1. Universidad Autónoma de Sinaloa
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Tema:
ELISA, Western blot, Inmunohistoquimica,
Inmunofluorescencia.
Maestra: Dra. Elsa Maribel Aguilar Medina
Alumno: Tzamin Alfredo Ayala Felix(autor)
Grado: 4
Grupo: 3
Materia: Inmunología aplicada
Culiacán, Sin., martes 10 de septiembre de 2013

2. ELISA
ENSAYO DE INMUNOSORBENTE LIGADO A
ENZIMA

3.  Fue desarrollada por Eva Engvall y Peter perlmann
en 1971.
 Es un método analítico que depende de la reacción
Ag-Ab.
 Determinación cualitativa y cuantitativa de Ag y Ab.

4.  El inmunoensayo enzimático es una técnica en la
cual uno de los reactantes, el Ab o el Ag, se fija a un
soporte solido antes de su interacción con el
reactante complementario.
 Esta técnica es muy versátil y por esto hay diversas
variantes de la misma dentro de las cuales las mas
comunes son ELISA directo, indirecto y en sandwich.

5.  Para la realización de esta prueba se utilizan diversas
enzimas, como : peroxidasa de rábano, la fosfatasa
alcalina y la beta-galactosidasa.
 Para el revelado del sistema se utiliza el sustrato de la
enzima; a veces se requiere del uso simultaneo de un
cromógeno, en el caso de la peroxidasa de rábano el
sustrato utilizado es peróxido de hidrogeno y el
cromógeno utilizado es orto-fenilendiamina, en otras
ocasiones el cromógeno forma parte del sustrato como
para la fosfatasa alcalina es el p-nitrofenil fosfato.

6.  También se utilizan soluciones para diluir los
reactantes y lavado de los posos, la mas utilizada es
el regulador de fosfatos 0.01M en solución salina
.15M a un pH 7.4 (PBS), algunos recomiendan
adicionar tween 20 al .05% (PBS-T)

7.  Un paso que no se debe olvidar en las tecnicas de
ELISA es el bloqueo de los posos con soluciones de
proteínas ajenas al sistema Ag-Ab. Los bloqueadores
mas utilizados son albumina, gelatina, caseína y
leche descremada.

8. Pasos generales de un ELISA:
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno
tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo
no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color

10. ELISA Indirecto

11. ELISA en Sandwich

13. Western blot
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA

14.  Por este método es posible la identificación de una
proteína específica en una mezcla compleja de
proteínas.
 En la Western blot, una mezcla de proteínas se
separa por medios electroforéticos en un gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

17. Inmunohistoquimica

18.  La inmunohistoquímica es una técnica esencial en el
diagnóstico anatomopatológico de las enfermedades,
fundamentalmente de las neoplásicas.
 La inmunohistoquímica se puede realizar en tejidos
de biopsia y de autopsia, generalmente fijados en
formol e incluidos en parafina, así como en material
de citología.

19. Etapas
 Obtencion de las celulas o tejidos.
 Fijacion
 Union con anticuerpos
 Deteccion de la reaccion Ag-Ab

20. Tipos de muestras
 Cultivos celulares que crecen en un soporte de vidrio
( tipo portaobjetos).
 Centrifugados de celulas en suspensión colocadas en
un portaobjetos.
 Frotis de tejido
 Cortes de tejidos.

21.  Fijacion:
Inmovilizar al Ag sin modificarlo, mantener la
estructura celular, permitir el acceso de los Ab.

22.  Hay tres factores principales que determinan la
facilidad de detección de un Ag.
1. Concentración local del Ag.
2. Tipo de fijador y Ab usado
3. Método de detección empleado.

23. Tipos de tecnicas
 Directa : el marcador se acopla o conjuga
directamente
 Indirecta: el marcador se acopla a un Ab secundario.

25. Inmunofluorescencia
Fluorocromos:
 Isotiocianato de fluoresceina. (VERDE)
 Rodamina
 Ficoeritrina.