenol con manita
 Caldo rojo de fenol con salicina
 Caldo esculina
 Caldo:
 MR-
 VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina y
laminilla.

47
3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.
LECTURA
 FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.
 LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40
aumentos.
 EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.
 EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.
 EN MEDIOS DIFERENCIALES: Observar
MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +
HEMOLISINA + SACAROSA - VP +
CATALASA + LACTOSA -
OXIDASA - MANITA -
UREA - SALICINA +
CITRATO - ESCULINA +

48
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 19
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION
BUCOFARINGEA”
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma
continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependende la
edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de
cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes
alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en
los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos presentan un gran desarrollo de
levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patógenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertónico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estériles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
Varillas para coloración

49
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los
medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente ypruebas de
patogenicidad si se requiere.
Caldo plasma en tubo
- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos.

50
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL-
RESISTENTES
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar,
poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamente
en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en elaire,en
el agua y en la tierra.
Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis,que
puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los
mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico
específico a través de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra ó enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia,
también, son patógenos.
MATERIALES
 Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo
 Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
 Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis
 Láminas con extensión de otros tipos de Micobacterias
 Set de colorante de Gram
 Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)
 Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.
2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la
lámina portaobjetos nueva.
3. Fijar la preparación.
4. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen

51
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen
porque no son ácidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementosbacilares rojosen
un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, según el siguiente cuadro:
Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++): Más de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que esta en tratamiento ypermite
detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos en
grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ó más días. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estímulo de la luz. Son fotocromógenas.
Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estímulo luminoso. Son escotocromógenas.Ejemplo: M.
scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontáneamente, ni por estímulo luminoso.
Son no cromógenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y
M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 días o menos.
GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica correspondiente.

52
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se incluyen
especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las características comunes del género son:
1) Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en
“letras chinas”,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda,contagiosa y
febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe,
además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina difterica). Es
propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias
superiores.
El género se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales;
Grupo II : Corinebacterias fitopatógenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patógenas.
Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son: C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión
inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
MATERIAL
 Cepa de Corynebacterium diphtheriae en
caldo enriquecido
 Placa con Agar sangre
 Placa con Agar chocolate telurito de
potasio
 Tubo de 13x100 con medio Pai en plano
inclinado
 Set de colorante de Gram
 Set de colorante de Albert
 Tubos con Agar Urea Christensen en
plano inclinado
 Caldo Rojo de fenol + Glucosa
 Caldo Rojo de fenol + Maltosa
 Asas de siembra
 Microscopio

53
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inóculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el método de
dispersión agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por
estrías. Incubar por 48 horas a 37°C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.
4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo
Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético,alcohol
etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1
minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
 En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados
ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o
dispuestos paralelamente, o en forma de “letras chinas”.
 En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro
 En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram
negativos) observar los tres tipos de bacilos diftéricos:
a) Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.
b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
c) Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.
 En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con
bordes enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta
hemolisis.
BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae
Hemolisis: Beta (sólo el Tipo mitis) Gelatina : Negativo
Catalasa : Positivo Sacarosa : Negativo
Movilidad: Negativa Glucosa : Negativo
Urea* : Negativa Maltosa : Positivo
Nitrato : Positivo Lactosa : Negativo

54
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 22
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:
GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes
para su desarrollo “In Vitro”.
Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,
principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales,
esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con
riesgo de vida fatales.
La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.
aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42°C.
MATERIAL
 Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.
 Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
 Agar nutritivo en Placa Petri
 Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
 Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100
 Medio TSI
 Reactivo de Oxidasa
 Frasco con cloroformo
 Set de colorantes Gram
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de
Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas
conocidas.
3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.

55
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de
color verdoso y un olor característico.
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio
de oxidación- fermentación (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el
Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la
piocianina.
PROTOCOLO
CARACTERÍSTICAS MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Crecimiento en Mac Conkey
Reacciones en TSI
Difusión de Pigmento en Agar nutritivo
Prueba de Citocromo- oxidasa
Solubilidad Cloroformo- piocianina
Crecimiento Agar nutritivo
Agar semisólido

56
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO
BRUCELLA
HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas.
Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como elAgar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar laproducciónde H2S,
hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y
requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula óseao biopsias
de ganglios linfáticos e hígado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La
incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de:
1. Aglutinación rápida en placa
2. Aglutinación lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA

57
MATERIAL
 Tubo con cepa de Brucella
 Frascos con medio de Ruiz- Castañeda
 Muestra de sangre total de paciente
 Agar fucsina en placa
 Agar Thionina en placa
 Suero positivo y suero control negativo
 Antígeno estandarizado de Brucella
 Láminas excavadas
 Pipetas de 0.2 ml
 Palito mondadientes
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e
incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram,
siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea de
la lámina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilución más alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos más.
6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una reacción
positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.

58
INTERPRETACION
SUERO ANTIGENO DILUCION / TITULO
0.08 + 0.03 25 ó +
0.04 + 0.03 50 ó ++
0.02 + 0.03 100 ó +++
0.01 + 0.03 200 ó ++++
0.005 + 0.03 400 ó +++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE
BRUCELLA
PRUEBAS DE DIFERENCIACION
Huésped
Preferido
Necesidad
CO2 (5%)
Producción
de H2S
Hidrólisis
de Urea
Crecimiento en
Fucsina
0.002 %
Thionina
0.002 %
B.abortus Bovino + ++ Débil + -
B.melitensis Cabra, oveja - - Débil + +
B.suis Cerdos - + Fuerte - +
B.canis Perros - - Fuerte - +

59
ASOCIACIÓN
PRACTICA Nº 24
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunosde
los cuales son patógenos para el
Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el
COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el
aislamiento del agente patógeno bacteriano.
La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en
determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en elorganismo
enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la
E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones
oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e
infección y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y
causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B ó C.
El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la
Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.
El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otrascausantesde infecciones
urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.

60
MATERIALES
 Muestra de heces.
 Placas Petri con Agar Mac Conkey
 Placas Petri con Agar SS
 Placas con Agar Manitol
 Tubos con Agar Sabouraud
 Tubos con medio TSI, LIA
 Tubos con caldo peptonado
 Tubos con Citrato de Simmons
 Tubos con caldo MR-VP
 Frasco con Lugol
 Reactivo para Citocromo-oxidasa
 Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
 Reactivo para Rojo de metilo
 Láminas portaobjeto y cubreobjeto
 Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)
 Juego de colorantes para Gram
 Material básico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de
sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de
solución salina.
b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,
Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA,
Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en
las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las
características.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y
producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador
púrpura de bromocresol]

61
EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el
reactivo de Kovac tornándose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como
fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (colorazul),
negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay
producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color
amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le
añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo
(color amarillo).
PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la
colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso
contrario no habrá ningún cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay
movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUÍMICA
Especies
TSI
(glucosa, sacarosa
lactosa,SH2 )
LIA
Lisina
Cp
Indol
Ct
Citrat
o
MR-VP Oxidasa
Ac.
Sup
Ac.
Fon
Ga
s
SH2
Escherichia coli
+ + + - V + - + - -
Klebsiella
+ + + - - V + - + -
Salmonella typhi
- + - + + - + + - -
Shigella
- + - - - V - - - -
Proteus
- + - V - - V + - -

Guia practica microbiologia

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Similar a Guia practica microbiologia

Similar a Guia practica microbiologia (20)

Más de Ediberto Hinostroza Antonio

Más de Ediberto Hinostroza Antonio (6)

Último

Último (20)

Guia practica microbiologia