Este documento presenta los resultados de un experimento para aislar e identificar las bacterias Bacillus anthracis y Clostridium tetani a partir de muestras de suelo y estiércol. Se logró cultivar ambas bacterias y caracterizar sus colonias y morfología mediante tinción de Gram. Se realizaron pruebas bioquímicas como catalasa, fermentación de carbohidratos y reducción de nitratos para identificar cada bacteria. Los resultados coincidieron con las descripciones de los géneros en manuales, confirmando la identificación de B. anth

1. Integrantes
Chavez Encalada David Rodolfo
Salazar Farro Yamille Nicole
Docente
Dra. Olga V. Francia Arana
Grupo
Grupo 01 – sub grupo 04
Semestre académico
2022 - I
Asignatura
Bacteriología
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Informe de Práctica N° 4
Aislamiento e identificación de los
géneros: Bacillus y Clostridium

2. Practica N° 4:
Aislamiento e identificación de los géneros: Bacillus y Clostridium
I. Introducción
Clostridium y Bacillus son géneros Gram positivo pertenecientes al filum Firmicutes.
En cultivos frescos se tiñen de azul, pero, tras 24 horas de crecimiento, tienden a
perder la coloración de Gram y aparecen teñidos de rojo. Clostridium tetani forman
endosporas terminales esférica de mayor diámetro que la célula vegetativa, por lo que
la célula con la espora tiene aspecto de palillo de tambor.
Algunas especies de interés sanitario como el B. anthracis (aerobio o anaerobio
facultativo, catalasa positivo-causante del carbunco) y C. tetani (anaerobio estricto y
catalasa negativo-causa el tétano).
B. anthracis produce toxinas compuestas por tres proteínas distintas: antígeno
protector (PA), factor de edema (EF) y factor letal (LF). Las cepas virulentas también
están encapsuladas. Los genes estructurales de PA, EF y LF -pagA, cya y lef
respectivamente residen en un plásmido denominado pXOl. Los miembros del género
Bacillus aislados en muestras clínicas suelen crecer bien y esporular en agar sangre
de carnero y agar chocolate incubados a 37 °C en condiciones aerobias. La
esporulación puede ser estimulada mediante el subcultivo en agar nutrientes con
suplemento de M nS04 (concentración final de 5 |ig/mL) e incubación ulterior.
II. Objetivos
• Aislar y estudiar las características de crecimiento y morfología celular
de Bacillus y Clostridium.
• Identificar e interpretar las técnicas de identificación para Bacillus
anthracis y Clostridium tetani.
III. Materiales
1. Material para el aislamiento

3. 2. Material para la identificación de Bacillus anthracis y Clostridium tetani
Materiales para aislamiento
Muestra de estiércol:
Bacillus anthracis
Muestra de tierra:
Clostridium tetani
Tubos de ensayo: para
suspensión y tratamiento
de muestras
Pipetas: 1ml Tubos con agua destilada:
para suspensión de ambas
muestras
Placas petri
Vaso con agua helada Asa bacetriologica Jarra de Brewer
Estufa bacteriologica Viales con
agar
nutritivo
Agar Microoscopio compuesto
Agar sangre Agar nutritivo

4. IV. METODOLOGÍA
1. Muestra de tierra
Pesar 10 g. de muestra de tierra y adicionar 90 ml de solución salina fisiológica. Agitar
fuertemente. Dejar reposar y separar el sobrenadante en un tubo estéril
Materiales para Identificación
tinción gram Portaobjetos peróxido de hidrogeno
Medio Sim: para observar movilidad
motilidad
Tubo con medio gelatina Tubo con caldo manitol
Tubo con caldo
arabinosa
Tubo con caldo
glucosa
Tubos con caldo nitrato: para observar
reducción de los nitratos

5. Llevar el tubo a un baño de agua hirviente a 80 °C por 10 minutos. Enfriar bruscamente
en agua fría
Muestra de estiércol y tejidos
Con el estiércol, se prepara igual que con la muestra de tierra, con tejidos, se macera en
mortero o se lava con agua destilada estéril.
2. Asilamiento y evaluación de crecimiento
• Se toma una asada de las muestras tratadas y se siembra por estría en la
superficie en los medios con agar sangre y agar nutritivo para aislar B. anthracis.

6. • Para el caso de C. tetani se usa caldo Robertson para enriquecimiento, tomando
0.1 o 0.2 ml del sobrenadante tratado. Luego colocar una capa de parafina
evitando formación de burbujas, se tapa rápidamente.
• Incubar la placa de Agar Nutritivo en aerobiosis y la de agar sangre con atmósfera
de CO2 durante 24 y el tubo con medio Robertson en Jarra de Brewer durante 72
horas.
• Observar las colonias de B. anthracis anotar sus características: irregulares, de 2
a 4 mm de diámetro, filamentosas ("cabellera de medusa"), rugosas con tendencia
a presentarse en forma de coma. En agar sangre, las colonias no son hemolíticas
• Realizar la tinción de Gram de las colonias características para observar la
morfología bacilar y la reacción al Gram: Los bacilos grandes de extremos rectos
cadenas enmarañadas, Gram positivos, endospora circular de posición central
corresponden a B. anthracis.

7. • Transferir una porción de la colonia examinada a un vial o tubo con Agar Nutritivo
y sembrar en la superficie inclinada, incubar a 35°C durante 24 horas, se confirma
con tinción de Gram la bacteria, se ha obtenido el cultivo puro o cepa.
• La tinción de Gram del medio Robertson después de 72 horas de incubación,
demuestra la presencia de bacilos delgados con espora circular, terminal, Gram
positivos.
• Sembrar el cultivo en una placa con agar Clostridium. Incubar en anaerobiosis por
24 horas.
• Al cabo de ese tiempo hacer la descripción de la colonia característica y con aguja
bacteriológica transferirla a un vial o tubo que contiene el medio sin inclinar y
utilizando la técnica de puntura se siembra hasta el fondo del tubo. Tapar y sellar
el vial, incubar por 24 horas en anaerobiosis. y evaluación de crecimiento

8. 3. Tinción gram de ambas cepas
Clostridium tetani Bacillus anthracis
En cultivos frescos los bacilos se tiñen
de azul, pero, tras 24 horas de
crecimiento, tienden a perder la
coloración de Gram y aparecen teñidos
de rojo, su tamaño está entre 0,3-2 x
1,5-20 micras.
-Gram 24 horas: bacilos Gram positivos, de 1 a 1,3 mm
de diámetro por 3 a 10 mm de largo, con bordes
cuadrados o cóncavos que forman cadenas largas con
la apariencia de vara de bambú.
-Gram 48 horas: bacilos Gram positivos con esporas de
forma elipsoidal en posición subterminal que no
deforman el bacilo.
4. Identificación de especies
❖ Prueba de catalasa.
o Sobre una lámina porta objetos limpia colocar una gota de agua oxigenada
o Añadir una porción de cultivo con un asa
o Observar la reacción.
Si la bacteria produce la enzima catalasa,
se observa un burbujeo característico, por
descomposición del peróxido.

9. ❖ Prueba de hemolisis
o Se realiza una siembra del cultivo puro mediante la técnica del
agotamiento de asa en una placa de agar sangre.
o Incubación por 24 horas
o Ver los resultados
❖ Fermentación de carbohidratos
Fermentación de glucosa
o Se prepara el medio en un tubo con: Peptona 10 g, NaCl 5 g, Agua
destilada 1000 ml
o Se añadió como indicador el Púrpura de bromocresol solución alcohólica al
1% 2,5 ml
o Y el carbohidrato lactosa (2 g)
o Con un asa bacteriológica estéril, transferir un inóculo denso del cultivo a un
tubo con el medio
o Incubar a 37°C durante 24 horas
o Observar resultados
Positivo + Negativo-
El medio presenta
una reacción de
hemolisis parcial o
total con coloración
verde
No cambia el
medio, sin
coloración
Positivo + Negativo-
Es capaz de
fermentar un
carbohidrato
particular por la
producción ácidos
que reaccionan con
el Bromocresol,
cambiando a
amarillo
El medio no
produce ácidos,
por lo que no
cambia de color

10. Fermentación de manitol
o Con un asa bacteriológica estéril, transferir un inóculo denso del cultivo a un tubo
con caldo manitol
o Incubar dentro de la jarra Brequer a 37°C durante 24 horas (anaerobiosis)
o Observar resultados
Fermentación de arabinosa
o Sembrar la cepa en un tubo con caldo arginina.
o Incubar de 35 °C durante 24 h
o Observar resultados
❖ Prueba reducción de nitratos
o En un Caldo nutritivo agregar
un inoculo del cultivo
o Incubar a 37°c en jarra Brequer
(medio anaeróbico)
o Agregar 1 gota de ácido
sulfanílico
Positivo + Negativo-
El medio se torna
color amarillo
Fermentación del
manitol
El medio se queda
igual (rojo).
Positivo + Negativo-
Rojo intenso-
grosella, por
alcalinización del
grupo carboxilo
Amarillo negativo
por acidificación

11. o Agregar 1 gota de α naptilamina
Si no cambia de color agregar
o Agregar zinc
o Interpretar los resultados
❖ Prueba de hidrolisis de gelatina
o Sembrar la muestra en agar con gelatina.
o Incubar a 37°C por 24 h
o Refrigeración por 3 h
o Interpretar los resultados
V. RESULTADOS
1. Morfología de colonias y morfología en Tinción Gram
a. Bacillus anthracis
o Se observan colonias de 2 a 5 µm de diámetro de color blanco, planas
convexas, los bordes son irregulares, ligeramente ondulados.
Positivo + Negativo-
Rojo al añadir los 2
primeros reactivos
El medio se queda
igual. Luego del
polvo de zinc
cambia a rojo
Positivo + Negativo-
La gelatina se
mantiene
liquida al
sacarla
La gelatina se
solidifica

12. o No se observa hemólisis a diferencia de B. cereus y B. thuringiensis que
son betahemolíticos.
o Al microscopio se observan como bacilos rectos grampositivos dispuestos
en cadenas largas
Características morfológicas de Bacillus anthracis.
-Gram 24 horas: bacilos Gram positivos, de 1 a 1,3 mm de diámetro por 3 a 10 mm de
largo, con bordes cuadrados o cóncavos que forman cadenas largas con la apariencia de
vara de bambú, y formación de cabezas apariencia de medusas
Borde Ondulado- Irregular
Forma Circular
Superficie
Rugosa, brillante,
cremosa, superficial.
Elevación Plana
Color Blanco
Colonias de Bacillus
anthracis

13. -Gram 48 horas: bacilos Gram positivos con esporas de forma elipsoidal en posición
subterminal que no deforman el bacilo.
b. Clostridium Tetani
o El examen microscópico del caldo RCM utilizando la tinción de Gram
mostró bacilos grampositivos con esporas abultadas terminales redondas
o La incubación adicional del caldo RCM mostró actividad proteolítica, y el
cultivo anaeróbico en agar sangre, mostró una fina película transparente
de crecimiento con enjambre típico de Clostridium tetani
Características morfológicas de Clostridium tetani.
Borde Ondulado
Forma Circular
Superficie Rugosa, brillante,
cremosa, superficial.
Elevación Plana
Color gris
Figura: Frotis de tinción de Gram
que muestra una baqueta.
Figura: Agar sangre que muestra
la formación de colonias

14. 2. Pruebas de identificación para Bacillus anthracis y Clostridium tetani
➢ Bacillus anthracis
Prueba Manual determinativo
de Bergey
Microbiología. E. P (
(Barriga Angulo &
Giono Cerezo, 2001)
Movilidad (-) (-)
Catalasa (+) (+)
Hemolisis (-) Arborescente
Ácido de glucosa (+) (+)
Manitol (-) (-)
Arabinosa (-) (-)
Nitratos (+) (+)
Gelatina (+) (+)
Interpretación: Los resultados de la caracterización bioquímica de la cepa
Bacillus anthracis presentada en el manual de Bergey, no presenta diferencias con los
resultados de las pruebas actuales siendo que: Negativo para las pruebas de fermentación
de manitol y arabinosas, al igual que de movilidad y no presentar hemolisis en agar
sangre.
➢ Clostridium tetani
Prueba Manual determinativo
de Bergey
Comparación
cinética y bioquímica
de tres cepas de
Clostridium tetani
(Gutiérrez et al., 2018)
Catalasa (-) (+)
Hemolisis (+) (+)
Ácido de glucosa (-) (-)
Manitol (-) (-)
Arabinosa (-) (-)
Nitratos (-) (-)

15. Interpretación: Los resultados de la caracterización bioquímica de la cepa
Clostridium tetani presentada en el manual de Bergey, no presenta diferencias con los
resultados de las pruebas actuales siendo que: Negativo en las pruebas de catalasa,
manitol y arabinosa, al igual que de movilidad, además de presentar hemolisis total en
agar sangre. Gutiérrez et al., 2018)
VI. CONCLUSIONES
• Se pudo aislar y cultivar las bacterias B. anthracis y C. tetani a partir de las
muestras de tierra y estiércol respectivamente; además se reconoció sus
características morfológicas y coloniales de ambos organismos, en C. tetani son
bacilos con forma rectangular, colonias rugosas de color gris plana, de aspecto
de cabezas de medusas; por otro lado B. anthracis son bacilos con esporas de
forma circular, colonias de color grisáceo con borde entero y una hemolisis
completa.
• Se puedo identificar a B. anthracis y C. tetania través de las pruebas bioquímicas,
resultando en que, B. anthracis no presenta movilidad, sintetiza la enzima catalasa, no
es capaz de producir hemolisis, y es capaz reducir los nitratos a nitritos; al contrario de
C. tetania que no es capaz de sintetizar la enzima catalasa, presentar una hemolisis total
y, no reducir los nitratos.
VII. Referencias
Barriga Angulo, G., & Giono Cerezo, S. (2001). Microbiología, epidemiología, manifestaciones
clínicas,diagnóstico, prevención y tratamiento. Centro Médico Nacional La Raza,
MEXICO. Obtenido de https://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2001/pt014c.pdf
Gutiérrez-Rojas, I., Godoy Silva, R., Granados, J., & Poutou Piñales, R. (2008). COMPARACIÓN
CINÉTICA Y BIOQUÍMICA DE TRES CEPAS DE Clostridium tetani, PARA LA PRODUCCIÓN
DE TOXINA TETÁNICA. Pontificia Universidad JAVERIANA, 13(2), 109-117. Obtenido de
http://www.scielo.org.co/pdf/unsc/v13n2/v13n2a02.pdf
S. BREED, R., MURRAY, E., & R. SMITH, N. (1957). BERGEY'S MANUALS OF DETERMINATIVE
BACTERIOLOGY (SEVENTH EDITION ed.).

16. VIII. Anexos
1. ¿Qué características le permite diferenciar a B. anthracis de B. subtilis y C. tetani de C.
botulinum?
B. anthracis B. subtilis C. tetani C. botulinum
Considerado
patógeno
No considerado
patógeno
Espora esférica
terminal
Espora esférica
subterminal
deformante
Bacilos extremos
rectos
Bacilo delgado de
extremos romos
Colonias blancas,
irregulares
Colonias grises,
regular lisas
Sin movilidad Móvil por flagelos
perítrico
Presenta halo de
hemolisis
No presenta halo de
hemolisis
Espora terminal Espora central
2. ¿Del conjunto de pruebas para la identificación, ¿cuál de ellas utilizaría para diferenciar
a B. anthracis de B. subtilis y a C. tetani de C. botulinum?
B. anthracis B. subtilis C. tetani C. botulinum
Beta hemolisis (-) Beta hemolisis (+) Prueba indol (+) Prueba indol (-)
Oxidasa (-) Oxidasa (+) Fermentación de
azucares (-)
Fermentación de
azucares (+)
Sensible a la
penicilina
No sensible a la
penicilina
Prueba de Voges
Proskauer (-)
Prueba de Voges
Proskauer (+)
Hidrólisis de la
gelatina-
Hidrólisis de la
gelatina+