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1. Aislamiento de Vibrio cholerae
• Materiales y aparatos
 Homogeneizador mecánico: mínimo 8000 r.p.m. –
máximo 45 000 r.p.m.
 Vasos homogeneizadores (1L) con tapa, resistente
a temperatura de autoclave, un recipiente por
muestra.
 Balanza: 2500 gr capacidad y 0.1 gr de
sensibilidad.

2. Aislamiento de Vibrio cholerae
 Utensilios: cuchillos, tenedores, pinzas, tijeras,
cucharas y espátulas (previamente esterilizados).
 Estufa 35 – 37°C
 Estufa u horno de desecación para secar placas.
 Baño de agua a 44-46°C (para mantener fluido el
agar).
 Recipientes de vidrio con tapa rosca (500 mL).

3. Aislamiento de Vibrio cholerae
 Aguja de inoculación y asa de 5 mm,
preferiblemente de alambre de nicrom o platino-
iridio.
 Placas Petri de 100 x 15 mm o de plástico de 90 x
15 mm.
 Portaobjetos para microscopio.
 Microscopio con condensador de campo oscuro.
 Frigorífico a 3-5 °C.

4. Aislamiento de Vibrio cholerae
 Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa
(Medio 114), para placas.
 Agar de Aronson, para placas.
 Agar nutritivo, para la preparación de agar de
Aronson y para agr inclinado en tubos.
 Agar taurocolato tripticasa telurito gelatina, para
placas.

5. Aislamiento de Vibrio cholerae
 Agua de peptona alcalina, a granel y distribuida en
tubos de 150 x 15 mm, 10 mL en cada uno.
 Agar gelatina.

6. Aislamiento de Vibrio cholerae: Técnica
• Pesar 25 gr de muestra en recipientes tarados.
Cortarla en trozos pequeños con unas tijeras.
• Añadir 225 ml de agua de peptona alcalina y mezclar
cuidadosamente.
• Incubar la suspensión a 35 – 37 °C durante 6 horas
(rango 4 – 8 hrs).

7. Aislamiento de Vibrio cholerae: Técnica
• Preparar placas secas de agar tiosulfato citrato sales
biliares sacarosa y de un agar no selectivo como el
agar nutritivo, el agar de Aronson o el agar
taurocolato tripticasa telurito gelatina.
• Pasar un asa de 5 mm de la suspensión en caldo a la
superficie de cada uno de los medios sólidos y
sembrar en estría, de tal manera que puedan
desarrollarse colonias aisladas.

8. Aislamiento de Vibrio cholerae: Técnica
• Incubar las placas durante 18 – 24 hrs a 35 – 37 °C
• Resembrar con un asa a partir del cultivo de 6 horas
en agua de peptona alcalina en un nuevo tubo de 10
ml de agua de peptona alcalina, incubando el tubo
durante 6 horas.
• Pasar un asa de 5 mm de la suspensión en caldo del
apartado anterior a la superficie de dos placas de dos
medios sólidos e incubar 18-24 hrs a 35-37°C.
• Examinar el cultivo de 6 hrs en agua de peptona
alcalina para observación de la motilidad típica (en
gota pendiente o lámina húmeda) en el microscopio.

9. Aislamiento de Vibrio cholerae: Técnica
• Reincubar el cultivo en agua de peptona alcalina una
noche a 35 – 37 °C; resembrar en dos placas de
medios sólidos distintos, como se indicó en el
apartado anterior e incubar estas placas durante 18 –
24 hrs a 35 – 37°C.
• Resembrar tres o más colonias típicas de cada una
de las placas en agar nutritivo inclinado.

10. Aislamiento de Vibrio cholerae: Observación de
colonias
Microorganismos Aspecto
V. cholerae
Colonias amarillas de tamaño medio (2-3
mm de diámetro).
V. Alginolyticus Colonias amarillas, grandes.
V. parahaemolyticus Colonias azul intenso-verde, grandes.
Pseudomonas
Ausencia de crecimiento o colonias
incoloras o verde pálido, pequeñas.
Coliformes Ausencia de crecimiento.
Proteus
Ausencia de crecimiento o colonias
amarillas o verdosas, pequeñas.
Aeromonas (la mayoría de las cepas) Ausencia de crecimiento
Enterococos Colonias pequeñas, blanco-amarillentas.
Tabla 01. Aspecto de las colonias de V. cholerae y otros organismos entéricos en
agar TCBS (a) después de incubación durante una noche a 37 °C (b)
(a) Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa: Medio 114.
(b) De Furniss y Donovan (1974)

11. Aislamiento de Vibrio cholerae: Observación de
colonias
 Las colonias típicas de V. cholerae en agar
tiosulfato citrato sales biliares sacarosa son
grandes (2-3 mm), lisas, amarillas y ligeramente
aplanadas, con el centro, con el centro opaco y la
periferia translúcida.
 Las colonias típicas de V. cholerae en agar gelatina
son transparentes y presentan una zona turbia
característica, que se hace más evidente después
de unos minutos en el frigorífico.

12. Aislamiento de Vibrio cholerae: Observación de
colonias
 Las colonias típicas de V. cholerae en agar de
Aronson son 2-3 mm de diámetro, lisas,
translúcidas y en forma de bóveda baja con centro
rosa o rojo y periferia sin color. Después de un
tiempo mayor de incubación, las colonias se
vuelven de un tono rojo fuerte uniforme.
 Las colonias típicas de V. cholerae en agar nutritivo
son grandes, translúcidas y grisáceas. La mayoría
de los microorganismos entéricos, tales como
Escherichia coli, forman en este medio de colonias
opacas.

13. Aislamiento de Vibrio cholerae: Observación de
colonias
Figura 01. Vibrio cholerae en
medio TCBS
Figura 02. Vibrio cholerae en agar
gelatina

14. Aislamiento de Vibrio cholerae: Observación de
colonias
Figura 03. Vibrio cholerae en
medio agar nutritivo

15. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae
• Material y aparatos
 Aguja de inoculación y asa de alambre de nicrom o
de platino-iridio.
 Agar triple azúcar hierro, inclinado, en tubos con
columna de medio de 25-30 mm.
 Pipetas de 1 ml.
 Agar nutritivo para placas y tubos inclinados.
 Agar gelatina.

16. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae
 Caldo de peptona azúcar (1% de azúcar), tubos
para cada uno de los siguientes azúcares: glucosa,
sacarosa, arabinosa, manosa, manitol e inositol. En
cada tubo 3 ml, con viales invertidos.
 Medio para la prueba de la descarboxilasa, grupos
de tubos con 1% de L-lisina, 1% de L-araginosa,
1% de L-ornitina, así como medio base para
control.
 Medio de Hugh-Leifson, 7-10 ml en cada tubo.

17. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae
 Solución de desoxicolato sódico, para la prueba de
formación de filamentos.
 Dihidrocloruro de tetrametil-parafenileno-diamina
(para la prueba de oxidasa).
 Agente vibriostático O/129.
 Aceite mineral estéril.

18. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Reacción en agar triple azúcar hierro
• Técnica:
 Incubar 24 hrs a 35–37°C, cada cultivo que se
considere sospechoso en tubos con agar triple
azúcar hierro inclinado, sembrando por picadura en
la columna del medio y por estría en columna
inclinada.
 La prueba para Vibrio cholerae en este medio
resulta con la columna del medio amarilla (ácida) y
la parte inclinada también amarilla (ácida): A/A.

19. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Reacción en agar triple azúcar hierro
Figura 04. Prueba de TSI para Vibrio cholerae; (a1) Agar
hierro de Kigler (a2)(b) Agar TSI; A/A, sin producción de gas.
(a1) (b)
(a2)

20. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Fermentación en medio Hugh-Leifson
 Inocular por siembra en picadura profunda dos
tubos del medio Hugh-Leifson con un asa recta.
Cubrir un tubo con parafina fundida (1cm). Incubar
los tubos durante 24 hrs a 35-37°C.
 La producción de ácido amarillo en ambos tubos es
indicativo de fermentación. La producción de ácido
en la parte superior del tubo sin parafina unido a la
falta de crecimiento en el otro tubo es indicativo de
oxidación.

21. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Fermentación en medio Hugh-Leifson
Figura 05. Prueba de fermentación en medio Hugh-Leifson
para Vibrio cholerae

22. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de oxidasa
 Esta prueba diferencia a los miembros de la familia
Enterobacteriaceae de V. cholerae; son negativos y
positivos respectivamente. También Pseudomonas es
positivo.
 Se toma una colonia (no debe cogerse colonias de
medio TCBS) que puede haber sido aislado en agar
infusión de corazón (HIA), colocan dos o tres gotas del
reactivo de oxidasa sobre un pedazo de papel filtro en
una caja de Petri. Se extiende el cultivo sobre el papel
húmedo con una asa que no sea de nicrom. En una
reacción positiva, el cultivo bacteriano se toma morado
05 curo en 10 segundos

23. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de oxidasa
Figura 06. Prueba de oxidasa para Vibrio cholerae

24. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Fermentación de carbohidratos
 Inocular ligeramente, a partir de un cultivo de agar
nutritivo de 24 hrs, tubos con caldo de peptona
azucarado hechos con glucosa, sacarosa,
arabinosa, manosa, manitol e inositol; incubar a 35-
37°C y examinar diariamente durante 4-5 días.
 La aparición de un color rojo en el medio de cultivo
es indicador de producción de ácido, exclusivo para
V. cholerae.

25. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Fermentación de carbohidratos
Figura 07. Prueba de fermentación de carbohidratos para
Vibrio cholerae

26. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de descarboxilasa
 Inocular ligeramente los medios con cada uno de
los tres aminoácidos, así como el medio control, a
partir de un cultivo con agar nutritivo inclinado de
24 hrs.
 Después de inocularse a cada tubo se coloca 10
mm de aceite mineral estéril, incluido el control.
Incubar a 35-37°C y observar diariamente por 4
días.
 El medio se volverá púrpura o rojizo (alcalino) si es
positivo y amarillo (ácido) si es negativo.

27. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de descarboxilasa
Figura 08. Reacciones de descarboxilasa para V. cholerae; de
izquierda a derecha: lisina (+), arginina (-), ornitina (+) y testigo (-).

28. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de filamentosidad
 Es prueba exclusiva para V. cholerae.
 Elegir una colonia grande a partir de un cultivo en
agar en placa o a partir del crecimiento en un agar
inclinado, y emulsificarla sobre un portaobjetos con
ayuda de un asa fría en una gota grande de
suspensión acuosa al 0.5% de desoxicolato sódico.
 En 60 segundos se formará una masa mucoide,
material que forma hilos al ser elevada el asa del
portaobjetos.

29. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Prueba de filamentosidad
Figura 09. Prueba de filamentosidad para V. cholerae.

30. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Test vibriostático
 Extender por estría en toda la placa un cultivo de
24 hrs en agar nutritivo y colocar un disco seco de
papel filtro impregnado con el agente vibriostático
O/129, sobre el cultivo extendido, e incubar la placa
durante 24 hrs a 35 – 37 °C.
 Vibrio cholerae es sensible a este agente y no
crecerá en el área que rodea al disco.

31. Pruebas bioquímicas y confirmación de V.
cholerae: Test vibriostático
Figura 10. Reacciones de descarboxilasa para V. cholerae;
de izquierda a derecha: lisina (+), ornitina (+) y testigo (-).