Dispersiones multifásicas en fermentadores: Entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimenciones y a la alta velocidad

110Y
y. /
DISPERSIONES MULTIFÁSICAS EN
FERMENTADORES: ENTENDIENDO
FENÓMENOS QUE OCURREN EN TRES
DIMENSIONES Y A ALTA VELOCIDAD
ESPECIALIDAD: Ingeniería Química
Dr. Enrique Galindo Fentanes
Doctor en Biotecnología, Especialidad en Ingeniería de Bioprocesos
Fecha de ingreso: 20 de Septiembre de 2007

Dispersiones muIt:fsicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad
CONTENIDO Página
1. Resumen Ejecutivo 3
2. Introducción 5
3. Desarrollo del Tema 7
3.1 Dispersiones multifásicas 7
3.2 Caracterización de las dispersiones 7
3.2.1 Caracterización de dispersiones por análisis de imágenes 8
3.2.2 Uso de cámaras de alta velocidad 8
3.3 Desarrollos previos en nuestro laboratorio 9
3.4 Desarrollos recientes de nuestro laboratorio 9
3.4.1 Técnica estereoscópica io
3.4.2 Videoendoscopía de alta velocidad 10
3.5 Metodologías utilizadas u
3.5.1 Configuración general del sistema 11
3.5.2 Adquisición microestereoscópica de imágenes y su
análisis tridimensional 12
3.5.3 Video de alta velocidad 13
3.5.4 Videoendoscopía de alta velocidad 13
3.5.5 Modelos de estudio 16
3.5.5.1 El hongo Trichoderma harzianum 15
3.5.5.2 El nemátodo Steinernema carpocapsae 16
3.6 Resultados 17
3.6.1 Imágenes en dos dimensiones 17
3.6.2 Imágenes en tres dimensiones 17
3.6.3 Videos de alta velocidad 21
3.6.4. Determinación de 1a velocidad de objetos 21
3.7 Aportaciones 25
4. Conclusiones 27
S. Referencias 28
6. Agradecimientos 32
7. Anexos 33
7.1 Técnica estereoscópica 33
7.2 Condiciones de operación de los sistemas 37
8. Breve Curricu/um vitae . -. 38
Especialidad: Ingeniería Química 2

Dispersiones multifásicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad
1. RESUMEN EJECUTIVO
En numerosos procesos de las industrias química y bioquímica es necesario
dispersar diferentes fases (líquidas, gaseosas, sólidas) para homogenizar el
contenido del reactor, maximizar la transferencia de nutrientes (incluyendo el
oxígeno) y satisfacer las principales necesidades de los procesos. La dispersión
es particularmente crítica en fermentaciones, donde pueden estar involucradas
hasta cuatro fases (líquidos inmiscibles, aire, biomasa).
El proceso de dispersión se lleva a cabo mediante la introducción de energía
(por agitación, bombeo o burbujeo) dentro del biorreactor, para romper y
mantener suspendidas las burbujas de gas o las gotas de la fase líquida
dispersa. Es también relevante mantener suspendidas y homogenizar los
sólidos cuando están presentes. La caracterización de este tipo de dispersiones
se ha realizado por diversas técnicas, destacando las de análisis de imágenes, a
fin de conocer parámetros como el tamaf90 de los objetos (gotas y burbujas) y
poder correlacionarlos con la transferencia de masa. La mayoría de los sistemas
de análisis de imágenes utilizan cámaras convencionales de video (60 cuadros
por segundo) acopladas a una fuente de luz estroboscópica, que permite
"congelar" el movimiento de los objetos en el campo visual. Las imágenes
adquiridas de esta forma permiten caracterizar las dispersiones de manera
bidimensional y obtener una aproximación de lo que sucede dentro del
biorreactor. Sin embargo, los fenómenos suceden en tres dimensiones y de
forma dinámica y este tipo de caracterización no permite identificar posibles
traslapes entre los distintos planos focales y por lo tanto, establecer la posición
espacial de las gotas y burbujas.
En este trabajo se presentan los principales aportes en la caracterización de las
dispersiones multifásicas que ocurren en fermentadores, en la forma que
suceden: en tercera dimensión y a alta velocidad. Para ello fue necesario
desarrollar en primer término, un sistema basado en dos cámaras de video
acopladas a un estereomicroscopio, con el que fue posible adquirir pares
estereoscópicos de imágenes de la misma escena que permiten la visualización
de los fenómenos en tres dimensiones y sobre todo, el establecimiento de las
coordenadas tridimensionales de los objetos (burbujas y gotas), con lo cual es
posible establecer la posición espacial de los objetos. Por otro lado, se
desarrolló un sistema basado en una cámara de video de alta velocidad (de
5,130 cuadros por segundo, 520 x 512 pixeles), acoplada a una sonda de luz de
alta intensidad.
Estas técnicas se han utilizado para caracterizar la dispersión de sistemas
modelo que simulan el proceso de fermentación para la producción de aromas
frutales por el hongo filamentoso (Trichoderma harzianum), el cual utiliza aceite
de ricino como fuente de carbono. Por otro lado, se han aplicado también estas
técnicas para caracterizar un sistema modelo de fermentación para la
producción de nemátodos (Steinernema carpocapsae), los cuales se utilizan
como agentes de control biológico de plagas en la agricultura.
El sistema en tres dimensiones ha permitido discernir, de manera inequívoca, la
inclusión de burbujas en gotas de aceite ' se demostró que el sistema en dos
dimensiones sobreestima la cantidad de elementos incluidos en la fase
orgánica. La presencia de la fase sólida (ya sea el hongo o el nemátodo)
Especialidad: Ingeniería Química

Dispersiones multifsicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad
incrementa la inclusión de burbujas dentro de gotas de aceite, llegando a ser de
hasta 30 % del total de las burbujas presentes en el sistema.
El uso de la cámara de alta velocidad ha permitido identificar algunos de los
eventos que forman las estructuras multifásicas y ha permitido a su vez, la
medición experimental de la velocidad de desplazamiento dentro del tanque de
los elementos de la dispersión.
El conocimiento generado con estas metodologías es de relevancia para el
campo de la ingeniería química, ya que por primera vez ha sido posible
establecer de forma detallada y con datos experimentales las características, a
nivel microscópico, que determinan el transporte de nutrientes en los procesos
de fermentación y, con ello, las bases para proponer mejores modelos de
transferencia de nutrientes que permitaó un más eficiente diseño de los
biorreactores y la optimización de estos procesos.
Palabras clave: dispersión, multifases, fermentación, imágenes,
estereoscopía, hongos, nemátodos
ww

a alta velocidad
2. INTRODUCCIÓN
En numerosos procesos de la industria química bioquímica es necesario
dispersar varias fases. En el caso particular de la inustria que usa procesos de
fermentación para producir una amplia gama de productos (antibióticos, ácidos
orgánicos, vitaminas, proteínas, biofármacos, etc.) es necesario dispersar -en
agua- aceites o solventes orgánicos, aire y la biomasa.
La mayor parte de los procesos de fermentación que se utilizan para producir
metabolitos de alto valor agregado, requieren de oxígeno, un gas de muy baja
solubilidad en agua, que es el medio universal en donde se desarrollan las
actividades biológicas. En consecuencia, para proveer de oxígeno a las células
que se están cultivando, es necesario transferirlo continuamente a la fase
acuosa. Esto se logra burbujeando y dispersando el gas que se introduce al
b lo rre actor.
Hay otros casos en los que existe una segunda fase líquida que también es
necesario dispersar, como en el caso de los aceites vegetales que se utilizan
como nutriente de las células o cuando se usan solventes para extraer
compuestos tóxicos para ellas.
Es también relevante el caso cuando existe una fase sólida que debe ser
dispersada en el proceso. Entre los ejemplbs de fases sólidas
hidrodinámicamente importantes se incluyen a la biomasa de hongos
filamentosos, de células animales o vegetales y organismos tales como los
nemátodos, los cuales también se producen por procesos de fermentaçión.
La productividad del proceso de fermentación depende en buena medida de la
eficiencia con la que se dispersen las fases. Para los casos del oxígeno y de
sustratos líquidos inmiscibles en agua, la dispersión determina (en función del
tamaño de las burbujas de gas y gotas de la fase líquida dispersa) la eficiencia
de los procesos de transferencia de masa. Mientras más pequeñas sean las
burbujas y las gotas, mayor será el área disponible para la transferencia.
La dispersión es también fundamental para garantizar homogenidad en las
condiciones fisicoquímicas (que a su vez determinan la cantidad y tipo de
metabolitos que se producen). Sin embargo, el proceso de dispersión puede
ocasionar daño a la biomasa y la energía suministrada al reactor debe
mantenerse por debajo de ciertos límites críticos. En consecuencia, es necesario
lograr un compromiso entre la dispersión de las fases y la fragilidad de las
células u organismos en el biorreactor. La dispersión se lleva a cabo en
biorreactores de diferentes tipos, siendo el tanque agitado el más usado en la
industria biotecnológica.
Las interacciones entre un líquido (el medro acuoso) y otro líquido inmiscible (la
fase orgánica), un sólido (la biomasa) y el gas (aire) presentes en ciertos
procesos de fermentación, son particularmente complejas. Gran parte de los
estudios encaminados a lograr un mejor entendimiento de estos fenómenos y
sus implicaciones en la fisiología y la productividad de los procesos se han
enfocado desde un punto de vista macroscópico. Es decir, se ha estudiado el
efecto de las variables de proceso (agitación, pH, temperatura, tensión
superficial, etc.) sobre la productividad de los cultivos. Sin embargo, estos
estudios tienen la desventaja de ser sistema-específicos, lo que ha impedido
5

co
a alta velocidad
que puedan aspirar a tener una aplicación más generalizada, ya que no están
basados en conceptos y características fundamentales de los procesos de
transferencia de masa.
Las técnicas modernas de análisis digital de imágenes han permitido el estudio
de los fenómenos de dispersión y mezclado en sistemas multifásicos. Esto ha
abierto una vía importante en el estudio de los mecanismos de transporte de
nutrientes en sistemas de fermentación complejos. Sin embargo, la mayoría de
los trabajos hasta ahora disponibles en la literatura, se han limitado a sistemas
de dos fases (líquido-líquido o líquido-gas) que no son representativos de la
complejidad real en sistemas de fermentación. Además, estos sistemas han sido
caracterizados mediante análisis de imágenes bidimensional y de "foto fija".
Para resolver estas limitaciones, el trabajo aquí expuesto ha utilizado técnicas
de estereoscopía, videoendoscopía y video digital de alta velocidad para el
estudio, in situ, de lo que ocurre a nivel microscópico y en tres dimensiones en
un biorreactor con un caldo de fermentación de alta complejidad (de hasta 4
fases) y la caracterización de los procesos de interacción entre las fases,, que
suceden a alta velocidad.
.

Dispersiones muItifsicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad
3. DESARROLLO DEL TEMA
3.1 Dispersiones multifásicas
Varios de los procesos de las industrias química, de alimentos, farmacéutica, de papel,
de plástico, petroquímica y minera, son dispersiones multifásicas donde se utiliza la
operación de mezclado para la dispersión y homogenización de las fases (Leng, 2004).
También es el caso de las fermentaciones para la producción de enzimas y antibióticos
(Pazouk/, 2000) y en los procesos oxidativos y de flotación en el tratamiento de aguas
residuales (Nienow, 1986), entre otros.
En algunos de estos procesos, es necesario dispersar un gas (generalmente aire) en un
líquido, con el fin de transferir oxígeno al sistema biológico en cultivo. En otros, se
involucra la presencia de una segunda fase líquida, por lo general inmiscible
(Malinowski, 2001), que puede ser la fuente de carbono, así como un solvente utilizado
como agente para mejorar la transferencia de oxígeno o corno agente extrayente de
metabolitos tóxicos para el microorganismo (Serrano-Carreón, 2002). Si se trata de
fermentaciones en las que estén involucradgs hongos filamentqsos (Pazouki, 2000), el
sistema incluye una tercera fase (sólidó) que resulta hidrodinárn,samente importante
considerando el tamaño de partícula y su morfología (Rochá-Valadez, 2005). Esto
también es relevante cuando lo que se está cultivando en el biorreactor son células
animales o vegetales (Wang, 2005; Ramachandra, 2002) u organismos completos
como nemátodos (Eh/ers, 2001).
3.2 Caracterización de las dispersiones
Las dispersiones multifásicas están determinadas por la potencia volumétrica (P g/V)
(Zhou, 1998b), por las propiedades físicas de las fases (Zhou, 1998a; Tsouris, 1996),
por la presencia de agentes surfactantes (Kawase, 1990) o de partículas sólidas
(Kawase, 1997; Ozkan, 2000), además de la velocidad de agitación y de la geometría
del agitador o impulsor.
Una forma de caracterizar estas dispersiones es por muestieo (Córdova-Aguilar,
2003); sin embargo, este enfoque macroscópico, no reporta infoirmación sobre el área
de transferencia de masa.
Otra forma es medir el tamaño de las gotas y de las burbujas (Celmau, 1998). Entre
las técnicas para determinar el diámetro de las gotas o burbujas e encuentran: a) la
medición de la transmisión de luz a través de una interfase (gas-líquido o líquido-
líquido) (Rebelein, 1986); b) a través de una sonda capilar de boro (Bae, 1989); c)
midiendo la diferencia de la velocidad de transmisión de una onda acústica en dos
líquidos (Boyd, 1998); d) con un contador Coulter y la adición de materiales
conductivos (Bae, 1989) y e) por fotografía directa (Chen, 1967; Coulalog/ou, 1976).
Algunos de estos métodos son técnicas basadas en la toma de muestra, por lo que
perturban el flujo y rompen el equilibrio de rompimiento y coalescencia o modifican la
distribución de tamaños de gotas o burbujas. En su mayoría, son técnicas que se han
utilizado sólo en sistemas de dos fases (gas-líquido, líquido-líquido).
it
,

a afta velocidad
3.2.1 Caracterización de dispersiones por análisis de imágenes
El análisis de imágenes es otra forma de estudiar la estructura de estas dispersiones
(gas-líquido y líquido-líquido) a mayor detalle (Pacek, 1994; Galindo, 2000), con lo
cual ha sido posible tener informacióp - en línea- de la distribución de tamaños de
gotas y/o burbujas, sin interferir con ros patrones de flujo de la dispersión, además de
poder relacionar esta información con él área de transferencia de masa.
El análisis cuantitativo de las imágeies se inició con mediciones manuales de los
objetos (Chen, 1967) que luego se sistematizaron con el uso de los sistemas de
cómputo. Para que una imagen pueda ser procesada por la computadora, necesita ser
digitalizada, es decir, convertida en una forma numérica (Junker, 2006). Esto permitió
utilizar fotografías tomadas en la pared del tanque (Chen, 1967), dimensionar
manualmente las gotas o burbujas a partir de estas fotografías y hacer la
caracterización de las dispersiones. Sin embargo, el análisis de dispersiones por medio
de estas fotografías es un método tedioso, que requiere de mucho trabajo manual.
Debido a lo anterior, se han implementado procedimientos digitales para obtener las
imágenes, facilitando así la cuantificación de las gotas (Pacek, 1994) y burbujas
(Machon, 1997) así como su caracterización en cuanto a tamaño y distribución.
A partir de mediciones del diámetro de gotas o burbujas del sistema (tamaño) y
considerando el número de objetos que forman el conjunto de datos, se obtiene un
valor promedio que se define como diámetro Sauter, de acuerdo a la siguiente
fórmula:
o d'
d ,
/
Este valor relaciona el área interfacial (a) por unidad de volumen y el área para la
transferencia de masa, la cual esta dada por:
6h
ci =
d,
donde h= fracción retenida del gas.
3.2.2 Uso de cámaras de alta velocidad
El desarrollo de técnicas de ¡luminación avanzadas y de cámaras de video de alta
velocidad ha permitido la determinación de tamaños de partículas en dispersiones
multifásicas a mayores profundidades de campo (Tayali, 1990). Uno de los sistemas
más utilizados es la velocimetría (PIV) con luz láser, para el análisis de dispersiones
gas-líquido en tanques agitados (Laakkonen, 2005), así como para evaluar los
patrones de flujo existentes en tanques agitados (Escudié, 2003).
Se han utilizado cámaras de video de alta velocidad, que permiten obtener imágenes
para la medición en dispersiones líquido-líquido, cuando la fase dispersa está en altas
concentraciones, tal como reportan Lovick (2005), quienes utilizaron una cámara de
video de alta velocidad acoplada a un endoscopio, para la medición de una dispersión
líquido-líquido.

a alta velocidad
3.3 Desarrollos previos en nuestro laboratorio
Galindo (2000) tomaron como base el sistema reportado por Pacek (1994) para
desarrollar una metodología con el fin de caracterizar dispersimes de hasta cuatro
fases, utilizando sistemas modelo que simulan el cultivo del hongo Trichoderma
harzianum en aceite de ricino. La metodología (Pacek, 1994)pj-a cuantificar gotas
constaba de una cámara de video acoplada a un estereomicros;opio y que envía su
señal a una videograbadora. Las imágenes grabadas se thcsplegaban en una
computadora donde se medían las gotas mnualmente. Posteriorriente Machon (1997)
utilizaron esta metodología para cuantificar los tamaños de bufbuas como función de
la tensión superficial. Dalmau (1998), con un sistema similar midieron los tamaños de
gotas en un sistema modelo de tres fases (medio acuoso, aceite y aire) para la
producción de una lipasa. Sin embargo, Galindo (2000) fueron auienes demostraron
por primera vez la factibilidad de la técnica de análisis de Imágenes para la
caracterización de dispersiones de hasta cuatro fases.
La metodología desarrollada permitió la adquisición de las imágenes en línea, sin
necesidad de tomar muestras. El procesamiento de las imágenes es completamente
digital a través de una cámara conectada a una tarjeta que catura las señales de
video y las transfiere a la computadora, sin requerir un sistema de videograbación
(Galindo, 2005). Con este sistema fue posible realizar un análisis cuantitativo más
detallado de la dispersión, además de evaluar la estructura de la misma y observar las
interacciones aceite-micelio-aire y aceite (Galindo, 2005).
También se han estudiado algunos de los factores que afectan a dispersión de las
fases en estos sistemas modelo, tales como el contenido de aee, la concentración y
morfología de la biomasa y la presencia de proteínas (Larralde.,.21 -102; Lucatero, 2003;
Pulido-Ma yoral, 2004; Galindo, 2005).
3.4 Desarrollos recientes de nuestro laboratorio
Todos los trabajos anteriores se desarrollaron utilizando nágenes, que son
proyecciones bidimensionales del fenómeno que ocurre dentro del áiorreactor. Por otra
parte, los trabajos previos involucraron una cámara convenciorici de video, en donde
las imágenes de lo que sucede en el interior del tanque se tomaron mediante el uso de
una fuente de luz estroboscópica para "congelar" el movimiento de los objetos.
En este trabajo se describe el desarrollo y aplicación de técnicas cás sofisticadas que
han permitido una caracterización muy detallada de los feHmenos en tercera
dimensión y a alta velocidad. Estas técrucas, que se describen a continuación, son la
estereoscopía y la videoendoscopía de alta velocidad.
Uno de los principales problemas que presenta el monitoreo en línea computarizado de
las dispersiones que ocurren dentro del cultivo de un sistema biológico en un
fermentador con agitación mecánica, es la dificultad en la adquisic;ón de imágenes de
alta calidad de los eventos microscópicos que ocurren a altas velm dades en el interior
del tanque. El problema es aún más comejo cuando se requiere analizar zonas más
profundas del biorreactor (como por ejerralb las zonas más cerca:e a los impulsores),
ya que las condiciones de iluminación y dé velocidad son aún más rticas. Más aún, los
fenómenos dinámicos que ocurren en el interior del tanque qeneran estructuras
complejas, como por ejemplo gotas de la fase aceitosa conteniendo en su interior
fracciones de otras fases (como agua y aire), las cuales son impoábles de caracterizar
con precisión con métodos tradicionales de análisis de imágenes n dos dimensiones.
:,

a alta velocidad
En base a estos requerimientos, se diseñó un sistema de análisis de imágenes, que
permite la caracterización cuantitativa de las dispersiones que ocurren dentro de un
fermentador modelo, tanto en dos como en tres dimensiones. No existe reportado en
la literatura ningún método similar que permita el análisis microscópico en tres
dimensiones de las estructuras (a nivel individual) que conforman la dispersión
multifásica, ni tampoco se ha reportado la posibilidad de analizar la formación de
estructuras complejas que se producen con la interacción dinámica de las diferentes
fases que conforman el cultivo.
3.4.1 Técnica estereoscópica
La técnica de estereoscopía está fundamentada en el principio de los ojos humanos, en
el que cada ojo, al observar un objeto, tiene un campo de visión diferente, ya que
éstos se encuentran colocados a un determinado ángulo de separación. El cerebro por
su parte, interpreta ambas imágenes superponiéndolas en la parte frontal, dando lugar
a un campo visual binocular en el que se observa el efecto de profundidad a la que
está colocado el objeto. Por lo tanto, cundo los ojos se fijan en un punto específico,
existe un desfasamiento de los objetos observados en las dos imágenes. Este
desfasamiento es resuelto por el cerebro por triangulación, determinando así la
profundidad relativa de los objetos y reconstruyendo la escena en forma
tridimensional. Si existen varios objetos en la escena, uno de ellos servirá como
referencia y los otros objetos aparecerán desfasados horizontalmente en la imagen
compuesta, con lo cual se podrá calcular la distancia de desfasamiento o profundidad y
con ello, determinar la posición de estos objetos con respecto al de referencia
(Umbaugh, 1997).
Tomando como base este fundamento, se diseñó un sistema de adquisición de
imágenes acoplando dos cámaras de video a los oculares de un estereomicroscopio con
una apertura angular que brinda el efecto estereoscópico. Se utilizó una tarjeta de
adquisición, la cual se sincronizó con la señal de disparo (de las cámaras y de la fuente
de luz estroboscópica), con lo que se obtuvieron pares de Imágenes simultáneas de
una sóla escena.
En el presente trabajo, se utilizó este sistema estereoscópico para la adquisición de
imágenes y el cálculo de la posición espacial de las estructuras presentes en un
sistema modelo de fermentación tetrafásica (medio salino, aceite, aire y biomasa).
Hasta donde se tiene conocimiento, estb es la primera vez en la que una técnica
estereoscópica ha sido utilizada para la caracterización de dispersiones multifásicas y
en nuestro caso, en un tanque agitado.
3.4.2 Videoendoscopía de alta velocidad
La adquisición de imágenes de objetos en movimiento ocasiona distintos problemas, el
principal como consecuencia de la velocidad de los objetos en relación con la velocidad
de la cámara. Cuando los objetos a analizar se mueven a una velocidad mayor a la del
barrido de la cámara, resultan imágenes movidas o difusas (Taboada, 2003; Tayali,
1990).
En este trabajo, usando una cámara de video de alta velocidad, capaz de grabar a
velocidades mayores a 5130 imágenes de 512 x 512 pixeles por segundo, la cual
utiliza una fuente de luz directa de alta intensidad, fue posible adquirir fotografías
Especialidad: Ingeniería Química lO

Dispersiones multifásicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurreí n tres dimensiones y
a alta velocidad -- -
nítidas de objetos que se mueven a altas velocidades dentro Ial tanque. No hay
antecedentes en la literatura respecto a utilizar este tipo de sistemas para la
caracterización de sistemas multifásicos de alta complejidad, como los que suceden en
algunos procesos de fermentación.
3.5 Metodologías utilizadas
3.5.1 Configuración general del sistema
La figura 1 muestra la configuración del sistema de análisis de imágenes que permite
la caracterización en zonas cercanas a la pared del tanque tanto en dos como en tres
dimensiones. El sistema consta principalmente de un tanque d vidrio de 7 htros,
montado en un soporte, alineado axialmente con una turbin.- de mezclado que
administra potencia al sistema. De manera externa, se montó un eporte que sostiene
a un estereoscopio. El sistema incluye una fuente de iluminación3-troboscópica la cual
fue sincronizada a una o dos cámaras de TV a través de un deositivo electrónico
construido en nuestro laboratorio. De esta manera, las partículas :lue se mueven a alta
velocidad en el tanque de mezclado son captadas únicamente dei ante el centelleo de
la luz estroboscópica (10 microsegundos), lo que permite oblener imágenes 'no
movidas' de alta calidad de los eventos que ocurren en el interror :iel tanque. Esta luz
es transmitida al interior del tanque por medio de una guía de cz de fibra óptica, la
cual es alineada con el punto focal de las cámaras de TV. Es irnortante hacer notar
que la distorsión que produce la pared cilíndrica del tanque es curregida a través de
una chaqueta cúbica llena de agua, instalada entre el tanque y las cámaras de TV. Al
sistema se le suministra oxígeno, mediante burbujeo de aire a través de un difusor
sinterizado de acero inoxidable (para HPLC, diámetro de poro 20 pm).
En una primera etapa, el trabajo estuvo enfocado a la adquisición he imágenes de muy
alta calidad, que permitieron observar in situ y en tiempo real, 103 burbujas de aire y
gotas de aceite que se mueven a alta velocidad dentro del loinque de mezclado
(Taboada, 2003; Galindo, 2005). La calidad de imágenes obtenrcas permitió, en una
segunda etapa, el desarrollo de algoritmos para su procesamientc j análisis de manera
semi-automática, aspecto que es fundamental cuando es necesa'e procesar -como en
nuestro caso-, un número muy grande de Imágenes. En este sent;do, en colaboración
con el grupo del Dr, Gabriel Corkidi, del Laboratorio de Imágenes y Visión por
Computadora del CCADET-UNAM, se desarrollaron algoritmos que permiten diferenciar
("segmentar") y cuantificar en forma automática y semi-automátic3, tanto las burbujas
de gas como las gotas de aceite. Cabe señalar que no e eten alternativas ni
dispositivos comerciales que sean capaces de llevar a cabo lo anteor.
Con el fin de detectar -confiablemente- las circunferencias :iue conforman los
contornos de las gotas y de las burbujas, se utilizó una técnica basada en la
trasformada de Hough, pero con algoritmos inéditos que hacen sensiblemente más
eficiente su aplicación tanto en 2 D (Taboada, 2006), como en el análisis en 3 D
(Corkidi, 2007).

,
a alta velocidad
hA
1.
11
e
Hl
¡
P-1
HI
F)e
L 11
Figura 1. Sistema de adquisición de imágenes en 2 y 3 dimensiones, configuración
para analizar zonas cercanas a la pared del tanque. 1) Computadora. 2) Cámara de
TV. 3) Sincronizador estroboscopio. 4) Estereomicroscopio. 5) Soporte. 6)
Estroboscopio. 7) Impulsor. 8) Turbina Rushton. 9) Guía de luz de fibra óptica. 10)
Adaptación a 2 cámaras TV para análisis en 3D.
3.5.2 Adquisición micro-estereoscópica dl imágenes y su análisis tridimensional
Para la adquisición de imágenes en tres dimensiones, el estereoscopio fue
mecánicamente modificado para poder instalarle dos cámaras de TV en los oculares del
mismo. Cabe hacer notar que los estereo-microscopios comerciales sólo tienen
capacidad para una sola cámara de TV (observación de sólo una de las dos imágenes
del par estereoscópico). De hecho, estos equipos están diseñados para poder tener el
efecto tridimensional visual solo a través de los oculares del microscopio y no a través
de equipo electrónico. Las cámaras de TV se conectaron a una sola tarjeta de
adquisición de imágenes RGB (instalada en el interior de una computadora de tipo
personal), de tal manera que una de ellas está conectada al canal ROJO y la otra a los
2 canales VERDE y AZUL (que en combinación dan el color CYAN). De esta manera se
obtiene una imagen estereoscópica combinada en ROJO y CYAN (figura 2), la cual
puede ser observada con efecto tridimensonal a través de lentes especiales (se incluye
Especialidad: Ingeniería Química 1 2
9 . .........,

1
5:
Dispersiones muitifásicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren un tres d:rnensones y
a alta velocidad
un juego con este documento para poder apreciar el fenómeno en las imágenes
señaladas).
Se utilizaron algoritmos para el cálculo de profundidades relativas entre burbujas y/o
gotas con el fin de discernir si provienen de planos diferentes o si están físicamente
unas dentro de otras. Además, se incorporó un sistema de calibración para cada
magnificación utilizada en la adquisición de las imágenes y se estlmó la precisión del
sistema estereoscópico. En el Anexo 1 se presentan los detalles del fundamento
teórico de los algoritmos utilizados y los procedimientos de adquisición, calibración y
estimación de la precisión del sistema.
Figura 2. Imágenes estereoscópicas que al observarse con lentes estereoscópicos, se
ve el efecto tridimensional.
3.5.3. Video de alta velocIdad
En la figura 3 se ilustra el sistema de análisis de imágenes utilizando una cámara de
video de alta velocidad y una fuente de luz directa de alta intensidad. Con este sistema
fue posible adquirir imágenes nítidas e iluminadas, como la que se rnue* str.a en la
figura 4.
Se adquirieron videos de 200 imágenes, a 5130 cuadros por segundo (512 x 384
pixeles) con magnificaciones de 6 X, 8 X y 11 X. Estos videos se utilizaron para la
determinación tanto de los diámetros de gotas de aceite y burbujas de aire como del
porcentaje de inclusiones de burbujas de aire en gotas de aceite.
3.5.4 Videoendoscopía de alta velocidad
Se implementó un sistema de video-endoscopía de alta velocidad que permite capturar
secuencias de imágenes en diferentes zonas del tanque donde se estén generando las

:1
a alta velocidad
estructuras complejas, con la finalidad de abrir la posibilidad para describir y entender
los fenómenos que ocurren durante la interacción dinámica de las diferentes fases.

Dispersiones multifósicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad
La figura 5 muestra esquemáticamente el sistema diseñado para la adquisición de
imágenes. El sistema está compuesto por una cámara digital de video de alta velocidad
(Redlake MotionPro HS4) que permite adquirir hasta 5130 cuadros/segundo de 512 x
512 pixeles. Con esta cámara, se pueden captar secuencias de imágenes de procesos
que suceden a alta velocidad y, además, realizar una reconstrucción secuencial de los
eventos de interés. Asimismo, se le aopló a la cámara un boroscopio de prisma
oscilante (Serie 5 de Olympus). El uso del baroscopio permitió la captura de secuencias
dinámicas de las interacciones de las fases dispersas en diferentes puntos del tanque.
La iluminación se realizó con una fuente de luz Arco Xenon de 180W, directa, y de
considerable mayor intensidad a la luz estroboscópica utilizada en el sistema
desarrollado anteriormente (Galindo, 2005). La luz se transmite al interior del tanque
por medio de una guía de luz de fibra óptica, la cual fue acoplada al boroscopio de
manera rígida (alineada con su eje óptico) de manera que se puedan mover
simultáneamente por el tanque, conservando constante una distancia luz-baroscopio.
De esta manera, se tiene la iluminación suficiente para capturar imágenes en zonas
profundas del tanque. La cámara con el baroscopio y la luz fueron colocadas en un
tripié para facilitar su manejo por las diferentes zonas del tanque.
Figura S. Sistema de adquisición de imágenes, configuración para analizar zonas
profundas del tanque. 1) Tripié. 2) Cámara de alta velocidad. 3) Baroscopio. 4) Luz
arco Xenon. 5) Computadora. 6) Tanque de mezclado. 7) Difusor de aire. 8) Turbina
Rushton. 9) Guía de luz de fibra óptica 10) Detalle que muestra la distancia y posición
que debe tener la luz del baroscopio.

4
.
sk
.'
Dispersiones multifsicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensones y
a alta velocidad
3.5.5 Modelos de estudio
3.5.5.1 El hongo Trichoderma harzianum
La 6-pentil-a-pirona (6PP) es una lactona que tiene aroma a coco y presenta actividad
fungicida (Bonnarme, 1997) y que es producida por el hongo Trichoderma harzianum.
Este hongo puede crecer en la forma de micelio o agregado laxo (figura 6 a) o bien
como pellets (figura 6 b). Se ha demostrado que en el caso de Trichoderma, como en
otros cultivos de hongos filamentosos, existen condiciones hidrodinámicas óptimas
para el crecimiento y/o la producción de un metabolito dado. La producción de la 6PP
es función de la hidrodinámica presente dentro del fermentador y responde a un
cambio en el metabolismo de la fuente de carbono (Rocha-Valadez, 2005). Sin
embargo, es importante mencionar que en este sistema tan complejo y dinámico, el
transporte de nutrientes (y por ende su disponibilidad) está muy lejos de estar
plenamente entendido a detalle.
a) b)
Figura 6. Trichoderma harzianum dos tipos de morfología: a) micelio disperso,
b) pellets.
3.5.5.2 El ne mátodo Steinernema carpocansae
Los nemátodos entomopatógenos (NEPs) del género Steinernema spp. (figura 7) son
enemigos naturales de diferentes insectos, por lo que se utilizan como agentes de
control biológico contra insectos-plaga que atacan a diversos cultivos agrícolas (Islas-
López, 2005).
Figura 7. Macho adulto de Steinernema carpocapsae de primera generación.

a alta velocidad
La producción de NEPs se hace por lo general en biorreactores con agitación
neumática, aunque también se utilizan tanques agitados mecánicamente. En vista de
su tamaño (300 - 500 pm), los nemátodos pueden sufrir daño mecánico cuando se
cultivan en biorreactores y son partículas sólidas que hay que dispersar
eficientemente, pero sin dañarlas (Shapiro-Ilan, 2002). Adicionalmente, los nemátodos
pueden interaccionar importantemente con las burbujas de gas y/o las gotas de aceite
(componente del medio para su cuItivo) contribuyendo potencialmente a los
fenómenos de ruptura y coalescencia de gotas y burbujas.
3.6 Resultados
3.6.1 Imágenes en dos dimensiones
Un requisito indispensable en cualquier técnica de análisis de imágenes es la
adquisición de imágenes de alta calidad. La figura 8 muestra ejemplos de imágenes
adquiridas de alta calidad en dos dimensiones, mostrando diferentes fenómenos. La
alta calidad de imágenes obtenida permitió observar y registrar fenómenos muy
interesantes, por ejemplo, la introducción de burbujas de aire dentro de gotas de
aceite (Larralde, 2002) y la presencia de microgotas de agua dentro las mismas
(Escobar-Anzurez, 2005). La identificación de estos fenómenos es relevante ya que
implica el replanteamiento de lo corrinmente aceptado sobre el transporte de
nutrientes en la fermentación, en donde se asume que las burbujas transfieren el
oxígeno que contienen a través de la interfase burbuja-agua.
Figura 8. Imágenes típicas de alta calidad (2 dimensiones) obtenidas con el sistema
desarrollado: a) Gotas de aceite con superficie lisa, burbujas de aire libres y burbujas
atrapadas en aceite; b) Interacción del micelio con gotas y burbujas; c) Estructuras
complejas representativas de dispersiones múltiples.
3.6.2 Imágenes en tres dimensiones
Una de las principales aportaciones de este trabajo fue la identificación tridimensional
de las gotas y burbujas presentes en la dispersión. Aplicando los algoritmos de
segmentación desarrollados, el sistema fue capaz de calcular la posición z de los
objetos (profundidad) y con ello fue posible establecer si los objetos estaban incluidos
(color verde) o traslapados (color amarillo), como se ilustra en la figura 9.
La figura 10 muestra una secuencia de imágenes generada a partir de una escena
real. Con los datos tridimensionales obtenidos con el sistema, una escena real es
rotada sobre el eje vertical, mostrando cómo objetos que aparecen aparentemente
traslapados en un cierto ángulo de vista, no lo están en la realidad, haciendo evidente
el error que se introduce en observaciones donde no se utilizan técnicas

a alta velocidad
tridimensionales. Ello ha permitido discernir si lo que se ve en la proyección en dos
dimensiones, se trata de traslapes o inclusiones.
'
'5
ki ,
Figura 9. Determinación de inclusiocias y traslapes, partículas verdes: inclusiones,
partículas amarillas: traslapes).
e
U)
f
j
í
e
Figura 10. Secuencia giratoria de la escena real (última imagen) reconstruida en 3
dimensiones (cada imagen gira 10 grados sobre su ee vertical central). Se observa
cómo objetos que aparecen traslapadas en la primera imagen de la secuencia, en
realidad no lo están (ver imágenes subsecuentes).

.- .
a alta velocidad
Con el fin de establecer las posibles diferencias entre los datos adquiridos en dos y tres
dimensiones, se estudió un sistema de cuatro fases, previamente caracterizado por
Lucatero (2003), quienes evaluaron el efecto de la concentración de la biomasa de
Tríchoderma harzianum, ya sea en forma de pe/Iets o de agregados laxos, sobre el
porcentaje de burbujas (con respecto al total medido de la muestra) que se
encuentran incluidas dentro de las gotas de aceite.
En la figura 11 se observa que, en el caso de la técnica estereoscópica (3 D), a
mayores concentraciones de biomasa (en la forma de pellets), el porcentaje de
burbujas dentro de las gotas de aceite tiende a aumentar de un 12 a un30 O/,, Este
porcentaje es menor que el obtenido con la técnica bidimensional (2 D), el cual se
determinó próximo al 40 % independientemente de la concentración de biomasa (en
forma de pel/ets). Asimismo, en la figura 12 se observa que cuando se incrementa la
concentración de biomasa en la forma de micelio disperso, el porcentaje de burbujas
dentro de las gotas de aceite tiende a aumentar. En el caso de la técnica
estereoscópica, este porcentaje se incrementó del 13 al 40 %, mientras que con la
técnica bídimensional el mismo parámetro se determinó entre el 40 y 75 % Esto es
de particular importancia ya que tanto las tendencias como los valores absolutos del
porcentaje de burbujas incluídas en las gotas de aceite fueron diferentes (y en general,
menores) cuando se utilizó la técnica 3 D respecto a los resultados con la técnica
convencional en dos dimensiones. Por tanto, cuando el sistema multifásico es
caracterizado en tres dimensiones, es posible establecer sin ambigüedad las
condiciones de transferencia de oxígeno, camino difusional y fase en contacto directo
con las burbujas de aire.
mi
011
o
1
4-'
c
40
-o
.° 20
0 0.2 0.4 0.6 0.6 1 1.2 1.4
Biomasa (g/L)
Figura 11. Influencia de la concentración de biomasa en forma de pel/ets sobre el
porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite con las técnicas bidimensional y
estereoscópica.
Especialidad: Ingeniería Química -- 19

Dispersiones multifésicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y
a alta velocidad -
F1i
O
O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Biomasa (g/L)
Figura 12. Influencia de la concentración de biomasa en forma de micelio disperso
sobre el porcentaje de burbujas dentro de las gotas de aceite utilizando las técnicas
bidimensional y estereoscópica.
En tórminos del diámetro de gotas y burbujas, en la figura 13, se ilustra un eernplo
para el caso cuando se usaron pellets del hongo Trichoderma harzianum. El diámetro
Sauter de las gotas de aceite y de las burbujas de aire fue muy similar a lo reportado
previamente por Galindo (2000) y por Lucatero (2003) usando la técnica
bidimensional. Esto es lógico, ya que la determinación del diámetro de los objetos no
se espera que dependa de si el sistema es caractetizado en dos o tres dimensiones.
1400
1200
E °°°
800
vi
a
400
in
tas de acelle
200 -
Burbujas de arre
0 01 02 O. 04 05 6
Bomasa (g/L)
Figura 13. Influencia de la concentración de biomasa en forma de pellets sobre el
diámetro Sauter de las gotas de aceite y las burbujas de aire en un sistema de cuatro
fases.
o
60
40
1.
20

a alta velocidad
3.6.3 Video de alta velocidad
El sistema de alta velocidad permitió obtener imágenes nítidas, bien iluminadas y con
un elevado número de objetos enfocados (figura 14), con lo cual se pueden
determinar confiablemente los d 32 y la distribución de tamaños.
Figura 14. Secuencia de imágenes obtenidas con el sistema de video de alta velocidad
de un sistema de tres fases.
Con este sistema se logró la toma de secuencias de imágenes en diversas zonas de
turbulencia del tanque y registrar los eventos que suceden en las dispersiones
(principalmente interacciones entre burbujas, gotas de aceite y biomasa miceiral). La
alta velocidad de adquisición permitió visualizar de manera detallada las estructuras
complejas que se forman en estas zonas, como las que se muestran en la figura 15.
Para efectos de visualización, en esta figura se muestran sólo algunos cuadros de la
secuencia, donde es posible apreciar el movimiento de las estructuras a través de la
zona de enfoque. Cabe resaltar que en las imágenes se observan objetos que no son
esféricos, que corresponden a estructuras que se encuentran en proceso de formación.
Es importante resaltar que este tipo de fenómenos no habían sido registrados con
anterioridad utilizando la cámara convencional.
Con respecto al modelo de nemátodos, en la figura 16 se presentan algunas imágenes
adquiridas por video-endoscopía de alta velocidad, donde es posible apreciar que en
este sistema también se forman estructuras complejas o gotas multifásicas.
3.6.4 Determinación de la velocidad de objetos
Con el sistema de alta velocidad se han adquirido secuencias de ¡mágenes en la que
aparecen las mismas estructuras hasta en 40 imágenes en forma ligeramente distinta,
lo cual permite una caracterización muy detallada de las dispersiones y determinar los
efectos dinámicos que se llevan a cabo en el reactor. Por ejemplo, es posible
determinar las inclusiones siguiendo la secuencia del video, de tal manera que si una
burbuja de aire y una gota de aceite siguen la misma trayectoria y velocidad, se
considera que la burbuja está dentro de la gota y si a lo largo de la secuencia la
velocidad y trayecto no es el mismo, la burbuja se encuentra fuera como se puede
apreciar en la figura 17.
4 J.,

a alta velocidad
Secuencia 1 Seuencia 2 Secuericia 3
Figura 15. Tres ejemplos de secuencias de estructuraS complejas adquiridas por el
sistema de videoendoscopía de alta velocidad.
.4 .
"»

a alta velocidad
ir
Figura 16 . Secuencia de imágenes obtenidas con el sistema de videoendoscopía de
alta velocidad de un sistema de cuatro fases, siendo la cuarta fase, nemátodos en fase
de IJ, donde se registrar la formación de gotas multifásicas (conteniendo burbujas de
aire y pequeñas gotas de agua) dentro del tanque, así como NEP's.
Dentro
1- ucra
Figura 17. Secuencia de imágenes para discernir los objetos incluidos dentro de las
gotas de aceite de los objetos sobrelapados.
De igual manera, con este sistema de video de alta velocidad fue posible estudiar la
cinética de la dispersión y caracterizar de forma muy fina los cambios que ocurren en
el sistema. Un ejemplo de esto se observa en la figura 18, donde se incluyen
imágenes representativas de lo que sucede desde que se inicia la agitacin en el
tanque y conforme transcurre el tiempo de dispersión. Las inclusiones de burbujas en
gotas de aceite se incrementaron con respecto al tiempo de dispersión y con este
sistema fue posible registrar fenómenos como el proceso de formaciçn de gotas
multifásicas (figura 19) o la interacción entre las estructuras (figuras 20 y 21).
Es posible también determinar la velocidad a la que se mueven las distintas
estructuras como se ejemplifica en la figura 22. Para este cálculo, se toman dos
imágenes de una secuencia, en donde la estructura de interés se observe enfocada y
se mide el desplazamiento de la estructura enfocada y a la vez se determina el tiempo
transcurrido entre la adquisición de ambas imágenes. Por ejemplo, para el caso que se
reporta en la figura 22, se calculó una velocidad de 29.6 cm/s para la gota de aceite
señalada.

a alta velocidad
Tiempo desde el inicio 2 15
10
de la dispersión (mm)
% de burbujas 3.1 . 9.3 10.6
dentro de gotas
Figura 18. Imágenes típicas y porcentaje de inclusiones con respecto al tiempo de
dispersión en un sistema de tres fases conteniendo proteína.
~rwz -
)'M7 .
/ . .
..- ..
Figura 19. Formación de gotas multfasicas en un srstema de tres fases (agua-aire-
aceite), con presencia de proteína.
Figura 20. Interacción entre las diversas estructuras presentes en un sistema de tres
fases (en presencia de proteína).
Especialidad: Ingeniería Química -- -- . 24

a alta velocidad
Figura 21. Interacción entre una gota de aceite, una burbuja de aire y un NEP en
estadío H. Estas son estructuras presentes en un sistema de cuatro fases con
nemtodos.
t0 +5.8x10 4 s t0
Figura 22. Determinación de a velocidad con la que mueven las gotas y burbujas
dentro del tanque de mezclado en un sistema de tres fases con BSA y P 5 de 05 kW/m'
(29.6 cm/s).
3.7 Aportaciones
Los procesos fermentativos que involucran dispersiones multifsicas son altamente
complejos y por lo tanto, muy difíciles de caracterizar. En estos procesos, se ha
observado la existencia de estructuras complejas, las cuales consisten en gotas de
aceite que contienen una gran cantidad de burbujas de aire y de gotas muy pequeñas
de agua. Este fenómeno se acentúa cuando hay concentraciones altas de biomasa, o

a alta velocidad
bien, cuando en el medio existen proteínas, lo cual puede modificar sensiblemente la
transferencia de oxígeno al cultivo, lo cual tiene generalmente un áfecto muy
importante en el rendimiento y/o prodLictividad del proceso de fermentación.
Hasta el momento se desconocen los mecanismos por los cuales se forman estas gotas
multifásicas. Una posibilidad seríen las colisiones gota-burbuja y/o gota-
micelio/nemátodos. El primer paso que se dió para dar respuesta a estas
interrogantes, fue la implementación de un sistema capaz de visualizar el proceso de
formación de dichas estructuras, de manera que se puedan conocer los factores que
están participando en su formación.
Se ha establecido que ciertas condiciones, como un mayor contenido de biomasa
(sobre todo en forma de agregados laxos) o la presencia de bajas concentraciones de
proteína, aumentan el porcentaje de bUrbujas que se encuentran dentro de gotas de
aceite, llegando a constituir hasta un 30 % del total determinado por el sistema de 3
D. Este hecho es particularmente relevante yá que la transferencia de oxígeno (de la
burbuja al seno del líquido, donde puede ser aprovechado por el microorganismo) es
muy complejo, ya que involucra, primero, la difusión del oxigeno de la burbuja de aire
al medio aceitoso (que es cerca de 500 veces más viscoso que el agua, pero que tiene
una solubilidad cerca de 8 veces más alta que en el agua) y luego su difusión de la
gota de aceite al seno del líquido. Usualmente, los modelos aceptados de transferencia
de oxígeno en fermentaciones sólo asumen que la principal resistencia a la
transferencia de masa sucede en la intefase gas-agua. En consecuencia, la
información generada en este trabajo permitirá explicar y modelar con mayo.r precisión
los fenómenos que suceden en las fermentaciones multifásicas y, por lo tanto,
proponer mejores sistemas o condiciones de transferencia de oxígeno para estos
sistemas.
mt
1 S •
•
. .

Dispersiones multifsicas en fermentadores: entendiendo fenómenos que ocurren en tres dimensiones y a
alta velocidad
4. CONCLUSIONES
Se desarrollaron e implementaron tcnicas que permitieron obtener detalles
microscópicos y dinámicos de los procn5os de dispersión que ocurren en procesos
complejos de fermentación.
La técnica estereoscópica permitió la caracterización de dispersiones multifásicas de
manera muy precisa, ya que además do Conocer el tamaño de las gotas y burbujas,
fue posible discernir objetiva e inequívocarjente si las burbujas de aire están incluídas
o están traslapadas.
El sistema de videoendoscopía de alta velócidad permitió obtener imágenes nítidas y
con el número necesario de objetos enfocados para caracterizar las dispersiones. El
seguimiento de la secuencia permitió también la determinación de inclusiones y el
cálculo de la velocidad de los objetos dentro del biorreactor.
Fue posible documentar la interacción entre los nemátodos y las otras fases
involucradas en el proceso así como verificar que la agitación mecánica no causó
fragmentación de ellos.
La caracterización de las dispersiones como realmente suceden (en tres dimensiones y
a alta velocidad) ha permitido establecer las condiciones -a nivel microscópico- bajo
las cuales se lleva a cabo el transporte ce nutrientes en los procesos de fermentación
y, con ello, abren una puerta para el dseño y optimización de estos procesos sobre
bases científicas.
4
o *-
'>1 )
Especialidad: Ingeniería Química - 27

a alta velocidad
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a alta velocidad
6. AGRADECIMIENTOS
Se reconoce y agradece la exteniva colaboración del Dr. Gabriel Corkidi, del
Laboratorio de Imágenes y Visión pcir Computadora del Centro de Ciencias Aplicadas y
Desarrollo Tecnológico (CCADET) de la UNAM, en el desarrollo de las técnicas de
análisis de imágenes.
Se reconoce la participación de Patricia Larralde, Ma. Teresa Brito, Savidra Lucatero,
Nancy Pulido, Jean Briére, Teddy Voisson, Othón Escobar, Luz Helena Horita, Leticia
Vega y Rufino Díaz en los trabajos preliminares de diseño, montaje y caracterización
de sistemas de análisis de imágenes que conforman los antecedentes de este trabajo.
Se agradece el apoyo técnico de Blanca Taboada y de Ma. Soledad Córdova y la
participación de las estudiantes Itzma Itzel Ruíz, Eliane Guevara y Gabriela Maciel en
el montaje de los equipos, producción de la biomasa de Trichoderma harzianum y de
Steinernema carpocapsae y en el desarrollo experimental de este proyecto.
Para el desarrollo de esta línea de investigación, se contó con el apoyo económico de
la UNAM y del CONACyT.

a alta velocidad
7. ANEXOS
7.1 Anexo 1
7.1.1 Técnica estereoscópica
7.1.1.1 Adquisición micro-estereoscópica de imágenes y su anáiisis tridimensional
Considerando que la adquisición del par de imágenes estereoscópicas conlleva una
serie de problemas mecánicos, electrónicos y computacionales, se utilizó una sola
tarjeta de adquisición para las dos cámaras de video, por lo cual no fue necesario
sincronizar dos sistemas de adquisición independientes. Para realizar una prueba de
factibilidad del nuevo sistema propuesto, se adquirieron imágenes de un modelo
sencillo de esferas de unicel de tamaños diferentes y colocadas a distintas
profundidades. Estos objetos simularon las gotas y burbujas que se observan en una
dispersión real. La prueba consistió en calcular la posición relativa de las esferas,
teniendo una esfera de referencia (la de mayor tamaño). Para ello se desarrollaron
algoritmos utilizando como base un programa comercial de procesamiento de
imágenes, con lo cual se determinó la correspondencia entre los mismos objetos en el
par de imágenes, así como el cálculo de su posición espacial. De esta manera, el par
estereoscópico de imágenes adquirido fue codificado para su visualización
estereoscópica y procesamiento utilizando los algoritmos desarrollados.
El ángulo de separación de las cámaras era susceptible de variar en cada experimento.
Esto no permitía que los algoritmos de cálculo de z y correspondencia generaran
información consistente y reproducible. En consecuencia, se modificó el mecanismo de
acoplamiento de las cámaras para mantener fijo el ángulo entre ellas, para lo cual se
diseñaron y fabricaron algunas piezas que permitieron alinear las cámaras con mayor
precisión y así adquirir imágenes de las estructuras en movimiento. Por otra parte, se
modificaron los algoritmos de procesamiento, de tal manera que la correspondencia
entre ambas imágenes fuera más sencilla de obtener.
7.1.1.2 Segmentación y correspondencia
La técnica estereoscópica implica dos partes, una es la adquisición del par de imágenes
estereoscópicas, donde se debe colocar cuidadosamente las dos cámaras de video con
la misma referencia vertical, de manera que las coordenadas y de los centros de
gravedad de los objetos tengan hipotéticamente los mismos valores.
La otra parte es el procesamiento de los pares estereoscópicos, cuyas funciones son:
Separación de la imagen estereoscópica en sus dos componentes (imagen izquierda
e imagen derecha).
Alineación de las imágenes en función de los objetos de referencia, lo que es muy
importante ya que de esta manera se mantiene el mismo eje y en ambas
imágenes, mientras que el eje x varía en las dos imágenes debido al ángLilo de
separación de las cámaras con que se adquirieron las imágenes. Si hay variaciones
en los ejes y, no hay correspondencia de un mismo objeto en las dos imágenes del
par estereoscópico y el algoritmo de correspondencia no es válido.
Segmentación de objetos (gotas y burbujas).
Cálculo de las profundidades entre objetos.
Despliegue de resultados (objetos dentro o fuera de otros, ¡e. gotas de agua
dentro de gotas de aceite, burbujas de aire dentro de gotas de aceite).

a alta velocidad
La segmentación consiste en extraer los objetos de interés (gotas o burbujas) en una
imagen, para lo cual es necesario deilmitar los contornos de dicho objeto. Una vez
segmentado el objeto en la imacen izquierda, se realiza la correspondencia
(match/ng), es decir, se determina si el objeto segmentado en las imágenes izquierda
y derecha es el mismo.
Sobre la imagen izquierda se segmenta un objeto (gota o burbuja) y se forma un
círculo que se mueve a la imagen derecha (mismo eje y y desplazamiento en eje x).
Para realizar la correspondencia de los objetos, el algoritmo está diseñado para no
permitir al usuario segmentar otro objeto de la misma imagen izquierda, a menos que
ya se haya segmentado el mismo objeto, en la imagen derecha. Asimismo, una vez
alineadas las imágenes, el algoritmo no permite modificar la posición y del objeto en
proceso de segmentación, es decir moverlo hacia arriba o hacia debajo de la
coordenada y designada para este objeto segmentado en la imagen izquierda. De
esta manera la coordenada y y el radio del objeto segmentado permanecen
constantes. Con los valores de las coordenadas del centro de los objetos en ambas
imágenes, se calcula el valor del eje z del objeto segmentado y se determina su
posición espacial.
7.1.1.3 Modelo teórico del sistema estereoscópico
En la figura A 1 se muestra un esquema del sistema estereoscópico en el que se
consideran dos cámaras con características físicas idénticas (la dimensión y el número
de pixeles por sensor y su posición relativa con respecto al sistema óptico). Asimismo,
sólo un parámetro intrínseco define el modelo teórico de la cámara llamado focal f. El
sensor está colocado delante de la lente para representar la imagen digital no invertida
proporcionada por la cámara (las lentes invierten la imagen pero los dispositivos
electrónicos asociados a la cámara corrigen este efecto). Se considera que las dos
imágenes se encuentran alineadas a un mismo eje óptico, dando lugar al plano A. De
esta manera se pueden definir dos parámetros: la distancia D existente entre los
sensores de ambas cámaras y el ángulo O formado entre los dos ejes ópticos. Por
tanto, la posición de cualquier punto p, que se encuentre dentro del sistema de
referencia se puede calcular mediante triangulación.
Sistema 3D
Ø
Plano c
izonierda Ir
Figura A 1. Esquema del sistema estereoscópico desarrollado.
..p,

a alta velocidad
Se hace uso de la trigonometría para obtener la posición (x,y,z) del punto p i dentro de
la referencia 7Txyzt desde su posición con respecto al sensor Pi de la cámara izquierda
(x 1 ,y 1 ) en la referencia 7t1 y con respecto al sensor de la cámara P2 (x 21 y2 ) en la
referencia 72 (figura A 2).
--- Sensor 1
A
Plano A
1 Ejes iccs
/
1
Piano B
/ • dp
f, 1 ZI,
Figura A 2. Cálculo de la posición espacial de los objetos.
7.1.1.4 Cálculo de los objetos incluidos dentro de las gotas de aceite
Las posiciones espaciales de los diferentes objetos permiten discernir si los objetos
están atrapados realmente, de los resultados que se obtienen utilizando una técnica
bidimensional, donde no es posible determinar la posición espacial de los objetos.
Para esto, se calcula la distancia Euclidiana entre los centros de gravedad de gotas o
burbujas ver la figura A 3). Tanto las gotas como las burbujas son
consideradas como esferas perfectas desde su segmentación, la cual se realiza con
círculos.
En la figura A 3 se considera que la partícula C 2 está dentro de la partícula C 1 , con
una tolerancia de inclusión e, si D+P 2 x (1-e) R 1 se cumple. La tolerancia de
inclusión puede ser ajustada para fijar un criterio de inclusión, es decir, determinar la
fracción de la partícula C 2 que requiere estar dentro de la partícula C 1 para ser
considerada como partícula incluida. Para considerar a C 2 como una partícula incluida,
la máxima fracción de C 1 que puede estar fuera debe ser de 1/8 de su radio.
7.1.1.5 Precisión del sistema
Para calcular el error del sistema, se utilizó un portaobjetos de vidrio con un círculo
grabado de 3 mm de diámetro, en cuyo centro se encuentra una recta de 1 mm
dividida en secciones de 10 tm cada una. Este micrómetro se colocó en la platina de
un microscopio, cuyo desplazamiento fue controlado por un programa de computadora.
El micrómetro se colocó en una posición en la que el círculo y la regla tuvieran el
mismo tamaño en las imágenes adquiridas por las cámaras izquierda y derecha, con la
finalidad de lograr el alineamiento perpendicular.

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Utilizando las magnificaciones 1.0 y 1.2 del estereomicroscopio, se adquirieron
imágenes del micrómetro que se fue dcsplazando 10 mm sobre el ee rt con intervalos
de 100 pm. Posteriormente, se secjmentó el círculo del micrómetro para cada
magnificación e intervalo adquiridos, se evaluó la posición sobre el eje z con el modelo
teórico y el resultado se comparó con la distancia conocida y determinada por el
programa de computación (ver figura A 4).
Figura A 3. Determinación de la inclusión y traslapes de burbujas y gotas
JAJ
•
r '4-
1
<D
Figura A 4. Determinación de la precisión del sistema estereoscópico utilizado.

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7.2 Anexo 2
72.1 Condiciones de operación de los sistemas
7.2.1.1 El honno Trichoderma harzianum
El sistema consistió de un tanque de mezclado de 0.21 m de diámetro y 0.24 m de
altura, con una turbina Rushton (D/T=0.5) colocada a una altura de 0.10 m del fondo
del tanque, un difusor sinterizado con tamaño de poro de 20 pm (Waters
Chromatography) y 4 mamparas. El trique fue colocado en una chaqueta de acrílico
con agua para mantener la temperatura a 29°C (como ocurre en la fermentación) y
por otro lado, para corregir las deformaciones geométricas de las gotas y burbujas al
observar a través del tanque de vidrio. La iluminación fue proporcionada por una
fuente de luz estroboscópica (EG 6 G Optoelectronics, modelo MVS-2600) con una
potencia de 60 Hertz, introducida al interior del tanque por medio de una guía de fibra
óptica, colocada a 5 mm de la pared del tanque, a la altura de la descarga del impulsor
y frente a la lente del estereoscopio.
La fase continua fue una solución de sales con la misma composición que el medio de
cultivo para la producción de micelio de Trichoderma harzianum (Serrano-Carreón,
2002). La fase dispersa fue aceite de ricino al 5 % (y/y). La fase sólida fue biomasa
Trichoderma harzianum a diferentes concentraciones (0.05 a 2.4 g/l), con dos tipos de
morfología: pellets y micelio disperso y clumps. Se trabajó con una agitación de 200
rpm y un flujo de aire de 0.25 vvm. El volumen de operación fue de 6.7 1. Las
imágenes adquiridas se procesaron, segmentando manualmente los objetos para así
determinar la distribución de tamaños de gotas y burbujas.
7.2.1.2 El nemátodo Steinernema caroocaosae
Se diseñó un sistema modelo en base a las concentraciones iniciales de los
componentes del medio de producción (Islas-López, 2005). El sistema modelo
diseñado consistió en una solución de NaCI al 0.5 %, 8.2 % y/y de aguamiel y 2.5 o,/
y/y de aceite de maíz. La yema de huevo se sustituyó por albúmina bovina debido a
que las partículas de yema ocasionan tutbidez y dificultan la segmentación de óbjetos.
Se utilizó un tanque de 1.2 L equipado con un impulsor de paletas inclinadas D/T =
0.33, 4 mamparas y un difusor de gas (sinterizado). Las imágenes se tomaron bajo las
condiciones de operación similares al tanque de producción, para lo cual se estimó la
potencia suministrada por medio de un dinamómetro (Reséndiz, 1991). La velocidad
de agitación fue de 8.45 rps y la aireación de 1 vvm. Se cultivaron nemátodos en tres
etapas de su ciclo de vida (13, Ji y adultos) para ser utilizados como fase sólida. Se
adquirieron imágenes de los sistemas modelos trifásicos con un sistema de visión
estéreo-microscópica y videos de 200 imágenes (512 x 512 pixeles) con el sistema de
video-endoscopía de alta velocidad. Las imágenes adquiridas se procesaron,
segmentando manualmente los objetos para así determinar la distribución de tamaños
de gotas y burbujas.

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S. BREVE CURRICULUM VITAE
Ingenierio Químico (Universidad Autunoma de Puebla, 1979), Maestro y Doctor en
Biotecnología (UNAM, 1983 y 1989), Posdoctorado en la Universidad de Birmingham,
Inglaterra (1990). Investigador del Instituto de Biotecnología de la UNAM desde 1984.
Autor de 112 artículos de investigación original, de 47 trabajos de divulgación o
revisión y editor de dos libros. Autor de 6 patentes. Participó en el desarrollo de tres
procesos biotecnológicos que han sido transferidos a sus usuarios. Ha dirigido 25 tesis
de licenciatura, 19 de maestría y 4 de doctorado. Ha recibido varias distinciones,
destacando el Premio de la Academia de la Investigación Científica (1994) y el Premio
Sven Brohult (2004), máxima disticián que otorga la International Foundation for
Science. Desde 1984 es miembro del Sistema Nacional de Investigadores, donde tiene
el nivel III desde 1999. Fue Presidente de la Sociedad Mexicana de Biotecnología y
Bioingeniería, A.C. (1999-2000). Ha formado parte de comités de alto nivel,
destacando la Comisión Dictaminadora del SNI y el Comité de Trabajo de Ingeniería y
Tecnología del Foro Consultivo Científico y Tecnológico. Actualmente es Jefe del
Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto de Biotecnología de la
UNAM, en Cuernavaca, Morelos, Presidente de la Academia de Ciencias de Morelos y
miembro del Comité Ejecutivo del North American Mixing Forum. Su trabajo se centra
en la ingeniería de bioprocesos, en particular en los aspectos hidrodinámicos de
sistemas de cultivo de biomasa y en el desarrollo y escalamiento de procesos
biotecnológicos para las industrias alin;entaria y agrícola.
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