FIJADORES.ppt

1. FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto preservar las células y conservarlas, hasta donde sea
posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un
método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la
estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que
permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de
identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.
Fijación de la muestra.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan
para tal fin.

3. Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los
fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las
capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su
observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después
de ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

4. FIJACION DE LA MUESTRA

5. Clases de fijadores
Existen muchas clases de sustancias fijadoras. Una clasificación de los diferentes
tipos de fijadores es la propuesta por Backer (1960):
Aldehidos. Son algunos ejemplos: el paraformaldehido, el glutaraldehido, la
acroleina y el glioxilato
Agentes oxidantes. Los más utilizados: el tetróxido de osmio, el permanganato
potásico y el dicromato potásico.
Agentes desnaturalizantes de proteinas. Algunos ejemplos: el ácido acético, el
alcohol metílico y el alcohol etílico
Fijadores que actúan por mecanismos poco conocidos. Pertenecen a este grupo el
ácido pícrico y el cloruro de mercurio.

6. Cómo se elige un fijador
La decisión de emplear un fijador u otro es siempre función del tipo de estudio
histológico que deba realizarse. Existen soluciones fijadoras que son más
adecuadas que otras para cada tipo de procesamiento y estudio. Distinguimos
entonces:
Fijación para microscopía óptica
Fijación para microscopía electrónica
Fijación para estudios topográficos o morfológicos
Fijación para demostración de productos específicos
Fijación para estudios histoquímicos
Fijación para estudios inmunocitoquímicos
Los métodos físicos de fijación más empleados son:
Fijación por calor
Fijación por microondas

7. Forma de actuar de los fijadores
Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin
combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones
químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose
en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente
fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la
coloración ulterior de los tejidos (en su mayoría, son reductores que muchos
colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de
hidrógeno con su cromóforo).

8. Fijadores químicos
Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola
sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias
sustancias intervienen en su constitución.
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos
en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar
órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.

9. FIJADORES COMPUESTOS:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples
racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o
atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.

10. FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.

11. Los métodos químicos de fijación más empleados son:
Fijación por inmersión. Este método consiste en tomar o extraer una muestra del
tejido u órgano que se vaya a procesar y sumergirlo en una solución fijadora.
Normalmente, se introduce la pieza de tejido en un frasco que contiene la cantidad
adecuada de fijador.
Fijación por vapores. Este método consiste en exponer la muestra que se
pretenda fijar a la acción de los vapores del fijador.
Fijación por perfusión. Este método consiste en realizar una perfusión de la
solución fijadora utilizando el torrente vascular. Es el método empleado
normalmente con animales de experimentación en los que se practica una
perfusión cardiaca o aórtica. Con la utilización de este método se consiguen las
mejores fijaciones (y por lo tanto las mejores observaciones histológicas) puesto
que: Se facilita el proceso de penetración del fijador al interior de las muestras. Se
evita la deformación del tejido durante la manipulación de extracción
preservándose mejor la estructura de los tejidos blandos. El proceso de fijación
comienza inmediatamente y se ha comprobado que de esta forma el número de
células picnóticas que se observa en los tejidos es menor que utilizando otros
métodos de fijación. También se ha observado que el número de mitosis observado
es mayor que utilizando otros métodos. Tras la perfusión, usualmente se completa
el proceso de fijación disecando las piezas objeto de estudio y fijándolas
seguidamente por inmersión.
En ocasiones, pueden combinarse los métodos físicos y los químicos ya sea
secuencialmente o simultáneamente. Por ejemplo se puede fijar con microondas
una pieza sumergida en un fijador químico.

12. Propiedades de los fijadores
Mecanismos de Fijación
Los mecanismos de acción de ciertos fijadores son poco conocidos. Es el caso de
los fijadores basados en el uso de sales de mercurio.
La mayor parte de los fijadores establecen entrecruzamientos con proteínas
solubles y estructurales formándose, como consecuencia, un gel que mantiene
una estructuración muy parecida a la observada in vivo
Algunos fijadores interaccionan con los ácidos nucleicos.
Fijación de las proteínas
Formaldehido: entrecruzamiento con aminoácidos externos (especialmente con la
lisina). Reacciones reversibles durante las primeras 24 horas. Preserva bastante
tanto la capacidad antigénica como la actividad enzimática. La morfología suele
ser óptima pero la ultraestructura puede ser deficiente.
Glutaraldehido: formación de polímeros que establecen entrecruzamientos con las
proteínas. Con el paso del tiempo los polímeros se van uniendo entre sí.
Reacciones rápidas e irreversibles. Puede inhibir tanto la actividad enzimática
como la capacidad antigénica. Se obtiene una muy buena preservación
ultraestructural.

13. Factores implicados en la fijación
1. Concentración del fijador
La capacidad de fijación de la solución fijadora que empleemos vendrá determinada
por la concentración del fijador utilizado. A mayor concentración mayor fijación. Sin
embargo conviene elegir la concentración adecuada para impedir que la interacción
del fijador con el tejido (efecto barrera) sea un impedimento para la entrada del
fijador hacia la parte central de la muestra.
Concentraciones muy elevadas del fijador pueden provocar malas fijaciones
El formol comercial (35%) se utiliza normalmente diluyéndolo 10 veces para
preparar la formalina.
El paraformaldehido suele utilizarse en concentraciones del 2 al 4%
El glutaraldehido (que se comercializa al 25%) puede utilizarse a concentración
entre el 0,1 y 2,5 %
2. Tampón y pH
Pueden utilizarse los fijadores en soluciones acuosas, pero para trabajos más finos
es necesario que el vehículo esté tamponado a un pH determinado (en función del
tipo de tejido o de la actividad enzimática que se desea determinar).
La morfología y ultraestructura se mantienen aceptables dentro de un margen de
pH de 6 a 8. Para tejido nervioso se recomienda generalmente un pH de 7.4

14. Tampones más utilizados
El tampón fosfato, el tampón cacodilato, o el tampón veronal
Hay ciertas precauciones que hay que tener en cuenta:
Evitar interacciones entre el fijador y el tampón (Por ejemplo: el tampón tris y los
barbituratos reaccionan con los aldehidos)
Algunos tampones inhiben ciertas actividades enzimáticas mientras que otros las
favorecen (Por ejemplo: el tampón fosfato inhibe la glucosa 6'-fosfato
deshidrogenasa; el tampón trizma-maleato favorece la determinación enzimática de
las fosfatasas)
Temperatura
Para muchos de los estudios que se realizan en Microscopía óptica las fijaciones
suelen realizarse a temperatura ambiente.
Sin embargo, para estudios Histoquímicos o Inmunocitoquímicos o cuando el
objetivo es realizar un estudio en Microscopía electrónica, las fijaciones conviene
realizarlas en nevera a temperatura de 0-4 grados C.
En general, incrementando la temperatura, se acelera el proceso de fijación. Cuando
se utilizan bajas temperaturas, hay que aumentar los tiempos de fijación.

15. Penetración de los Fijadores
Cada fijador tiene un coeficiente de difusión intrínseco que indica el grado de
penetración que posee, expresado en milímetros por hora.
Para facilitar la penetración de los fijadores, se han de retirar todos los obstáculos
que impidan su penetración (Por ejemplo, para fijar el cerebro hay que retirar las
meninges).
Para facilitar la fijación, las muestras se han de trocear en rebanadas lo más
delgadas posibles: Para microscopía óptica, son suficientes rebanadas de 5 mm.
de grosor. Para microscopía electrónica se recomienda que estas rebanadas
tengan un grosor menor a 1 mm.
Volumen
Para asegurarnos buenas fijaciones por inmersión es necesario que el volumen
del fijador exceda en una proporción de 10:1 el volumen de las muestras.
Es conveniente cambiar el fijador una o varias veces a lo largo de la fijación.
Osmolaridad
Es importante ajustar la presión osmótica de la solución fijadora. Si la solución
fijadora es isotónica (340 mOsm) o hipotónica, se produce vacuolización celular. Si
la solución fijadora es muy hipertónica se produce una contracción del tejido con
retracción celular.
Los mejores resultados se consiguen con una solución ligeramente hipertónica de
400 - 450 mOsm.

16. Para ajustar la la osmolaridad de las soluciones fijadoras se recurre a la adición de
determinadas sustancias como: dextranos, polivinilpirrolidona, sucrosa (>5%) o
Cloruro sódico (0,9%)
Tiempo de Fijación
Hay que ajustar cuidadosamente el tiempo de fijación en función del fijador
utilizado, de su concentración, de la temperatura y del objetivo del estudio.
Una fijación excesiva produce efectos adversos como: Retracción del tejido;
endurecimiento excesivo que dificulta la ulterior obtención de cortes; extracción de
algunas moléculas; inhibición de actividades enzimáticas; pérdida de características
antigénicas; y degradación general del tejido por oxidación de las proteínas.

17. Obtención de muestras y proceso histológico
Toda muestra, ya sea procedente de una biopsia, una autopsia, o de un trabajo
experimental (utilizando animales de experimentación) que deba estudiarse en el
laboratorio de Histología debe estar bien identificada desde el principio. Todos los
recipientes que la contengan deben estar convenientemente etiquetados con una
referencia adecuada.
Una vez las muestras han sido convenientemente fijadas se ha de proceder con el
desarrollo del proceso histológico adecuado que permitirá la obtención de cortes.
En función de las técnicas de tinción que se pretendan emplear y del tipo de
estudio que se quiera realizar, las muestras se procesarán de una forma u otra.
En ocasiones (cuando se ha de realizar un diagnóstico rápido de una biopsia, o
cuando la técnica lo requiere) puede ser necesario o conveniente obtener
secciones histológicas sin realizar una fijación previa. En estos casos las muestras
se congelan rápidamente y se cortan con un microtomo de congelación
En términos generales puede decirse que el proceso histológico pretende dar
soporte o endurecer lo suficientemente las muestras para permitir la obtención de
cortes delgados.

18. DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA
Deshidratación
Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están
embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto,
en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos
anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una
deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente.
Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.
Deshidratación en alcoholes sucesivos.
Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración)
Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o
toluol. Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-
lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño
de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol
agregada a unos ml de xilol no debe enturbiarlo.

19. Se dispone una lámina en un cassette de deshidratación.

20. Penetración de la parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida
en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
Penetración de la parafina a 56-58ºC.
Inclusión definitiva o formación del bloque
En moldes de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del
mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las
piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera.
OBTENCIÓN DE CORTES
El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la
reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso
de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran
precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable.
Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.

21. Deshidratación en alcoholes sucesivos.

22. Penetración de la parafina a 56-58ºC.

23. Barras de Leuckart

24. Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de
congelación, y el crióstato o criótomo.
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza
por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos
tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta
a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela.
Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.
Corte en micrótomo tipo Minot.
- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar
de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un
sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca
del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

25. Corte en micrótomo tipo Minot.

26. - Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de
congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en
el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro
de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la
cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un
sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la
cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o
motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia
de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de
congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes
mucho más delgados.

27. COLORACIÓN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración.
Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a
otros cuerpos.
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia
colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar
la solución colorante.
Clasificación de los colorantes:
Según su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):
- Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de
sodio). Son colorantes citoplasmáticos.
- Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o
clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el
núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder
disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante
(Sudán lll, rojo escarlata).

28. CRIOSTATO

29. Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante
empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color
diferente al del colorante empleado.
Métodos de coloración:
- Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para
que la coloración tenga lugar.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto
óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el
resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina
diferenciación.
- Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado
(núcleo, fibras elásticas, etc.).
- Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos
recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que
contrastan por sus colores.
- Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes
neutros que se necesiten.

30. Colorantes más utilizados en histología humana:
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden
ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio,
permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas
hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para
preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante
indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con
tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

31. Batería de Coloración H&E.

32. MONTAJE
Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y
montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en
condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.
La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar
el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere
un índice de refracción semejante al del vidrio.
Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el
mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un
cubreobjeto.
Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio.

33. PROTOCOLO GENERAL
A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para
la técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:
I. Fijación
En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos
durante 6 hs.
II. Corte
Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el
fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.
III. Deshidratación
1) Alcohol 70º, 1h30'.
2) Alcohol 96º, 1h30'.
3) Alcohol 100º (l), 1h30'.
4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.
5) Xilol, entre 1h30' y 3hs.

34. IV. Inclusión
1) Secado de la muestra con gasa.
2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra o bloque.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco
V. Corte

35. VI. Coloración
1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'.
2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.
3) Xilol o toluol (II), 2'.
4) Alcohol 100º, 30".
5) Alcohol 96º, 30".
6) Alcohol 70º, 30".
7) Alcohol 50º, 30".
8) Agua destilada, 30".
9) Hematoxilina, 1´30".
10) Agua corriente, 2´.
11) Alcohol 50º, 15".
12) Eosina, 30".
13) Alcohol 96º, 10".
14) Alcohol 100º, 10".
15) Xilol, 1´ por lo menos.
16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

36. RECOMENDACIONES ÚTILES
- Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si
Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita
dedicarse solo a esa actividad.
- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a
utilizar perfectamente limpios.
- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.
- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.
- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre
tapados.
- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por
estas sustancias.
- Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la
piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.
- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con
los pasajes del material.

37. - Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione
planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.
- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy
importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.
- Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material
de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine
los tiempos, y después comience el proceso.
- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras
experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y
repita tantas veces como sea necesario.