PRESENTACION CELULAS Y ENSAYOS CELULARES.pptx

Obtención
• Se le llama cultivo primario a la etapa comprendida
entre el aislamiento celular y el primer subcultivo.
• ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DEL Obtención de la muestra
1. Disección del tejido
2. Disgregación
3. Sembrado en un recipiente de cultivo
Gloria Leticia Barrera Pacheco 2
EXPLANTE
Nohra, D., & Beltrán, E. (s/f). Uam.mx. Recuperado el 27 de septiembre de 2023, de https://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/15Tecnicas_de_Cultivos_Celulares_e_Ingenieria_de_Tejidos.pdf
Cultivos celulares. (n.d.). Slideshare.Net. Retrieved September 26, 2023,
from https://www.slideshare.net/munevarjuan/cultivos-celulares

Obtención
REQUISITOS
a) Remover tejido necrótico y graso.
b) Cortar finamente con instrumentos especiales
(causando el daño mínimo).
c) Después de su uso, las proteasas deben eliminarse
con centrifugación gentil.
d) La concentración celular debe ser mucho mayor
que la normalmente usada para subcultivo (porque
muchas de ellas no sobrevivirán el proceso).
e) Es preferible utilizar un medio rico, como el F12, a
un medio simple, como el MEM. Si se requiere suero,
es mejor usar el SFB.
f) Los tejidos embrionarios son más fáciles de
disgregar y proliferan más rápidamente que los
adultos.

Obtención
La técnica a seguir consiste en incubar el
tejido con tripsina a 37° C por hasta 30 min,
o bien, pre-incubar a 4° C por 6-18 h (para
permitir su difusión en el tejido) y luego a
37° C por 20 min.
En muchas ocasiones, la disgregación
enzimática requiere combinarse con
métodos mecánicos

Obtención
También conocidas como líneas celulares
continuas.
• Activación de oncogenes
• Pueden aparecer a partir de la semana 14 de
cultivo
• Los cambios genéticos implican:
• Sobreexpresión de la telomerasa
• Eliminación o mutacion del gen P53

Metodología para la
preservación
• Siembra
• Confluencia
• Subcultivo
• Criopreservación

Aspectos
relevantes de la
siembra
• Recipiente a utilizar
• Placa multipozos
• Caja Petri
• Frascos
• *Roller bottles
• Tipo de cultivo
• Adherente
• No adherente
• Tipo de medio a emplear

Confluencia
• Recipiente a utilizar
• Placa multipozos
• Caja Petri
• Frascos
• *Roller bottles
• Tipo de cultivo
• Adherente
• No adherente
Nohra, D., & Beltrán, E. (s/f). Uam.mx. Recuperado el 27 de septiembre
de 2023, de
https://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/15Tecnicas_de_Cultiv
os_Celulares_e_Ingenieria_de_Tejidos.pdf
Conceptos básicos de cultivo celular: equipos, fundamentos y
protocolos. (s/f). News-courier.com. Recuperado el 26 de septiembre
de 2023, de https://www.news-courier.com/cell-science/articles/

Subcultivos
<<Tripsinización>> (Cultivos adherentes)
• Propagación en suspensión
• Estandarización de las condiciones de
cultivo
• Uso de antibióticos
De células, C. (2022, enero 14). Subcultivo de células adherentes. Cultivo
de células. https://cellculture.altervista.org/subculture-of-adherent-
monolayered-cells/

Criopreservación
Protocolo de criopreservación
1. Crear una solución celular tal como la que se
hace en un pasaje celular
2. Centrifugar, resuspender pelet en medio
fresco
3. Agregar DMSO
4. Almacenar en Mr Frosty y refrigerar
¿Cómo se utiliza actualmente la criopreservación? (s/f). Tomorrow.bio.
Recuperado el 26 de septiembre de 2023, de
https://www.tomorrow.bio/es/post/usos-actuales-criopreservacion

Ventajas y desventajas
• Cuidados
• Aplicaciones

Cultivos celulares. (n.d.). Slideshare.Net. Retrieved September 26, 2023,
from https://www.slideshare.net/munevarjuan/cultivos-celulares

Ensayos celulares
• Ensayo de túnel
• Ensayo de micronúcleos
• Ensayo XTT
• Ensayo WST-I
• Prueba de fluorecencia Azul de Alamar

Ensayo de Terminal transferase dUTP Nick-
End Labeling (TUNEL)
• Técnica basada en la adición enzimática de nucleótidos marcados fluorescentemente
en los puntos de rotura del ADN (ssDNA o dsDNA).
• La enzima que cataliza la reacción es una transferasa terminal (TdT) que transfiere el
nucleótido conjugado con el fluorocromo en los extremos 3'OH del ADN generados
como consecuencia de roturas en el ADN.
• Estas roturas pueden tener su origen tanto en la acción de otras enzimas, como
nucleasas o topoisomerasas, como en la acción de radicales libres, como el ion
superóxido (02), el radical hidroxilo (OH), alcoxilo (RO.), peroxilo (ROO.) y el óxido de
nitrógeno (NO.).
• La intensidad de fluorescencia depende de la mayor o menor presencia de roturas en
el ADN de cada célula afectada. Evalua viabilidad celular.
Se evalúa a 465 nm la fluoresceína (Verde) para núcleos con DNA dañado. Se acompaña
con tinción DAPI (Azul) para núcleos sanos. Con un microscopio óptico de fluorescencia.
Themes, U. F. O. (2021, abril 6). Chapter 19 – DNA Damage: TdT-Mediated dUTP
Nick-End-Labelling Assay. Basicmedical Key.
https://basicmedicalkey.com/chapter-19-dna-damage-tdt-mediated-dutp-nick-
end-labelling-assay/
Peiró, M. P. P. A., & de Doctor por la, P. A. al G. (s/f). CARACTERIZACIÓN MÚLTIPLE DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO EN PACIENTES INFÉRTILES. Uab.cat. Recuperado el 27 de septiembre de 2023, de
https://ddd.uab.cat/pub/tesis/2013/hdl_10803_117677/agp1de1.pdf
Martín Piedra, M. Á., Garzón Bello, I. J., Sánchez-Quevedo, M. C., & Alaminos
Mingorance, M. (2012). Evaluación de la viabilidad celular y patrones apoptóticos en
células madre aisladas de la pulpa dental humana.

Ensayo de micronúcleos
Zalacain, M., Sierrasesúmaga, L., Patiño, A., & Zalacain Díez, M. (s/f). The cytogenetic assay as a measure of genetic instability induced by genotoxic agents. Isciii.es. Recuperado el 27 de septiembre de 2023, de https://scielo.isciii.es/pdf/asisna/v28n2/revision2.pdf
• Ensayo capaz de detectar indirectamente rotura o pérdida
cromosómica.
• Se basa en los principios de la mitosis.
• Realizada em células de alta actividad mitótica.
• Consiste en contabilizar la cantidad de segmentos de DNA presentes
en la fase telofásica.
<<Se requiere inhibir la fase citoquinética por lo que se realiza en
presencia de citocalasina-B, proteína que inhibe la polimerización de
actina>>

Ensayo XTT
La prueba se fundamenta en la reducción de sal de
tetrazolium XTT por células viables en presencia de un
reactivo de unión a electrones.
• Se basa en la conversión de la sal de tetrazolium XTT
amarilla hasta producir el formazán una tinción de
color anaranjada por la actividad metabólica de las
células, por consiguiente, esta conversión solo
ocurre en células viables.
• EL formazán es soluble en solución acuosa y es
directamente cuantificado a 450 nm por
fotoespectrometría.
Domínguez, Á., Criollo-Gómez, W., & Domínguez, A. (2012). Standardization of a protocol to irradiate cell cultures with low level laser. Edu.co. https://bibliotecadigital.univalle.edu.co/server/api/core/bitstreams/44a141dd-1874-4500-85a9-bd0dfaaded07/content

Ensayo WST-I
Protocol Guide: WST-1 Assay for Cell Proliferation and Viability. (s/f). Sigmaaldrich.com. Recuperado el 27 de septiembre de 2023, de https://www.sigmaaldrich.com/MX/es/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/cell-
proliferation-reagent-wst-1
• Da una estimación de la viabilidad celular. Se basa
en la reducción de las sales de tetrazolium.
• Las sales de tetrazolio son hidrolizadas para formar
formazán por medio del sistema de la succinato-
tetrazolio reductasa, que pertenece a la cadena
respiratoria de las mitocondrias, y está activo sólo
en las células metabólicamente intactas.
• Medir de 420 – 480 nm.

Prueba de fluorecencia Azul de Alamar
Es un ensayo que permite estimar la proliferación celular.
Solución basada en resazurina y lista para su uso que funciona
como indicador de salud celular mediante el uso de la potencia
reductora de las células vivas para medir cuantitativamente la
viabilidad por medio de la actividad metabólica de las mismas.
Este cambio de color y aumento de la fluorescencia se pueden
detectar mediante absorbencia (detectada a 570 y 600 nm) o
fluorescencia (utilizando una excitación entre 530–560 y una
emisión a 590 nm).
Las características incluyen:
• Rendimiento sólido y fiable, que se traduce en un amplio
rango dinámico altamente reproducible
• Reactivo altamente sensible con una respuesta lineal; detecta
hasta 50 células por pocillo
• Formato práctico de adición y lectura: sin mezcla, ni lavado, ni
lisis celular
• Compatible con instrumentos basados en fluorescencia o
absorbencia
Reactivo de viabilidad de células alamarBlueTM. (s/f). Thermofisher.com. Recuperado el 27 de septiembre de 2023, de https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/DAL1025

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