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Estandarizacion de urianalisis

  1. 1. JORNADA DE CAPACITACIÓN Y ACTUALIZACIÓN LABCARE. COLOMBIAPORQUÉ ESTANDARIZAR EL URUANÁLISIS? Martha Guerra de Muñoz Bacterióloga MSc. Pontificia Universidad Javeriana 2010
  2. 2. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc IntroducciónEl Uroanálisis es el examen de laboratorio más utilizado pero a su vez el menosestandarizado, al que se le dedica menor tiempo en su procesamiento y sobre el queno se realiza Garantía de Calidad. Sin embargo, hoy en día se reconoce que elanálisis cuidadoso del examen físico, del químico y de los componentes del sedimentopuede proporcionar información temprana sobre el estado metabólico, endocrino,integridad anatómica del riñón y la existencia y grado de la lesión renal; por ello sepuede definir como "Biopsia Renal Indolora".Dos características únicas explican la importancia de practicar el Uroanálisis: es unamuestra fácilmente disponible de recolectar además de que proporciona informaciónrápida y segura sobre muchas de las funciones metabólicas del organismo.La selección del personal que labora en el laboratorio, el Aseguramiento de laCalidad, la preparación cuidadosa del paciente, la obtención y el manejo escrupulosode las muestras, así como la limpieza del material y la supervisión del adecuadofuncionamiento del instrumental, son los primeros pasos que garantizan resultadosválidos, que son frecuentemente obviados. Es importante resaltar, que la orina es unproducto biológico y puede afectarse por el ejercicio, algunos medicamentos, ademásdel tipo de alimentación.El examen de la orina cualitativo/semicuantitativo con tiras reactivas y el microscópico(sedimento) son los más populares y ensayos básicos del laboratorio clínico. Sinembargo, la exactitud y la precisión de las pruebas no han sido tan fiable como el dela Química Clínica o la Hematología, debido fundamentalmente, a la inestabilidad dela muestra de orina y a los procedimiento de análisis subjetivos. Aunque se han hechoavances significativos en la metodología, sensibilidad y especificidad de las pruebasquímicas, al examen del sedimento le falta, en ocasiones, estandarización, control decalidad adecuado y automatización.El valor del examen microscópico depende de dos factores fundamentales: el análisisde una muestra adecuada y del entrenamiento del profesional que realiza el estudio.En 1926, Addis desarrolló un procedimiento para cuantificar los elementos formes enel análisis microscópico en muestras de orinas recolectadas durante 12 horas. Sinembargo, en la actualidad este método no es recomendable, por que muestras que Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 2
  3. 3. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSccontengan microorganismos ureasa positiva hidrolizan la urea presente originandobióxido de carbono (CO2) y amoniaco (NH3) el cual alcaliniza la orina induciendo lisisde los elementos formes. Se hacen esfuerzos para mejorar la confiabilidad mediantetécnicas estandarizadas, control de calidad adecuado y educación continuada delprofesional. Por lo anterior, cada día surgen nuevos métodos que permitenestandarización del procedimiento microscópico.Las normatividades internacionales establecen directrices para la organización yfuncionamiento correcto del laboratorio y del área de Uroanálisis respectivamente, conel fin de obtener resultados de utilidad clínica. Dentro de los componentes delUroanálisis, el examen microscópico es la parte más dependiente de error humano yla que consume mayor tiempo en el análisis de rutina; está sujeto a numerosasvariaciones, incluyendo el método de obtención del sedimento, la cantidad examinada,la metodología, instrumentos y equipos empleados para obtener mejor visualización yla forma en que se interpretan los resultados, es por ello, que el Instituto deEstándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI: Clinical and Laboratory StandardsInstitute) antes Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS:National Committee on Clinical Laboratory Standards), recomienda utilizar un sistemaestandarizado para el examen microscópico, o bien, un sistema automatizado.La estandarización pretende eliminar las posibles causas de variación, como son: eltiempo y velocidad de centrifugación, la decantación, el volumen de orina y delsedimento, la superficie de conteo, la microscopía y la interpretación de los resultadospor los profesionales involucrados, sin olvidar, que se debe implementar un sistemade control de calidad interno y externo.Actualmente se cuenta con sistemas estandarizados que cumplen los lineamientos dela norma, uno de ellos es el sistema Kova®, metodología eficiente para cuantificar loselementos del sedimento, con él, se puede reportar el número de células por campo opor microlitros (μL). Como complemento, el examen químico sirve de parámetro decomparación para detectar falsos positivos y negativos, sin embargo, está sujeto aalgunas variaciones obteniendo una interpretación subjetiva esencialmente cuando serealiza lectura visual. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 3
  4. 4. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc PARÁMETROS EVALUADOS EN EL UROANÁLISISEl Uroanálisis lo conforman cuatro partes: valoración de la muestra, pruebas físicas,examen químico y del sedimento.Obtención, conservación y transporte de la muestraExisten riesgos en la fase preanalítica del Uroanálisis que pueden invalidar loshallazgos posteriores cuando no se siguen estrictamente las reglas de la preparacióndel paciente, y el cuidado extremo en la recolección y en la conservación de lamuestra. Para conseguir una muestra que represente en forma fidedigna el estadometabólico del paciente, con frecuencia es necesario regular algunos aspectos de suobtención. Estas condiciones especiales pueden incluir el momento de la obtención, elconsumo dietario y de medicamentos, y el método de obtención.Los métodos para recolectar la orina difieren de acuerdo a la edad, condición delpaciente y/o del tipo de muestra que se desea obtener. Se pueden agrupar en: noinvasores (espontánea, con bolsa recolectora y catéter vesical) e invasores (punciónsuprapúbica, cateterización vesical).Tabla 1. Métodos de recolección de orina Método Fiabilidad de la muestra Método de elección en pacientes mayores de 3 años. Fiable para el seguimiento rutinario. La negatividad de la Micción voluntaria muestra estudiada descarta infección, pero la positividad no la confirma No se debe emplear si se precisa utilizar antibioticoterapia Bolsa adhesiva inmediata Fiable si se realiza con técnica adecuada, fácil de efectuar en niñas. En varones se debe evitar traumatismo uretral extremando Cateterismo transuretral el cuidado al aplicar la técnica Punción suprapúbica (PSP) Muy fiable Complicaciones Contraindicaciones Hematuria macroscópica (0,6%) Deshidratación Micción reciente (< 1 h) Distensión abdominal Perforación intestinal Anomalías mal definidas del TU Peritonitis (excepcional) Diatésis hemorrágica urinario Hematomas de la pared abdominal Bacteriemia anaerobiaDe acuerdo con la “Guía Europea para el Uroanálisis” (European Urinalysis Guidelinesdel European Urinalysis Group 2), de las diferentes muestras de orina, con la que se Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 4
  5. 5. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScobtienen mejores resultados, es la primera de la mañana, inmediatamente se levanteel paciente, antes de desayunar o realizar actividad, porque tiende a ser uniforme yconcentrada, asegurando así, la detección de sustancias que quizá no esténpresentes en una muestra al azar y diluida (particularmente para valoración deproteinuria, en especial la ortostática, y la densidad), revela prontamente el deterioro,la habilidad de concentración del riñón, y es la que probablemente, contendráleucocituria en presencia de infecciones. Otra ventaja que ofrece la primera orina de lamañana es que está sometida, en menor medida, a desviaciones debidas a la dieta,actividad física y posturales.Se recomienda evitar utilizar recipientes desechables, irrompibles, químicamentelimpios, secos y provistos de tapa (deben cerrar herméticamente), de boca ancha yetiquetas estables, abrirlos sólo en el momento del empleo; lavarse la región genitalcon jabón (en el caso del varón, el glande deberá exponerse adecuadamente; lasmujeres deberán separar los labios de la vulva), y enjuagar bien con agua, no secar.Dejar caer la fracción inicial de la orina en el sanitario recogiendo la muestra de laporción intermedia de la micción en el recipiente sin que este llegue a estar encontacto con el cuerpo; además, debe evitarse contaminación. Por ejemplo, si se estáen periodo menstrual debe realizarse el examen 3 días después. Cerrar el recipiente yllevarlo inmediatamente al laboratorio para el análisis. En lactantes y niñospequeños pueden recolectarse las muestras en colectores pediátricos que se fijan alos genitales, y en casos especiales, se utiliza cateterismo transuretral y punciónsuprapúbica.El transporte debe realizarse colocando hielo natural en un recipiente hermético y elfrasco con la muestra dentro del mismo. En caso en que amerite refrigeración másprolongada debe emplearse hielo seco.Es de vital importancia impartir instrucciones claras y concisas, en forma oral y escritaa los pacientes, sobre la toma y conservación de las muestras.El análisis de la orina debe realizarse sin tardanza, máximo dos horas. Tiemposprolongados entre la recolección y el análisis pueden causar entre otras cosas lassiguientes alteraciones: cambios en el color por oxidación o reducción de metabolitos;turbidez secundaria a multiplicación bacteriana y a la posible precipitación del materialamorfo; utilización de la glucosa (glucólisis) por células y bacterias. Sin embrago, sihay glucosuria elevada, las bacterias y levaduras la convertirán en alcohol y ácidos yel pH descenderá. Por su parte, puede ocurrir la síntesis o catabolismo de nitritos;disminución de las cetonas que pueden ser utilizadas debido a la volatización de laacetona y al desdoblamiento del ácido acetoacético por bacterias; aumento del pH poramoníaco que se forma por el catabolismo bacteriano de la urea por enterobacterias,con pérdida de CO2; sangre falsamente positiva, por actividad de peroxidasas de lasbacterias; lisis de leucocitos, eritrocitos y cilindros en orina hipotónica y alcalina, (si elpH de la muestra es bajo y la densidad es elevada, > 1,015, el deterioro tarda mástiempo en ocurrir), oxidación de la bilirrubina y del urobilinógeno, los cuales pueden Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 5
  6. 6. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScdisminuir su concentración, fundamentalmente, si existe exposición a la luz. Estosprocesos pueden retardarse si la orina es conservada en el refrigerador.Identificación de la muestraEn pacientes hospitalizados antes de obtener la muestra es indispensable identificarloteniendo en cuenta el número de cama, de habitación o de historia clínica y confirmarpersonalmente con el paciente mismo (si esto es posible) sus nombres y apellidos.Las muestras de orina deben ser etiquetadas y rotuladas con la información siguiente: • Nombre completo del paciente • Número de historia clínica.Además, deben acompañarse de una solicitud médica, la cual debe contener losdatos adicionales de identificación del paciente tales como: • Género • Edad • Tipo de paciente (hospitalizado o ambulatorio) • Fecha • Hora de la recolección • Tipo de muestra • Medicamentos • Posible diagnósticoEvaluación de la muestraAntes de proceder a cualquier prueba, es preciso evaluar en la muestra de orina suaceptabilidad. Las diversas consideraciones incluyen: etiquetado apropiado, unamuestra óptima para la prueba solicitada y una buena conservación.Cada laboratorio debe tener y hacer cumplir unas normas escritas para la aceptacióno rechazo de las muestras. En una muestra apropiadamente etiquetada debe constarel nombre completo del paciente, la fecha y el momento de la recolección.Adicionalmente cada institución tendrá sus criterios. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 6
  7. 7. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc EXAMEN FÍSICOComprende: volumen, aspecto, color, olor, densidad urinaria y espuma.VolumenEl volumen de la orina no hace parte del Uroanálisis, sin embargo, es indispensableen aquellos exámenes que se realizan en orina de 12 y 24 horas (orina minutada) loscuales pueden resultar útil para el diagnóstico clínico. El volumen diario en un adultosano es aproximadamente de 800 a 1500 mL y oscila entre 600 a 2000 mL. La orinanocturna no supera en general los 400 mL. Los niños de corta edad eliminan unacantidad de orina por kilogramo de peso 3 a 4 veces superior a la de los adultos.Durante la gestación la variación diurna normal, se invierte originando nicturia y orinadiluida.Un volumen superior a 2000 mL en 24 horas recibe el nombre de poliuria. Ladisminución del volumen urinario se denomina oliguria y corresponde a una excreciónmenor de 500 mL al día. La anuria es la virtual suspensión completa de la formaciónde orina o volúmenes inferiores a 100 mL/ día.AspectoLa orina normal, limpia y reciente es usualmente transparente pero puede modificarsedebido a la presencia de cristales provenientes de la dieta o metabolismosintermediarios, mucoproteínas, proteínas, bilirrubina o gérmenes infectantes. La tabla1 muestra algunos cambios que puede exhibir la orina.Tabla 2. Cambios en el aspecto de la orina Cambio Causas Color y transparencia Muy diluida debido a la incapacidad para concentrar la orina (lactantes, Incoloro diabetes insípida, ADH inadecuada con algunos diuréticos), ingestión aumentada de líquidos Con frecuencia por precipitación de fosfatos en orina alcalina. Presencia de carbonatos, uratos, ácido úrico. Turbia Leucocitos dispersos y en acúmulo (piocitos), bacterias, levaduras, cristales, cálculos Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 7
  8. 8. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc Hematuria microscópica, pocos eritrocitos, líquido prostático, Ahumada espermatozoides; mucina, filamentos mucoso. Abundantes leucocitos polimorfonucleares (PMN) (piuria). Lechosa Quiluria (filariasis). Grasa en la nefrosis; traumatismos por aplastamiento, en especial de Opalescente huesos largos. Bacterias.ColorEl color de la orina normalmente es amarillo, sin embargo, puede exhibir una ampliagama de colores. Puede variar de amarillo pálido a ámbar oscuro según laconcentración de los pigmentos urocrómicos (sulfuro que contiene sustancias denaturaleza desconocida producto de la oxidación del urocromógeno incoloro) y enmenor cuantía, la urobilina (producto de degradación de la hemoglobina) y lauroeritrina. Se considera que la excreción de urocromo es proporcional almetabolismo basal y aumenta durante la fiebre, tirotoxicosis y la caquexia. Elpigmento rosado (uroeritrina) puede depositarse en los cristales de ácido úrico o enlos uratos (en sedimento como polvo de ladrillo) que no debe confundirse con loshematíes. Cuanto más pigmento tenga mayor será la intensidad del color. Aún dentrode la normalidad el color puede variar dependiendo de la ingesta de líquidos,alimentos o medicamentos. Cuando se abandona la muestra a temperatura ambiente,suele adquirir un color más profundo como consecuencia del viraje de cromógenosincoloros a compuestos coloreados. Las orinas patológicas presentan diferentescoloraciones, frecuentemente debidas a sangre, pigmentos biliares o metabolitosproducidos por desórdenes metabólicos.Algunas de las sustancias que pueden influir en el color de las orinas se resumen enla tabla 3Tabla 3. Causas de modificaciones del color de la orina Color Patológicas Alimentos o medicamentos Incolora o Abundante ingesta de líquidos amarillo Diabetes insípida diluídos claro Fosfatúria, piuria, quiluria, lipiduria, Dietas ricas en purina Nublado hiperoxaluria (hiperuricosuria) Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 8
  9. 9. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc Frijoles Levodopa, metronidazol, Castaño Pigmentos biliares, mioglobina nitrofurantoína, algunos agentes antimalaria Negro- Pigmentos biliares, melanina, Levodopa, metildopa, parduzco metahemoglobina metronidazol, imipenem, fenoles Amitriptilina, azul de metileno, Azul- Pseudomonas spp, ITU, biliverdina riboflavina, clorofila (dentríficos), verdoso cimetidina (intravenoso) Pigmentos biliares Fenotiazinas, fenazopiridina Orina concentrada por hipermetabolismo (Pyridium®) (fiebre o hipertiroidismo), poca ingesta o pérdidas excesivas de agua (deshidratación). Urobilina en exceso por trastornos en el Naranja hígado o en la vesícula biliar (sin color hasta que se expone a la luz). Bilirrubinuria debida a trastornos del hígado o de la vesícula biliar Hemoglobina (rojo brillante cuando es fresca) Remolachas, caramelos,ruibarbo que resulta de hemólisis intravascular mayor y algunos que contienen tintura a la que la haptoglobina puede fijar. de fucsina Eritrocitos (traumatismos de las vías urinarias Fenolftaleína, rifampicina, Roja o del riñón o por contaminación menstrual). teofilina Porfirinas debidas a enfermedad genética (sin Fenindiona anticoagulante similar color hasta que se expone a la luz). a la cumarina (Hedulin) Algunos fármacos: cáscara de Amarillo Biliverdina por oxidación de la bilirrubina, sen; algunos alimentos: ruibarbo verdoso posible hemólisisOlorNormalmente, la orina tiene un olor característico ” sui generis” y se describe comourinoide, debido a la presencia de ácidos orgánicos volátiles o ser más fuerte enmuestras concentradas sin que esto implique infección ; puede modificarse comoconsecuencia de fármacos, alimentos, por la presencia de bacterias, metabolitos talescomo la acetona, amoníaco o elevaciones de compuestos característicos de diversoserrores innatos metabólicos. Algunos cambios fisiológicos y patológicos en el olor dela orina se describen en la tabla 4. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 9
  10. 10. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScTabla 4. Cambios en el olor de la orina Fisiológicos Fuerte, picante, vitamina B. Ingestión de multivitamínicos Semejante a penicilina. Penetrante, como a hierva. Espárragos Penetrante, amoniacal. Orina en descomposición. Patológicos Dulce, fuerte, denso (en ocasiones es descrito como placente Infección por Pseudomonas. o afrutado). Rancio, amoniacal. Acidosis urémica. A acetona, fuerte, nauseabundo, dulce. Cetonuria con acidosis diabética; ligera o sin olor, de En inanición. Picante, ácido, "a pescado" Desagradable incluso en orina fresca; Infección bacteriana de vías urinarias. cuando envejece es marcadamente amoniacal. A "ratón", a "caballo", olor a hongos en Fenilcetonuria. lactantes. A espárragos Insuficiencia hepática. Fecal. Habitualmente por contaminación con heces; fístula rectal o con Escherichia coli Enfermedades supurativas del tracto genitourinario. Fétido Descomposición de la orina que contenga cistina o pus debido al desprendimiento de H2S Urinoide Cantidad elevada de ácidos orgánicos volátiles Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 10
  11. 11. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScEspumaLa orina normal promueve una ligera cantidad de espuma al ser agitada levemente.Cuando es abundante y permanente, indica existencia de sustancias tensoactivas queactúan como detergentes y disminuyen la tensión superficial (bilirrubina y proteínas).La coloración amarilla suele indicar la presencia de pigmentos biliares, no obstante,también puede ser debida a la ingesta de fenilazodiaminpiridina (Pyridium®). Si existealbúmina incrementada la orina será incolora y con espuma abundante.PESO ESPECÍFICOLos métodos empleados para determinar el peso específico son: densidad urinaria,refractometría, tiras reactivas y osmolaridad.Densidad urinaria (gravedad específica)Relación masa / volumen (peso de la orina al del agua destilada por debajo de lascondiciones estándares). Refleja el peso de los solutos en la orina. En la actualidad lametodología más utilizada para evaluar la densidad urinaria es el empleo de tirasreactivas. El principio en el cual se fundamenta es el cambio de pK de algunospolielectrolitos en relación con la concentración iónica de la orina. Estospolielectrolitos contienen grupos ácidos que se disgregan de acuerdo con laconcentración iónica. Al aumentar los iones aumentan los H+ y estos se disocian, locual modificará el pH del indicador, que mide el cambio. A mayor acidez másdensidad. Las orinas que presenten un pH ≥ de 6,5 se les debe realizar corrección dela densidad para lo cual es pertinente sumar 0,005 a la densidad obtenida. Losvalores usuales de la densidad están influenciados por la edad y la ingesta delíquidos. La tabla 5 resume las cifras de referencia de la densidad relacionados con laedad y con la hidratación de los pacientesTabla 5. Valores de referencia de la densidad urinaria, relacionados con la edady con la hidratación de los pacientes Neonato (primeros días) 1,012 Lactantes 1,001-1,035 Adultos con una ingestión normal de líquidos 1,016-1,022 Hospitalizados con líquidos controlados 1,010-1,020 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 11
  12. 12. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc EXAMEN QUÍMICOEl examen químico se practica mediante la utilización de química seca (tiras reactivas)para lo cual debe observarse cuidado especial en su uso. Deben ser almacenadascon un desecante en el recipiente original, ámbar, bien cerrado, a temperaturaambiente en un sitio fresco (no refrigerar), no usarlas después de la fecha decaducidad, no utilizarlas si están decoloradas, no cortarlas y cerrar bien el frascoinmediatamente después de extraerlas.La técnica a seguir incluye: mezclar bien la muestra (no agitarla), equilibrada con latemperatura ambiente, introducirla por completo en forma breve, eliminar el exceso deorina al extraer la tira de la muestra, colocándola en contacto por el borde con unasuperficie limpia y plana, comparando la reacción con los patrones del fabricante;realizarse bajo luz edecuada, en tiempo especificado y relacionar los hallazgosquímicos unos con otros, además, con los exámenes físicos y microscópicos delUroanálisis, finalmente practicar pruebas confirmatorias cuando esté indicado.Muchos estudios se han realizado para determinar si una marca comercial causamenos errores que otra, siendo los resultados no concluyentes. Sin embargo, hanmostrado que la mayor variabilidad reside en el cuidado del bacteriólogo en lasinterpretaciones de las reacciones practicadas por comparación de patrones. Estasubjetividad, junto con la discriminación visual entre los colores, se ha corregidomediante el desarrollo de la automatización para la lectura de las tiras reactivas. Losinstrumentos diseñados para este fin, miden la luz reflejada de una tira reactiva que seha introducido de una forma manual en orina y luego colocada en el autoanalizador.La reflectancia de la luz de las tiras disminuye en proporción a la intensidad del colorproducido por la concentración de la sustancia en estudio. Por lo tanto, el instrumentocompara la cantidad de reflexión de la luz con las concentraciones conocidas de losanalitos y los reporta. La automatización no mejora la metodología química de lastiras, solo su reproducibilidad y la objetividad del resultado.El incremento del número de muestras para analizar en el mismo tiempo disponible anivel laboral y la pobre calidad de las muestras resultado de largos tiempos entre larecolección y el análisis impide obtener precisión, confiabilidad y reproducibilidad en larealización del Uroanálisis.Esta situación ha impulsado nuevos enfoques y replanteamientos en las técnicas a seguirpara mejorar la evaluación, mediante las pruebas químicas, de los elementos relevantesdel sedimento en forma directa o por parámetros asociados. De estos planteamientosnace el concepto del “Tamiz de tiras reactivas” (Tabla 6) Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 12
  13. 13. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScTabla 6. Protocolo rutinario del Uroanálisis UROANÁLISIS Screening Tira reactiva Screening químico químico negativo positivo Orina turbia. Síntomas clínicos No exámenes Análisis Análisis complementarios microscópico microscópico y/o cultivos y/o cultivosTabla 7. Fundamentos de las pruebas químicas con química seca einterferencias con la reacción. Prueba Fundamento Falsos positivos Falsos negativos Las esterasas presentes en los ↑ densidad. granulocitos catalizan la hidrólisis de un ↑ glucosa. éster aminoácido-derivado pirrólico Detergentes oxidantes. ↑ proteína. Leucocitos liberando idroxi-5-fenilpirrol, el que Leucocitos vaginales. Ácido oxálico. a su vez, reacciona con una sal de Gentamicina. diazonio, para generar un color púrpura. Tetraciclina. Cefalexina. Cefalotina. La hemoglobina al igual que la Agentes oxidantes. ↑ densidad. peroxidasa, actúa catalizando la Hipoclorito. ↑ácido ascórbico. reacción entre el peróxido de hidrógeno Peroxidasa vegetal. ↑ nitritos. y el 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbencidina para Enzimas bacterianas. ↑ proteínas. Sangre generar un cromógeno oxidado con una Contaminación menstrual pH < 5. gamma de colores que varia desde Captopril. anaranjado, pasando por verde, hasta azul oscuro. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 13
  14. 14. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc ↑ Densidad. ↑pH Error por proteína de los indicadores. ↑ concentraciones de Compuestos de amonio Proteína Esta prueba es más sensible para sal. albúmina. cuaternario. Detergentes. Cefalotina. Los nitratos de la dieta son reducidos a nitritos por las bacterias Gram negativas presentes en la orina. El principio de la ↑ ácido ascórbico prueba es la reacción de Griess, en que Orina no retenida en el nitrito a pH ácido, reacciona con una vejiga durante 4 horas Nitritos amina aromática para formar un Abstención de nitratos compuesto de diazonio que luego Antibioticoterapia. reacciona con 3-hidroxi-1,2,3,4-tetra Bacterias Gram (+). hidrobenceno-quinolina para generar Levaduras. un color rosa.Estudios realizados por Winkel y col. (1974), Catertt y col (1981), Kutter y col (1982),entre otros, concluyen que leucocitos, eritrocitos, bacterias, cilindros, junto a laobservación macroscópica de una orina recién emitida, pueden evaluarseindirectamente mediante el empleo de pruebas de química seca (Tabla 8 ).Tabla 8. Componentes del sedimento urinario detectables directa eindirectamente por el “Tamiz de tiras reactivas” Componentes del sedimento urinario detectadoParámetros en la tira reactiva Directamente Indirectamente Leucocitos lisados.Leucocitos Leucocitos Cilindros leucocitarios. Trychomonas. Eritrocitos lisados. Hemoglobina libre. Eritrocitos Mioglobina.Sangre Cilindros eritocitarios. Cilindros de hemoglobina. Cilindros de mioglobina. _____ Cilindros granulososProteína Cilindros céreos Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 14
  15. 15. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScNitritos BacteriasLa mayoría de los leucocitos detectados en la orina son polimorfonucleares. Debido aque factores tales como pH alcalino o cambios en la densidad los lisan, su evaluaciónse hace mediante la reacción de las esterasas presentes en los granulocitos, conderivados pirroles y sales de diazonio. Como esta prueba no depende de las célulasintactas, resulta útil para evaluarlos. En algunas situaciones son atrapados en lamatriz de cilindros, por lo tanto, es posible detectar también su presencia. Enocasiones, pueden asociarse con Trichomonas.La región de las tiras impregnadas con ortotoluidina y peróxido orgánico neutralizadodesarrolla una coloración en presencia de hematuria (glóbulos rojos), hemoglobina(hemólisis), o mioglobina (proteína que almacena el oxígeno en músculo estriado yfacilita su movimiento), o aspecto punteado cuando los hematíes están intactos.También cuando existen cilindros eritrocíticos, de hemoglobina, o de mioglobina.La evaluación de nitritos se hace mediante el método de Griess, en el cual lasbacterias reducen los nitratos a nitritos, para la cual el paciente debe haber ingeridoalimentos que los contengan. Su positividad ayuda a un diagnóstico temprano debacteriuria significativa y asintomática, habitualmente, Gram negativos. Sin embargo,en estos casos, la leucocituria ayuda a sospechar infección. En ningún caso remplazael urocultivo.Si se asocia la presencia de cilindros con proteínas de Tamm Horsfall o de origenglomerular denaturalizadas en moldes de la luz tubular, incluso las reacciones débilesen la zona de proteínas deberían considerarse como indicativo de un examenmicroscópico subsiguiente.El aspecto turbio de la orina, recién emitida, debe hacer sospechar aumento deleucocitos, eritrocitos, células epiteliales, bacterias y cristales.El examen macroscópico de la orina junto con el “Tamiz de tiras reactivas” ayuda aseleccionar aquellas muestras que requieren un análisis excautivo del sedimento, locual permitirá obtener resultados precisos, confiables y reproducibles en la realizacióndel Uroanálisis. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 15
  16. 16. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc EXAMEN MICROSCÓPICOEl examen microscópico constituye una parte vital del análisis de orina de rutina. Esherramienta diagnóstica valiosa para la detección y evaluación de trastornos renales ydel tracto urinario, así como de las enfermedades sistémicas. El valor del examenmicroscópico depende de dos factores fundamentales: del examen de una muestraadecuada y del entrenamiento del profesional que lo realiza.La importancia del análisis del sedimento no es materia en discusión. Su realización,sin embargo, exige estandarización, la cual comprende volumen inicial y final en lacentrifugación, volumen de la gota a examinar, tamaño de la capa e igualdad en loscampos visuales de un microscopio a otro.Preparación del sedimento y uso del microscopioMétodos recomendados • Manuales • Porta y cubreobjetos • Cámara de recuento de Neubauer • Sistema recomendado por el CLSI antes NCCLS • Celda de Lectura Rápida de Precisión (Quick-Read®) • Sistema MD Kova® • Semiautomatizados o automatizados • Instrumentación diversa.Porta y cubreobjetos • Utilizar volumen constante (10 a 12 mL), lo que proporciona cantidad conveniente para obtener una muestra representativa de los elementos formes. En casos de que no se cuente con estos volúmenes, debe realizarse dilución de la muestra con solución salina fisiológica hasta alcanzar la cantidad estandarizada. Esta solución es seleccionada, porque mantiene la integridad de la muestra. El ajuste de la dilución es principalmente importante en pacientes con condiciones patológicas que afecten la diuresis porque el factor de dilución proporciona la consistencia requerida para la evaluación cuantitativa de la enfermedad y de los cambios que ocurren a medida que se incrementa la diuresis. También en niños o adultos mayores. • Centrifugar la orina (temperatura ambiente) en un tubo plástico o de vidrio (idealmente de centrífuga graduado) y con tapa de rosca (evita aerosoles) Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 16
  17. 17. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc adecuadamente limpio. Es fundamental observar el principio del “equilibrio”; para ello se colocarán tubos de igual peso, forma y tamaño que los de la muestra en posiciones opuestas en la cabeza de la centrífuga, buscando una disposición geométricamente simétrica (utilizando tubos llenos de agua en caso necesario). • La velocidad y el tiempo de centrifugación de la muestra deben ser constantes con una fuerza centrífuga relativa (FCR) de 400 durante 5 a 6 minutos. La FCR es la medida de la fuerza aplicada a una muestra dentro de una centrifuga. Permite comparar la fuerza a la que está sometida una partícula centrifugada en diferentes rotores. Esto se puede calcular a partir de la velocidad (rpm) y del radio rotatorio (cm), lo cual promoverá la cantidad óptima de sedimento con probabilidad menor de lesionar los elementos formes. Para corregir las diferencias en el diámetro de la cabeza de la centrífuga, se emplea la FCR [(fuerza relativa de centrifugación (gravedades)] en lugar de revoluciones por minuto (rpm). Es necesario conocer el radio de la cabeza de la centrífuga y aplicar una fórmula ó basarse en un nomograma ya establecido lo que permite relacionar condiciones de centrifugación en diferentes rotores. • El valor de rpm mostrado en el tacómetro de la centrífuga se puede convertir a FCR empleando las fórmulas siguientes:Cálculo FCR 28,38® (N/1000)2 Siendo R: radio del rotor en pulgadas N: revoluciones por minutoOtros cálculos utilizados son los siguientes: FCR = 1,118 x 10-5 x radio en centímetros x rpm2NomogramaEste nomograma consta de tres escalas: (A) radio de rotación, (B) revoluciones porminuto y (C) fuerza centrífuga relativa. Se traza una recta entre dos puntos conocidos(radio, RCF o RPM) en dos de las columnas. El tercer valor corresponde a laintersección de la recta con la tercera columna. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 17
  18. 18. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScEjemploPara encontrar la fuerza relativa centrifugación a una distancia radial de 10 cm desdeel centro de rotación al funcionamiento cuando la centrífuga opera a una velocidad de3000 rpm, se debe colocar una regla en la carta y hacer coincidir los 10 cm del puntode la escala del radio giratorio con el número de revoluciones de 3000 en el punto laescala de velocidad (B). la fuerza centrífuga relativa (Escala , en este caso, 1000xgravedad. Similarmente, si el rcf deseado es conocido, la velocidad necesaria para undeterminado radio de rotación puede ser valorada mediante la conexión de los dospuntos conocidos y la lectura de la intersección de la regla con la velocidad de laescala. B C AFigura 1. Nomograma para el cálculo de la Fuerza Centrífuga Relativa (RCF)Fuente: Comité Internacional Electrotécnico (IEC: International Electrotechnical Commission) • Observar el aspecto del sobrenadante y del sedimento. • Decantar el sobrenadante por inversión rápida. Una cantidad uniforme de orina, aproximadamente 0,5 a 1,0 mL, debe permanecer en el tubo para usarse en la resuspensión del sedimento. • Resuspender el sedimento en la orina restante dando golpecitos suaves en la parte inferior del tubo para mezclarlo. • Si éste es muy abundante, pueden añadirse 0,5 mL de orina. Los sistemas comerciales (por ejemplo, Kova®) proporcionan elementos para este propósito, como también, para obtener una suspensión del sedimento. Si se utiliza colorante, se debe añadir antes de agitar la muestra. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 18
  19. 19. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc • Usar un volumen constante de sedimento (50 μL), el cual se coloca en el centro de un portaobjeto con pipeta automática; ubicar suavemente una laminilla (22 x 22) cuidando que no queden burbujas. Si la cantidad de orina es excesiva puede empujar el sedimento fuera del área de visión al aplicar el cubreobjeto. • Examinar después de 1 minuto de reposo. • Cuantificar el número de elementos observados e informarlos por campo de alto poder (AP) o de bajo poder (BP). La forma de practicar el examen microscópico del sedimento debe ser constante, e incluir la observación de la totalidad de los campos de bajo (BP: 10x) y de alto poder (AP: 40x). Examinar primero la muestra en BP para valorar la composición general del sedimento y detectar cilindros y elementos de índice de refracción bajo. Cuando se amerite identificación precisa, cambiar al objetivo AP. Los cilindros tienden a ubicarse cerca de los márgenes del cubreobjeto, por ello, es recomendable explorar el perímetro de éste. Cuando se utilice microscopía de campo brillante, se debe tener cuidado de reducir la cantidad de luz para dar contraste adecuado (cerrar parcialmente el iris del diafragma y ajustar el condensador hacia abajo hasta lograr el contraste óptimo), porque algunos elementos tienen un índice de refracción similar al de la orina y no se observan bajo luz brillante. El enfoque continuo con el ajuste fino (tornillo micrométrico) ayuda a la detección de estos elementos. • Los resultados se informan como un promedio de los campos examinados. La terminología exacta varía de acuerdo al método empleado, pero debe ser consistente en cada laboratorio. Las células epiteliales (renales, transicionales o bajas), eritrocitos (altos o dismórficos, bajos y fantasmas), leucocitos (dispersos y en acúmulo), cuerpos ovales, grasa libre, se informan en número por AP, y los cilindros en BP; los cristales, bacterias, levaduras, entre otros, en cruces por campo de alto poder. El término “muy numeroso para contarse” (TNTC: Too numerous to count) o “incontables” se puede emplear cuando se observen cantidades muy elevadas de elementos formes. En este caso, para descartar o confirmar la presencia de elementos formes es conveniente realizar dilución del sedimento. Cuando el número de ellos es bajo, se informará: número de elementos en todos los campos (TC). • Para asegurar la exactitud del informe, los resultados del sedimento se deben correlacionar con los hallazgos físicos y químicos. Las muestras cuyo resultado no se correlacionen se deben revisar de nuevo en busca de errores técnicos y/o de trascripción. • Después de realizar el examen químico, la muestra restante debe ser conservada hasta que el procedimiento se complete, de manera que las pruebas químicas o microscópicas puedan repetirse si fuese necesario, o poder efectuarse otros procedimientos, si así se considere. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 19
  20. 20. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScRecuento con cámara de NeubauerPara efectuar el recuento con esta metodología colocar una gota de sedimento entrela cámara y la laminilla de cuarzo y ejecutar el recuento de los elementos figuradossimilarmente al de sangre periférica. Para dar el resultado numérico se emplea lafórmula universal de la cámara (FUC).Cálculos N° de células contadas x Factor de dilución FUC= _____________________________________________________ Profundidad de la cámara x cuadrados grandes de 1mm3 de áreaDondeN° de células contadas N° total de células observadas en los cuadrados (no promediar)Factor de dilución Factor de dilución técnico empleadoProfundidad de la cámara Constante: 0,1 mmCuadrados grandes de 1 mm3 Cuadrados utilizados en los 9 cuadrados grandesEjemploSuponga que realizó un recuento en los 25 cuadrados del cuadrado central de lacámara y observó 20 leucocitos y empleó una dilución 1:200. ¿Cuántos leucocitoshay?Remplazando en la formula: 20 x 200 = 40.000 leucocitos /mm3 0,1 x 1Procedimiento recomendado por el CLSI (ANTES NCCLS)El CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute antes NCCLS: NationalCommittee on Clinical Laboratory Standards en el documento HS2-A: Proveedorrealizado microscopia (“Provider-Performed Microscopy Testing”: PPM); impartió lassiguientes directrices para realizar el examen y el informe microscópico de la orina(2003). Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 20
  21. 21. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScProtocolo • Medir el volumen de orina bien mezclado. • Estandarizar la centrifugación (tiempo y velocidad). • Medir el volumen del sedimento. • Medir la cantidad de sedimento colocado en el portaobjetos. • Emplear un cubreobjetos estándar (22 x 22 mm) . • Registrar la amplificación y el diámetro de AP del microscopio. • Calcular y reportar elementos /mL. de orina.EjemploUsando 15 mL de orina: • Diámetro del campo de alto poder: 0,35 mm. • Área del campo de alto poder: 0,096 mm2 (π D2/4). • Área del cubreobjetos (22 mm x 22 mm) = 484 mm2 o 484/0,096 = 5040 campos de AP. • Desechar el sobrenadante y dejar en el tubo 0,25 mL. de sedimento. • Resuspender la orina y medir 20 μL (0,02 mL) de sedimento. • Colocar la orina en el portaobjetos y cubrir con el cubreobjetos o 5040 campos de AP ≈ 1,2 mL de orina ≈ 4000 c AP / mL Cálculos (recuento / campo de Ap ) x 4000 ≈ conteo / mL. Ejemplo (10 leucocitos / c AP ) x 4000 c AP /mL ≈ 40000 leucocitos / mL. MÉTODOS ESTANDARIZADOS COMERCIALESAlgunos métodos de estandarización comerciales disponibles, son el de la lecturarápida de precisión (Quick-Read®) y MD Kova® los cuales ofrecen exactitud,uniformidad y seguridad en el examen microscópico del sedimento. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 21
  22. 22. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScCelda de Lectura Rápida de Precisión (Quick-Read®)Esta metodología utiliza láminas múltiples Quick-Read® las cuales están diseñadaspara ofrecer exactitud, uniformidad y seguridad en el examen microscópica delsedimento.El sistema está constituido fundamentalmente por: • Láminas acrílicas de calidad óptica alta lo cual permite visualización perfecta; cada una con diez cámaras individuales marcadas para el montaje de diez muestras, cada una contiene 18 círculos, los cuales están premedidos y permiten albergar volúmenes específicos del sedimento. • Tubos de centrífuga graduados con volumen hasta de 12 mL. • Pipetas desechables que permiten retener 1 mL de muestra después de la decantación. • Colorante de Sternheimer-Malbin.Tabla 9. Características de la cámara Área 63 mm2 Área total 1 mm2 Área 0,111 mm2 Volumen 6,3 μL. Volumen total 0,1μL. Volumen 0,011 μL.Protocolo • Recolectar la muestra de manera tradicional. • Transferir 10 o 12 mL. de la muestra previamente mezclada a los tubos de centrífuga graduados. • Realizar el análisis químico de la orina empleando las tiras reactivas según sus propias instrucciones. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 22
  23. 23. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc • Centrifugar la muestra durante 5 minutos con una fuerza centrífuga relativa (rcf) de 400 que corresponden a 1500 rpm. • Introducir la pipeta de sedimentación dentro del tubo. • Decantar el sobrenadante. La pipeta permite retener 1 mL de la muestra para resuspender el sedimento. • Adicionar 1 gota del colorante de Sternheimer-Malbin, si lo prefiere, que facilita la visualización de los elementos formes. Resuspender el sedimento hasta tener una suspensión homogénea. • Empleando la pipeta y por capilaridad transferir la muestra a la cámara. • Realizar la lectura microscópica empleando el objetivo de 10x para cilindros y 40x para los otros elementos formes. Un círculo será visto en un campo completo. Determinar el promedio de elementos por círculo. • Reportar los resultados como células/μL empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto. • Para establecer el número promedio, contar los elementos en uno o más círculos y dividir el total contado por el número de círculos observados. Los mejores resultados son los obtenidos por el número del conteo total en todos los 18 círculos.Para muestras con volumen inferior a 12 mL. centrifugar sólo 6 mL. y multiplicar elnúmero de células obtenido por dos antes de hacer los cálculos. En la cámara cadacampo de AP equivale a 1 círculo. El valor de cada círculo equivale 0,0111μL.Ejemplo • Si se utiliza 10 mL de orina, realizar promedio por campo de alto poder. Si el recuento fue de 30 en 10 campos el número de elementos será 3/ AP • Si el volumen es de 12 mL, multiplicar el promedio de las células contadas por 0,8333 (10/12). Por ejemplo, si observó 40 células epiteliales en 10 círculos contados el número de células en AP será 3. Reportar los resultados como células/μL empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto. Cálculos Promedio x 0,8333 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 23
  24. 24. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScValoración calculada del recuentoSi se tomó un volumen de orina de 10 mL, del sedimento 1 mL y se realizó unrecuento en 9 círculos, el número de elementos es 27. Utilizando los cálculossiguientes se comprueba el resultado.Cálculos Células/ μL de orina = 27 elementos X 1 círculo X 1000μL X 1μL = 27,27 9 círculos 0,011μL 1000μLTabla 10. Valores de referencia (AP) Leucocitos 3 - 5/ μL Hematíes 0 - 2/ μLSistema MD KOVA®Procedimiento normalizado con las ventajas que ofrece la orina centrifugada, lascuales permiten obtener recuentos celulares con excelentes resultados, si se comparacon otros métodos. Utiliza tubos de centrífuga graduados, pipetas y portaobjetosdesechables. El recuento se realiza con una cámara desechable y un volumenconstante. Esta técnica soluciona el inconveniente de los métodos no estandarizadosutilizados de rutina en donde el vertido del sobrenadante no permite obtener unvolumen constante de sedimento; además, las diferencias entre profesionales alejecutarlo, hacen que la cantidad para resuspender sea extremadamente variable. Porello, la variación del material celular cambiará por el volumen dejado para laresuspensión.Componentes del sistema Kova®El sistema está constituido fundamentalmente por tres elementos: láminas (cada unacon diez cámaras individuales marcadas para el montaje de diez muestras); tubos decentrífuga graduados para 12 mL de volumen y pipetas desechables que permitenretener 1 mL de muestra después de la decantación. Existen otros accesorios talescomo, gradilla para diez tubos, colorante de Sternheimer-Malbin y controles (KOVA-TROL®) de tres niveles (normal, bajo y alto), los cuales deben ser tratados como unamuestra. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 24
  25. 25. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScTabla 11. Características de la cámara Volumen total 6,6 μL. Profundidad 0,1 mm. Dimensiones 333 mm x 333 mm. Volumen cuadro 0,9 μL. Área cuadro pequeño Dimensiones: 0,333 mm x 0,333 mm= 0,111 Volumen cuadrado pequeño . 0,1 x 0,011= 0,0111. 0,33Protocolo • Recolectar la muestra de manera tradicional empleando preferiblemente recipientes de orina KOVA® CUP con capacidad para 3½ oz. ® • Transferir 12 mL de la muestra previamente mezclada a los tubos KOVA graduados. • Realizar el análisis químico de la orina empleando tiras reactivas y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los controles deben ser tratados como una muestra de orina. • Centrifugar 12 mL de orina en los tubos graduados KOVA® con una fuerza centrífuga relativa (rcf) de 400 por 5 minutos que corresponden a 1500 rpm aproximadamente. • Retirar los tubos de la centrífuga Kova teniendo cuidado de no resuspender el sedimento. • Colocar los tubos en la gradilla KOVA® ® • Inserte una pipeta del sistema KOVA dentro del tubo Kova Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 25
  26. 26. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc • Empujar la pipeta al fondo del tubo hasta que se asiente firmemente (en la graduación de 1 mL). • Decantar el sobrenadante. La pipeta permite retener 1 mL de la muestra para resuspender el sedimento. • Adicionar 1 gota del colorante de Sternheimer-Malbin, que facilita la visualización de los elementos formes. Resuspender el sedimento hasta obtener una mezcla homogénea. • Transferir una pequeña cantidad de muestra en la cámara, apretando la pera de la pipeta. La muestra ingresará por capilaridad a la cámara. • Retirar el exceso de espécimen con material absorbente. • Realizar la lectura microscópica empleando el objetivo de 10x para cilindros y de 40x para los otros elementos formes. • Reportar los resultados como células / μL empleando las tablas anexas incluidas en el inserto del producto.CálculoPara células/μL # elementos contados x Factor # cuadritos observados Factor = 1000 microlitros (s) x 1 microlitro (o) . = 7,5 0,0111 microlitros (s) 1200 microlitros (o)Para muestras con volumen inferior a 12 mL centrifugar sólo 6 mL y multiplicar elnúmero de células obtenido por dos, antes de hacer los cálculos.Cálculo del factor Volúmen uL de orina totalmL de orina mL de cuadrado Reporte en el cuadro N° de células Factortotal sedimento pequeño / uL pequeño 12 1 0,0111 0,1332 1 1/ uL 7,5 10 1 0,0111 0,0111 1 1/ uL 9,0 10 0,5 0,0111 0,222 1 1/ uL 4,5Orina sin diluir 1 1/ uL 90,0 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 26
  27. 27. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScEjemploSi 12 mL de orina total están contenidos en 1 mL de sedimento, cuantos uL de orinatotal hay en 0,0111 ul de sedimento que hay en un cuadro pequeño mL de orina total x volumen en cuadrado pequeño (μL) mL de sedimentoSi hay 1 célula en 0,1332 uL (cuadro pequeño) cuántas células hay en 1 uL? 1 celula x 1uL …………… μL de orina en el cuadro pequeñoTabla 12. Valores de referencia Tipo de célula Normal Límite Patológico Leucocitos 0 - 4 /μL 4 - 6 /μL > 6 /μL Eritrocitos 0 - 2 /μL 2 - 3 /μL > 3 /μLRecuentos celulares bajosContar el total de un tipo específico de células contenidas en 10 círculos pequeñosutilizando 10 mL de orina y 1 mL de sedimento.Cálculos Total de células Células/ μL 10 mL 1 1 2 2 3 2 4 3 5 4 6 5 7 5 8 6 9 7 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 27
  28. 28. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc 10 8 11 8 12 9 13 10 14 11 15 11 16 12 17 13 18 14 19 15 20 15 21 16 22 17 23 18 24 18 25 19 26 20 27 21 28 21Recuentos de celulares altosContar el total de un tipo específico de células contenidas en 5 círculos pequeñosutilizando 12 mL de orina y 1 mL de sedimento Total de células Células/ μL 12 mL 5 8 6 9 7 11 8 12 9 14 10 15 11 17 12 18 13 20 14 21 15 23 16 24 17 26 18 28 19 29 20 31 21 32 22 34 23 35 24 37 25 38 30 46 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 28
  29. 29. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc 35 54 40 61 45 69 50 77 60 92 70 107Cálculo alternativoDeterminar el promedio de células por cuadrícula pequeña y luego utilizar lossiguientes factores multiplicadores para calcular las células/ μL.Para el cálculo de las células / μL con el sistema Kova® utilizando 10 cuadrículas: • Para muestras no centrifugadas o homogenizadas, multiplicar el promedio de las células obtenido por cada cuadrícula por 90. • Utilizando 10 mL y 1 mL de sedimento, multiplicar el promedio de las células obtenido por cada cuadrícula por 9.Utilizando 10 mL y 0,5 mL de sedimento, multiplicar el promedio de las célulasobtenido por cada cuadrícula por 4,5.Para 12 mL de orina y 1 mL de sedimento (sistema Kova), multiplicar el promedio delas células por cuadrícula x 7,5.Ejemplo de cálculo utilizando 12 mL de orina y 1 mL de sedimento Promedio Multiplicar porCélulas Círculos Células totales Células /μL de células factor (7,5)Leucocitos 10 5 0,5 0,5 x 7,5 3,8Eritrocitos 10 14 1,4 1,4 x 7,5 10,5Orina nativa (sin diluir ni centrifugar)Recuentos celulares bajosContar el total de un tipo específico de células contenidos en 36 círculospequeños o en cuatro cuadrantes completos. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 29
  30. 30. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScCálculos Total de células Células/ μL Células/ mL 1 3 2 500 2 5 5 000 3 8 7 500 4 10 10 000 5 13 12 500 6 15 15 000 7 18 17 500 8 20 20 000 9 23 22 500 10 25 25 000 11 28 27 500 12 30 30 000 13 33 32 500 14 35 35 000 15 38 37 500 16 40 40 000 17 43 42 500 18 45 45 000 19 48 47 500 20 50 50 000 25 63 62 500 30 75 75 000 40 100 100 000 50 126 125 500Recuentos celulares altosContar el total de un tipo específico de células contenidos en 10 círculos pequeños Total de células Células/ μL Células/mL 1 9 9 000 2 18 18 000 3 27 27 000 4 36 36 000 5 45 45 000 6 54 54 000 7 63 63 000 8 72 72 000 9 81 81 000 10 90 90 000 20 180 180 000 25 225 225 000 30 270 270 000 35 315 315 000 Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 30
  31. 31. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc 40 360 360 000 50 450 450 000 60 540 540 000 70 630 630 000 80 720 720 000 90 810 810 000 100 900 900 000 150 1 350 1 350 000 200 1 800 1 800 000 250 2 250 2 250 000Cálculo alternativo Células/ μL Multiplicar el promedio de células por 90 Células/ mL Multiplicar el promedio de células por 90.000Métodos automatizadosExisten dos sistemas para automatizar la microscopía basados en diferentestecnologías: • Análisis de imágenes tomadas por una videocámara y lámpara strobe, que detiene el movimiento del fluido para detectar los elementos presentes y a continuación realiza comparación clasificándolos en doce categorías. Se requiere revisión para células epiteliales y cilindros patológicos. • Un sistema basado en el principio de citometría de flujo, en donde se procesa orina no centrifugada.DismorfismosLos eritrocitos pueden experimentar alteraciones morfológicas permanentes eirreversibles, lo cual se conoce con el nombre de dismorfismo y surgen en elsedimento de pacientes con afecciones renales glomerulares (Fairley y Birch 1982).Los hematíes dismórficos experimentan las más variadas deformaciones en el riñóntales como formación de vesículas, defecto y ruptura de la membrana en uno o variospuntos que permiten la salida del contenido celular el cual queda incluido en unaespecie de burbuja; en ocasiones auténticos agujeros celulares que dan lugar a restosde membranas arrugadas, divertículos, trozos de hematíes que recuerdan lospoiquilocitos, células en rodete como dianocitos, hematíes planos con bordesfestoneados, hasta formas totalmente amorfas (gránulos), si bien los más frecuentesson los hematíes en forma de “donut”. El cambio continuo de pH y de la osmolalidaden el sistema tubular es considerado responsable de las modificaciones en la forma Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 31
  32. 32. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScde la membrana eritrocitaria que, eventualmente, ya ha sufrido lesiones previas porenzimas leucocitarias en el glomérulo, probablemente de tipo inmunológico, defrecuente implicación en patología glomerular. Una característica constante yfundamental en relación con la morfología es la pérdida del brillo propio de laintegridad de la célula y de la conservación parcial de su contenido citoplasmático dehemoglobina.Muchos métodos se han ideado para valorar los hematíes dismórficos, los cuales sediferencian en el grado de complejidad de los instrumentos y reactivos utilizados.Estos son: microscopía óptica de luz, microscopía de contraste de fase, citometría deflujo y coloración de Wright. Sin embargo, cualquier método puede resultar exitoso sise sigue el procedimiento propuesto por Fairley y Birch en 1982, para lo cual esindispensable utilizar una orina recién emitida y procesar en mínimo de tiempo, con unvolumen constante (10 mL), centrifugarla a 1500 rpm, durante 3 minutos decantar elsobrenadante, agitar adecuadamente; colocar 50 μL (0,05 mL) ente lámina y laminillay se examina al microscopio. Se realiza un recuento de 100 células (duplicado) y seinforma en %. La tabla 13describe la interpretación de los resultados.Tabla 13. Interpretación de los resultados obtenidos de los hematíes paraevaluar dismorfismo Interpretación Normales Eumorfos Estramonio Lixiviados Formación de vesículas Defecto de membrana Dismorfos Agujeros Gránulos Espolones MICROSCOPÍAEl examen microscópico de rutina del sedimento urinario requiere del uso demicroscopios de campo brillante de alta calidad.Existen tres métodos de mejoramiento para la identificación de elementos formes delsedimento: microscopía de luz polarizada, microscopía de contraste de fase ycoloraciones especiales. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 32
  33. 33. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScMicroscopio de campo brillanteDebido a su disponibilidad, el microscopio de campo brillante se emplea con mayorfrecuencia para el examen del sedimento urinario. Sin embargo, el análisis delsedimento no teñido presenta ciertos inconvenientes, ya que el índice de refracción dealgunos elementos es similar al de la orina y se pueden pasar por alto.Para examinar el sedimento urinario sin tinción con este tipo de microscopio debeusarse luz amortiguada para dar un contraste adecuado. Esto se logra cerrandoparcialmente el iris del diafragma y ajustando el condensador hacia abajo hasta lograrun contraste óptimo. Otra observación que debe seguirse es que el micrómetro debeser continuamente ajustado haciendo movimientos hacia arriba y hacia abajo con elobjeto de permitir observar la profundidad del objeto, así como otras estructuras quepuedan encontrarse en un plano focal diferente.Al iniciar el procedimiento se debe realizar con magnificación de poco aumento (100x) y debe examinarse la totalidad del perímetro del cubreobjeto, en busca de cilindros,ya que estos tienden a moverse hacia los bordes y, determinar la composición generaldel sedimento. Para observar los demás elementos formes y cuando sea necesariodelinear las estructuras, se pasa a la lente de mayor aumento (400x).Microscopio de contraste de luz polarizadaEl uso de la luz polarizada es de utilidad para la identificación de grasa y de otrassustancias anisotrópicas, cristalinas (cristales) de colores y formas variadas, lascuales tienen la capacidad de rotar el camino de la luz unidireccional polarizado paraproducir colores característicos a partir de los cristales y la formación de cruz de Maltade los lípidos; esto puede hacerse con el uso de dos filtros polarizadores, uno de loscuales se ubica en el condensador y el otro en el ocular. El campo luego se oscurecerotando uno de los filtros (esto los coloca en un ángulo de 90°). Un microscopio decampo brillante puede transformarse al de luz polarizada introduciendo un filtropolarizado y cambiando el condensador.Microscopio de contraste de faseEste tipo de microscopio es útil para enseñar la identificación morfológica de lasestructuras del sedimento ya que permite una mejor visualización de los elementostrasparentes cambiando la amplitud de las ondas luminosas cuando pasan a través deellos. Este microscopio retarda artificialmente la luz difractada en un cuarto de longitudde onda y esto produce un halo alrededor del elemento forme proporcionando asímejor reforzamiento de la imagen. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 33
  34. 34. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScEl microscopio de contraste de fase por interferencia produce una imagen pordesdoblamiento de la luz en dos haces separados. Uno de ellos pasa a través delobjeto mientras el otro sirve de referencia. Los haces de luz se recombinan antes deser recibidos por el observador y esto da al objeto un relieve o un aspecto“tridimensional” que muestra detalles estructurales muy finos.El cambio del objetivo y del condensador permite que el microscopio de luz brillantese transforme en uno de contraste de fase. Los cilindros hialinos que tienen un índicede refracción bajo y los eritrocitos dismórfos, indicativos de hematuria glomerular,pueden permitir a un examinador inexperto una mejor observación. MÉTODOS DE TINCIÓNCuando se revisa la literatura sobre el tema, se encuentran numerosos métodos detinción del sedimento urinario. En ocasiones, la tinción facilita el reconocimiento de loselementos formes. Sin embargo, la inmensa mayoría de los métodos no sonimprescindibles ni ofrecen información adicional, sino hermosas imágenesmicroscópicas y fotografías. Por eso, no se utilizan en la práctica cotidiana.Coloración de Sudan IIIDespués de fracturas múltiples pueden surgir células isotrópicas colmadas de grasaneutra (triglicéridos), que con frecuencia varían de tamaño por coalescencia de losglóbulos y flotan libremente en el sedimento. Estos elementos formes se originan porliberación de grasa de la médula ósea a la circulación con filtración posterior de losglomérulos. No polarizan la luz pero se tiñen de rojo-anaranjado con Sudán III o conOil Red O.Luego de centrifugar la orina durante seis minutos a 2500 rpm y decantar elsobrenadante, se añaden 1-2 gotas de una solución saturada de Sudán III en etanol al70%, se agita bien, y luego de 15 minutos se colocan 50 μL (0,05 mL) entre lámina ylaminilla y se examina al microscopio.Coloración para hemosiderinaLa hemosiderina es un pigmento granular amarillo a castaño que deriva de lahemoglobina en casos de ictericia prehepática cuando la capacidad de unión de lahaptoglobina con la hemoglobina es superada y por tanto se pierde hemoglobina en laorina. La hemoglobina libre es filtrada por los glomérulos y reabsorbida en parte porlas células del epitelio tubular, donde el hierro es extraído y depositado en el interior Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 34
  35. 35. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScde las células en forma de hemosiderina. La demostración de los gránulos dehemosiderina libres o en el interior de las células epiteliales constituye un signovalioso de hemólisis intravascular.Entre las tinciones que se utilizan para demostrar la presencia de hemosiderina estánlas reacciones de Rous (azul de Prusia): gránulos azules y la de Ham: gránulos negroazabache.Los reactivos son similares a la tinción de Perl: soluciones de ferrocianuro potásico al2 % y HCI al 2 %. Se debe emplear orina fresca, la cual se centrifuga a 6000 rpmdurante 5-10 minutos para obtener el sedimento urinario, una vez desechado elsobrenadante, se añade la mezcla de los reactivos (1 mL de cada uno); se mezcla yse deja en incubación a temperatura ambiente, durante 20 minutos. Luego secentrifuga durante 5-10 minutos y una vez desechado el sobrenadante, se depositan50 μL (0,05 mL) ente lámina y laminilla y se examina al microscopio. La presencia dehemosiderina se objetiva mediante una coloración azul verdosa en las células dedescamación del tracto urinario, lo que es indicativo de una hemólisis intravascular,característico de una hemoglobinuria paroxística nocturna o de una coagulaciónintravascular.En la reacción de Ham se coloca 50 μL de sedimento en un portaobjetos y se agregauna gota de solución acuosa de sulfuro de amonio al 30%, se mezcla y examina lamuestra con poco aumento en busca de gránulos negro azabache.Coloración de eosinaCuando el sedimento contiene eritrocitos abundantes, muchas veces se puededificultar la identificación de otros elementos formes tales como las células micóticas,gotas de grasa o incluso burbujas de aire. Para solucionar esta situación se añadeuna gota de solución de eosina al 0.5% en agua destilada al sedimento. Luego deagitar bien, se colocan 50 μL (0.05 mL) entre el porta y cubreobjeto y se examinainmediatamente al microscopio. Los eritrocitos se tiñen de color rosa, a diferencia delos hongos y la grasa libre. Las células del epitelio, leucocitos y cilindros se coloreande un color rojizo.Coloración de HanselLa mayoría de los leucocitos detectados en la orina son polimorfonucleares, sinembargo, es de creciente interés la diferenciación de éstos. La eosinofilia es un Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 35
  36. 36. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSchallazgo característico de la nefritis intersticial aguda inducida por medicamentos, porlo tanto es imperativo para el médico tratante el que se le informe. Para ello se utilizala coloración de Hansel. Originalmente, esta tinción se empleaba para la detección deeosinófilos en las secreciones nasales bronquiales u oculares.Para realizar la coloración de Hansel se colocan 50 μL (0,05 mL) de sedimento sobreun portaobjetos, se deja secar a temperatura ambiente y luego se fija con metanol al95% durante 5 segundos. Se añaden 20 gotas de la solución colorante de Hansel(azul de metileno y eosina Y en metanol) durante 45 segundos y luego 20 gotas deagua destilada durante 30 segundos más. A continuación se elimina el colorante conagua destilada y se decolora con 4 gotas de metanol durante 1-2 segundos. Acontinuación se vuelve a lavar con agua destilada. Una vez seca la preparación, seprocede a realizar la lectura microscópica de 200 células, con el lente de inmersión(100x). Las granulaciones de los eosinófilos adquieren una coloración roja-rosada y elnúcleo, azul oscuro. Puede encontrarse un recuento reducido de 1-5% o elevado de5-50% de eosinófilos.Tinción de WrightPara la identificación de eosinófilos se puede utilizar también la coloración de Wright,similar a la utilizada para el frotis sanguíneo.La tinción de Wright es una coloración metacromática en la cual el colorante sufre unatransformación cromática al entrar en contacto con el tejido a colorear, debido alestado de agregación que puede ser modificado por los componentes tisulares. Losreactivos son azul de metileno policromático y eosina.Coloración de azul de metileno de LöfflerEsta coloración permite diferenciar mejor las células tubulares, que a menudo sonligeramente más grandes que los leucocitos, (< 15 µm de diámetro) con citoplasmagranular y núcleo grande, redondeado, generalmente excéntrico, con forma devesícula (relación núcleo/citoplasma 1:1) planas, cúbicas o cilíndricas.MetodologíaAñadir 2 gotas de la siguiente solución al sedimento: Solución etanólica de azul de metileno 30,0 mL KOH al 0,01% 100,0 mL Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 36
  37. 37. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MSc Interpretación de los resultados Después de 15 minutos, los leucocitos y las células tubulares adquieren una coloración azulada, sobresaliendo las estructuras nucleares.Coloración de Sternheimer-MalbinCuando en un sedimento se observa 10% de células de Sternheimer-Malbin y unnúmero de leucocitos superior a lo normal puede intuirse la presencia de pielonefritis einclusive un 100% de estas células pueden observarse en pielonefritis activa. Sinembargo, no es patognomónica de esta condición, por que se observa también enprocesos inflamatorios de la vía urinaria descendente. La desaparición de estascélulas con la antibioticoterapia se utiliza como criterio de respuesta al tratamiento.Las células de Sternheimer-Malbin (nombre que recuerda a los impulsadores delmétodo de coloración y de Schilling en honor a su descubridor), sonpolimorfonucleares en cuyo interior se observa “movimiento molecular de Brown”(browniano), siempre cursan con densidades urinarias hipotónicas, lo cual favorece ladisminución de la viscosidad citoplasmática. A éstos grandes leucocitos se les llaman“células centelleantes” debido a que el movimiento de los gránulos dentro delcitoplasma produce un aspecto centelleante.La coloración de Sternheimer-Malbin permite visualizar al microscopio los leucocitosurinarios con un patrón tintorial diferente:Leucocitos vitales, con un ligero engrosamiento globuloso, de color azul pálido, ymovimiento vibrátil de los gránulos del citoplasma celular.Leucocitos “desvitalizados”, pequeños, con un núcleo claro y púrpura.Para la coloración se requieren las siguientes soluciones: Solución I Solución II • Violeta de genciana 3,0 g • Safranina O 0,25 g • Etanol al 95% 20,0 mL • Etanol al 95% 10,0 mL • Oxalato de amonio 0,8 g • Agua destilada 100,0 mL • Agua destilada 80,0 mLPara preparar la solución colorante se mezclan 3 partes de la solución I y 97 de lasolución II. Se centrifuga la orina recién emitida, se decanta el sobrenadante. Alsedimento se añade una gota de la mezcla citada y luego se agita; después seprepara el sedimento en la forma habitual. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 37
  38. 38. Porqué estandarizar el Uroanálisis? Martha Guerra de Muñoz MScColoración de GramPara investigar el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de una infección urinaria sehan ideado muchos métodos. En 1957 Kass. E.M y col. estandarizaron la técnicautilizando orina sin centrifugar y coloración de Gram. Interpretación Más de una bacteria x c. corresponde a un urocultivo > 105 colonias / mLSin embargo, Robins, D.G y col 1975, describieron un método alternativo utilizandoorina centrifugada. Interpretación • Bacterias. • Leucocitos > 5 x c AP. • Cilindros leucocitarios. Se correlacionan con urocultivos > 105 colonias / mLLa coloración de Gram es la técnica tintorial diferencial más empleada enmicrobiología. Fue descrita en 1884 por el histólogo Christian Gram; en esteprocedimiento la muestra de orina previamente fijada se somete a las siguientessoluciones secuencialmente: cristal violeta, solución de yodo, alcohol y safranina.La tinción de Gram permite diferenciar las bacterias Gram negativas y Gram positivasdebido a los componentes de las paredes celulares. Las primeras están conformadasde peptidoglucano (2-20%) y lipopolisacárdos (10-20%). En este tipo de bacterias, altener una capa delgada de peptidoglucano el alcohol penetra fácilmente, disuelve loslípidos lo hace que los complejos cristal violeta-yodo salgan permitiendo la entrada delcolorante de contraste (safranina) Las Gram positivas tienen en su paredpeptidoglicanos (90%) lipopolisacáridos (1-2%), ácidos teicoicos y ribonucleato demagnesio. Estas bacterias tienen una pared celular gruesa la cual se deshidrata conel alcohol y cierra los poros impidiendo la salida de los complejos insolubles cristalvioleta- yodo. Jornada de Capacitación y Actualización LABCARE Colombia. 38

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