Evaluación de la eficacia de los agentes antimicrobianos

1. Universidad Autónoma de Yucatán
Facultad de Química-Ingeniería Química
Licenciatura en Química Aplicada
Quinto Semestre
PRÁCTICA 6:
“Evaluación de la eficacia de los agentes
antimicrobianos”
Asignatura:
Microbiología
Profesor:
Fecha de entrega: 17 de noviembre de 2016

2. 2
Introducción
La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos
en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos
infecciosos que se desarrolla en los pacientes1
.
Como un comentario adicional, hay que recordar que muchas veces,lo que se observa in vitro
no correspondiente a lo observado in vivo, razón por la cual, los señores clínicos deben poner
especial atención en el seguimiento clínico de su paciente. La no concordancia entre los
hallazgos en el laboratorio y la respuesta del paciente a la terapia antimicrobiana, tiene
diferentes explicaciones, algunas de las cuales tienen relación con el comportamiento de los
microorganismos y otras con el comportamiento individual de cada paciente.
La razón fundamental de una prueba de sensibilidad es la de realizar una predicción a través
de una prueba in vitro, observar la respuesta del paciente a un determinado antibiótico, la
evolución de la infección y detectar una resistencia relevante del organismo que está
causando este proceso infeccioso1
.
Hay aún muchos agentes microbianos para los cuales la escogencia de una terapia
antimicrobiana continúa siendo empírica, porque estos agentes no han desarrollado
resistencia contra los antibióticos2
.
Por esta razón, la prueba de sensibilidad adquiere una mayor importancia para algunas
especies bacterianas que no tienen una sensibilidad predecible. Ejemplos claros de este
último tipo de microorganismos son: Staphylococcus sp.,Enterococcus sp.,Pseudomonas sp.
y los miembros de la familia Enterobacteriaceae1
.Otros organismos donde la prueba de
sensibilidad, sobre todo en los últimos años, ha adquirido una gran importancia son:
Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria
gonorrhoeae y Mycobacterium tuberculosis3
.
La técnica de difusión en agar4
, es cualitativa y sus resultados se pueden interpretar
únicamente como sensible, intermedio o resistente, y está diseñada específicamente para
bacterias de crecimiento rápido domo los Staphylococcus sp. O los integrantes de la
familia Enterobacteriaceae.
Esta técnica, el inóculo bacteriano llevado a una concentración igual a la del estándar 0,5 de
McFarlane, se aplica sobre la superficie de una placa seca de agar Müeller-Hinton que tenga
un pH entre 7, 2 y 7,4 medido a temperatura ambiente y una vez solidificado el medio de
cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de solidificado el medio de cultivo.
La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de forma tal que se logre un crecimiento
confluente4
.Una vez realizado esto, en un plazo no mayor de 15 minutos, se procede a colocar
los discos o las pastillas con el antibiótico. Si se emplean placas de petri de 100 mm de
diámetro, el número máximo de discos a colocar es de 52
.
Luego, la placa se incuba a 35ºC en aire ambiente y por un periodo no mayor a las 18 horas
excepto para los aislamientos deStaphylococus sp y Enterococcus sp, para los cuales se
recomienda una incubación de 24 horas, principalmente para lograr una mejor detección de
la resistencia a la oxacilina y a la vancomicina4
. Cada plato es observado en una luz indirecta
y cada halo de inhibición es medido utilizando un caliper o en su defecto una regla graduada

3. 3
en la forma adecuada. En el caso de que no se presente un halo, no se debe reportar Omm,
se debe reportar 6 mm, ya que ese es el diámetro del disco.
Los diámetros alrededor de cada disco son medidos y su interpretación se basa en guías
publicadas cada cierto tiempo, por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory
Standards) y el organismo es reportado como sensible, intermedio o resistente al antibiótico
testado (2, 3, 4). Cada antibiótico tiene su halo de inhibición específico y éste depende del
tamaño de la molécula del antibiótico y su polaridad; de esta manera, un antibiótico con un
peso molecular bajo como la penicilina, tendrá mucha capacidad para migrar, por lo tanto su
halo, en el caso de una cepa sensible tendrá un diámetro muy amplio. En el caso de la
vancomicina, que tiene una molécula muy grande y muy hidrofóbica, suhalo de inhibición será
muy pequeño. De esta manera, no se puede afirmar, que para una cepa determinada, ésta es
más sensible a la penicilina que a la vancomicina, sólo porque el primero tenga un halo de
inhibición mucho mayor4
.
La técnica de difusión en agar, presenta varias ventajas: es fácil de efectuar y de gran
reproducibilidad, posee bajo precio y no requiere equipo especial1
. Dentro de sus desventajas
está el hecho de que brinda sólo información cualitativa. Otra desventaja y la más importante,
es que esta técnica debe ser modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o
de crecimiento lento3
.
Organismos con Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoecae,
Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis, necesitan de una técnica de difusión
modifica, modificación que se hace principalmente en el periodo de incubación, en el medio
de cultivo a emplear, en la atmósfera de incubación y en la preparación del inóculo1
.
Para Haemophilus influenzae, lo recomendado es poner a crecer al organismo en un agar
chocolate suplementado, preparar el inóculo en un caldo de Müeller-Hinton o solución salina
estéril al 0,9%, realizar la prueba de sensibilidad sobre el agar HTM e incubarlo a 35ºC por 16
a 18 horas en una atmósfera de 5 a 7% de CO21
.
Para Neisseria gonorrhoecae se debe utilizar agar base GC suplementado (4) y
para Streptococcus pneumoniae agar sangre al 5% y que tenga Müeller-Hinton como base.
Para ambos, la incubación debe ser un poco más prolongada que para H. Influenzae (20 a 24
horas), manteniendo el resto de condiciones igual (35ºC y 5 a 7% de CO2)1
. Para estos
agentes fastidiosos, existen guías propias de la NCCLS que se emplean para conocer si las
cepas se reportan como sensible, intermedio o resistente4
.
En especial, para el caso del Streptococcus pneumoniae, lo recomendado es el empleo de un
disco de oxacilina de 1 ug de potencia. Una vez incubado por 24 horas, si el halo encontrado
es menor de 20 mm, la cepa se considera resistente y debe ser confirmado realizando una
prueba más específica que nos informe hasta dónde llega esa concentración1
. Para esto se
hace una CMI, ya sea por microtitulación o por la técnica del E test1
.
Por el contrario, si el halo de inhibición es mayor de 20 mm, se considera que la cepa es
sensible a la penicilina, con una concentración mínima inhibidoria menor de 0,006 g/ml1
.

4. 4
Objetivos:
Identifica las técnicas microbiológicas comúnmente utilizadas en la evaluación de agentes
antimicrobianos sobre cepas bacterianas y observa la respuesta frente a diferentes tipos de
compuestos.
Materiales y métodos:
Lista de materiales
Puntas estériles para micropipeta de 1000 µL
Puntas estériles para micropipeta de 100 µL
8 tubos con 9 mL de solución salina isotónica estéril
Papel estraza,
Algodón
Benzal
Marcador indeleble
Cultivos de 12 h de los siguientes microorganismos: Salmonella enteritidis, Candida
albicans.
Equipo
Mechero bunsen
Incubadora a 37 ºC
Soluciones de: ampicilina y ketoconazol con 100, 1500 y 5000 μg/mL.
Soluciones de desinfectante comercial de verduras o para limpieza: 1:10, 1:100 y 1:1000
Diagrama ecológico
Resiudos
Guantesde nitrilo,
cubrebocas
Residuos
Biológicos
Peligrosose
Infecciosos
Sanitas,papelesde
limpeza
Residuos
Inorgánicos

5. 5
Metodología
En condiciones asépticas, se prepararon dos cajas de Petri con 20 -25 mL de AN en Agar
Müeller-Hinton, con cepas de Salmonella enteriditis y un agar de papa dextrosa con una cepa
de Candida albicans. Se dividió la base de cada caja en cuatro cuadrantes para identificar las
concentraciones a probar. Se introdujo un hisopo estéril en la suspensión de la cepa
correspondiente y se sembraron las placas mediante la técnica de estriado continuo. Tras
hacer este, mediante pinzas esterilizadas, se tomó un disco de papel filtro que se sumergió
en agua destilada estéril y se deja escurrir. Se colocó en el centro del cuadrante “control”,
asegurando el contacto del disco sobre el agar. Se sumergieron otros discos de papel en las
diferentes concentraciones de los antibióticos el mismo procedimiento para cada una de las
cepas y diluciones correspondientes de cada agente. Se incubaron las placas a 37°C durante
24 horas. Después de ese tiempo, se sacaron las cajas Petri, y se observaron los resultados.
Se retiraron con la pinza de disección los discos y se el diámetro (mm) de las zonas de
inhibición del crecimiento microbiano en relación al control.
Resultados y discusiones
En total se realizaron tres experimentos con tres muestras de cajas Petri debido a la falta de
tiempo. Las pruebas que se realizaron, así como el tipo de microorganismo y el agar en que
se cultivó, se enlistan a continuación:
 En Agar Müeller-Hinton, se cultivó una muestra de Salmonella enteriditis, en esta
prueba se utilizó desinfectante como agente microbiano.
 En otro Agar Müeller-Hinton, se cultivó otra muestra de Salmonella enteriditis, para
esta prueba se utilizó ampicilina como agente microbiano.
 En agar papa dextrosa, se cultivó una muestra de Candida albicans, para esta prueba
se utilizó ketoconazol como agente microbiano
No se obtuvieron en el experimento los resultados deseados, esto se debe a que durante el
procesos de colocación de los discos, éstos no se agitaron mientras estaban sumergidos en
los agente. Esto provocó que algunos diámetros halos de inhibición no tuvieran un diámetro,
distinguiéndose más en las pruebas con desinfectante y ampicilina. Por lo que los resultados
obtenidos, no necesariamente reflejarían el comportamiento de estos agentes con respecto a
las cepas en donde se colocaron.
Cantidad de agente antimicrobiano
(desinfectante)
Diámetro de inhibición
1:10 4 cm
1:100 3 cm
1:1000 2.8 cm
Tabla 1. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de desinfectante
En la Tabla 1, se observa que los resultados de los diámetros de inhibición del dsinfectante
fueron concordes a lo que se estimaba, siendo más grande aquél a una concentración mayor

6. 6
de desinfectante. En la Figura 1, se observa la muestra trabajada con el desinfectante, y es
posible notar un halo de inhibición, en los cuadrantes respectivos, sin embargo, estos halos
no se encuentran completamente libres de microorganismos. En base a estas observaciones,
se puede concluir que la cepa tuvo un comportamiento intermedio de resistencia.
Figura 1. Halos de inhibición del desinfectante en agar Müeller-Hinton en una cepa de
Salmonella entérica.
Se comparó el experimento con un estudio de la calidad sanitaria del pollo crudo que
caracterizaba fenotípicamente las cepas aisladas de Salmonella enterica. Los resultados de
este estudio permitieron evidenciar que todas las cepas de Salmonella aisladas fueron
inhibidas por los tres desinfectantes probados (hipoclorito de sodio, bromuro de lauril-dimetil-
bencilamonio y ácido acético), incluso a diluciones mayores a las utilizadas rutinariamente.
Por lo tanto, la utilización de estos desinfectantes a las concentraciones adecuadas,
conjuntamente con buenas prácticas en la manufactura de los productos avícolas, podrían
disminuir la carga microbiana y, eventualmente, evitar los problemas de contaminación
cruzada con Salmonella spp., entre otros enteropatógenos5
. Esto evidenció que la utilización
de desinfectantes en los protocolos de higiene y saneamiento en las industrias o comercio de
alimentos, ayudarán a contener y minimizarla selección,transmisión y diseminación de genes
de resistencia en la población bacteriana6
.
Cantidad de agente antimicrobiano
(ampicilina)
Diámetro de inhibición
100 2 cm
1500 3.4 cm
5000 3.7 cm
Tabla 2. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de ampicilina
En la prueba con ampicilina, los resultados no fueron tan claros como en el anterior
experimento. En este caso, en la Tabla 2 se nota la escasa variación de los diámetros, sobre

7. 7
todo entre 1500 y 5000 g/ml. En la figura 2 se observa la presencia de halos, pero no son
tan visibles como en la prueba con desinfectante. Cabe resaltar el halo de 100 g/ml, en el
que apenas se logró distinguir la silueta del halo. Con estas observaciones, se concluye que
la cepa tuvo un comportamiento resistente a la adición de ampicilina.
Figura 2. Halos de inhibición de la ampicilina en agar Müeller-Hinton en una cepa de
Salmonella entérica.
Se comparó el experimento con un estudio en el que se obtuvieron un total de 68 aislados
de Salmonella entérica provenientes de bovinos, equinos, cerdos,gaviotas y alimentos, de los
que se puso a prueba la ampicilina entre otras técnicas. Los resultados fueron de alta
resistencia a dichos agentes microbianos. Algunos de estos compuestos, junto a las
tetraciclinas, han sido utilizados por décadas en la producción animal, ya sea como profilaxis
o con fines terapéuticos, y en tratamiento de infecciones humanas por lo que su resistencia
está ampliamente difundida7
. Es por esto que estos tratamientos en la actualidad son poco
efectivos, como por ejemplo el uso de amoxicilina en personas8
.
Cantidad de agente antimicrobiano
(ketoconazol)
Diámetro de inhibición
100 No se detectó halo.
1500 No se detectó halo
5000 2 cm
Tabla 3. Medidas de diámetro de inhibición por cantidad de ketoconazol
La prueba con ketoconazol en agar papa dextrosa arrojó resultado negativos. En la Tabla 3
se indica la presencia de un solo halo en el cuadrante con mayor concentración (5000 g/ml).
Estos datos se confirman analizando la muestraque se presenta en la Figura 3, donde apenas
se aprecia la presencia de un solo halo en el cuadrante que indica la tabla. Con estos datos

8. 8
(se considera el factor anteriormente mencionando que afecto el rendimiento del agente), se
establece que la cepa fue resistente ante el ketoconazol.
Figura 3. Halos de inhibición del ketoconazol en agar papa dextrosa en una cepa de
Candida albicans.
Se comparó con un estudio de Candida, cultivada en Sabouraud 0.5 %, a 37 ºC por 24 horas,
con Micostatin a una concentración de 5000 mg/l como control positivo, El crecimiento de C.
albicans en las diferentes cajas de agar pasada la exposición al extracto es en algunos casos
nulo, mientras en otro a pesar de ser visualmente perceptible la disminución en el crecimiento,
son aún incontables el numero de colonias presentes, lo cual el porcentaje de inhibición
presentado es un estimativo próximo al valor real, tras el recuento de las cajas. Se realizaron
pruebas de actividad antifúngica realizadas a través diferentes especies de melastomatáceas
y una especie de rubiácea concluyéndose que había actividad antifúngica comparada con
Micostatin al 2% contra Candida albicans9
.
Conclusión
Debido al factor que afectó la prueba, ninguno de las tres pruebas fue capaz de actuar
efectivamente sobrela cepa del microoganismo,sin embargo, eso no significa que los agentes
estudiados sean ineficaces. Un mejor procedimiento posiblemente permitirá la obtención de
resultados más eficientes, que permitan entender de manera más acertada, el
comportamiento de estos agentes microbianos sobre las cepas de distintos microorganismos.
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Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American
Society of Microbiology. Washington D. C., 1995
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In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M
et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.

9. 9
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