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FISIOLOGÍA
BACTERIANA
CRECIMIENTO
BACTERIANO
La replicación de una bacteria es el resultado de una serie de
procesos metabólicos ordenados y que conducen a la FISIÓN
BINARIA.
Crecimiento bacteriano abarca tres grandes áreas de
estudio:
•El METABOLISMO BACTERIANO, genera el material celular a
partir de nutrientes simples presentes en el medio.
•La REGULACIÓN, coordina centenares de procesos
metabólicos y permite la síntesis coordenada y eficiente de los
componentes y estructuras de las bacterias.
•La DIVISIÓN CELULAR, es la formación de dos células hijas
independientes a partir de una única célula madre.
METABOLISMO
Es la suma de todos los procesos químicos que ocurren
en un organismo.
- Catabolismo: conjunto de procesos químicos celulares
que liberan energía.
- Anabolismo: conjunto de procesos químicos celulares
que utilizan energía.
-Una ruta metabólica es una secuencia de reacciones
químicas intracelulares catalizadas por enzimas.
-Las enzimas son codificadas por los genes.
BACTERIANO
Tiene muchos procesos semejantes a los de las células
eucariotas.
PARTICULARIDADES:
•Metabolismo adaptado para el crecimiento veloz. Es entre 10 y
100 veces más rápido que en células humanas.
•Tienen mayor versatilidad en cuanto al tipo de nutrientes que
puede utilizar para producir energía.
•Mayor versatilidad en la utilización de oxidantes y no están
limitadas al solo uso del oxígeno.
•Gran diversidad de requerimientos nutricionales ya que no
todas poseen todos los caminos biosintéticos. Ayuda para la
identificación.
•Sintetizan macromoléculas por mecanismos menos
engorrosos. Síntesis de Mureína, LPS y Acidos teicoicos son
procesos únicos de las bacterias.
Aerobicas.
Anaerobicas
facultativas.
Anaerobicas estrictas.
COMPLEJIDAD DEL
METABOLISMO BACTERIANO
Por medio de 2000 reacciones metabólicas diferentes la
bacteria puede sintetizarse a si misma y generar la
energía que necesita para procesos como la Motilidad y
Transporte Activo.
REACCIONES METABOLICAS DE LA BACTERIA:
•Reacciones de abastecimiento.
•Reacciones de biosíntesis.
•Reacciones de polimerización.
•Reacciones de ensamblado.
REACCIONES DE
ABASTECIMIENTO
Proveen la energía y los 12 precursores que la bacteria
necesita para las reacciones biosintéicas.
Precursores: Glucosa-6-P, Fructosa-6-P, Pentosa-5-P,
Eritrosa-4-P, triosa-P, 3-Fosfoglicerato, Fosfoenol-
piruvato, Piruvato, Acetil-CoA, alfa-Cetoglutarato,
succinil-CoA y oxalacetato.
CO2 O2 Agua …. Son los únicos nutrientes que entran
por difusión simple a las bacterias.
Los nutrientes utilizan Difusión facilitada y transporte
activo para ingresar.
RESPIRACIÓN
Hidratos de Carbono y otras moléculas: Fuente de
Carbono y Energía.
GLUC
OLISIS
RESPIRACIÓN
(no siempre es
el oxigeno el
aceptor de
electrones.)
FERMENTACIÓN (poco eficiente)
GLUCOSA
Acido Pirívico
AT
P
NAD
H
C.C
Acetil CoA
AT
P
CO2
NAD
H
Electrones-
Cadena Respiratoria
AT
P
O2
H2
O
Acido Pirúvico
o derivado
FERMENTACI
ÓN
Productos finales
de la fermentación:
Ej. Acido láctico.
NAD
H
RESPIRACIÓN
CARACTERISTICAS
- fosforilación oxidativa ( ADP + P - ATP)
- Requieren una cadena de transporte de electrones
- Pueden ocurrir en presencia de oxígeno (respiración aeróbica) o en su ausencia (respiración anaeróbica).
- Tiene como aceptor final de electrones un compuesto inorgánico
RESPIRACION AEROBICA:
- El aceptor de electrones es el oxígeno.
- Utiliza la cadena de transporte de electrones para generar un gradiente de protones imprescindible para que
las ATPsintasas formen ATP.
RESPIRACION ANAEROBICA:
Existen bacterias (por ej. Pseudomonas o bacillus ) que utilizan aceptores de electrones distintos al oxígeno.
Aceptor de electrones: NO3
- (productos: NO2
- N2 N2O)
FERMENTACIÓN
CARACTERÍSTICAS
- fosforilación a nivel de sustrato (citoplasma)
- no necesita cadena de transporte de electrones (CTE)
- utiliza como aceptor final de electrones una molécula orgánica.
- El ATP se forma por donación de ATP de un fosfato de alta energía a partir de un producto intermedio
fosforilado.
REACCIONES DE
BIOSÍNTESIS
A partir de 12 precursores se sintetizan Aminoácidos,
nucleótidos, hidratos de carbono, aminoazúcares,
ácidos grasos y otras moléculas que son unidades
necesarias para la síntesis de macromoléculas.
Además de la fuente de Carbono, las bacterias
necesitan para la biosíntesis: Grandes cantidades de
NADPH, ATP, Nitrógeno amínico y una fuente de
Azufre.
Las moléculas que no pueden ser sintetizadas por una
bacteria, obligatoriamente la obtienen del medio.
SULFONAMIDAS: Inhibe la síntesis de Acido fólico en las bacterias
unirse (IC) a la enzima que sintetiza Ac fólico a partir de PABA
(compuesto
REACCIONES DE
POLIMERIZACIÓN
REPLICACIÓN: Comienza siempre en un mismo sitio oriC.
Síntesis del ADN bidireccional. Adición de nucleótidos en dirección
5’-3’.
TRANSCRIPCIÓN: La diferencia con eucariotas es que todas las
formas de ARN (mensajero, transferencia, ribosomal) son
sintetizados por la misma ARN polimeraza bacteriana. Además no
hay transporte de ARNm porque no hay membrana nuclear.
TRADUCCIÓN: Síntesis de proteínas. Diferencias con eucariotas:
•Inicio de traducción requiere número menor de proteínas.
•ARNm policistrónico: Cada ARNm transcribe más de un gen, por lo
que sintetiza más de una proteína.
•No requiere ni procesamiento ni transporte de ARNm.
•Traducción transcurre simultánea y a igual velocidad que la
transcripción. Alta eficacia del proceso.
•OTRAS moléculas polimerizan (aunque se sintetizan en el citosol)
en la membrana citoplasmática: Peptidoglicano (mureína), LPS,
Fosfolípidos y polisacárido Capsular.
REACCIONES DE
ENSAMBLADO
ESPONTÁNEO: Autoensamblado (Ej: flagelos y
ribosomas)
ESPECIAL: Mediado por mecanismos específicos de
ensamblado guiado (algunas moléculas se sintetizan
en el lugar de ensamblado y otras en el citosol y luego
se ensamblan en su lugar..
DIVISIÓN CELULAR
FISIÓN BINARIA: Al azar se forman dos células hijas de
una célula madre.
Más de 30 genes están involucrados en este proceso.
Muchas bacterias tardan 20 min en replicar su genoma
a 37ºC. Las células hijas heredan cromosomas que ya
están parcialmente replicados.
Complejo sistema de regulación para que se termine un
ciclo de replicación y las células hijas sean ambas
viables.
DESARROLLO DE LAS
BACTERIAS EN CULTIVO
INÓCULO: Introducción de células bacterianas viables en un
medio de cultivo líquido o sobre la superficie de un medio sólido.
CULTIVO: Se llama de esa manera a un conjunto o población de
bacterias que crecen en un medio determinado. Si es homogénea
hablamos de un cultivo puro (población de la misma cepa de la
misma especie).
COLONIAS: Pequeñas masas visibles que forman las bacterias
diseminadas mecánicamente sobre la superficie de un medio
sólido cuando se replican en un tiempo determinado.
CLON: Cuando las bacterias de una colonia derivan de una única
célula.
UFC: Puede estar compuesta por una bacteria o un cúmulo de
bacterias y al crecer sobre medio sólido son capaces de generar
una colonia aislada.
DENSIDAD: Cuando hacemos referencia al contenido de bacterias
en un cultivo líquido.
CURVA DE CRECIMIENTO
BACTERIANO
La curva del crecimiento bacteriano resulta
de la representación gráfica de la
determinación periódica del número de
células viables por mililitro que existen en
un medio líquido inoculado con células
microbianas provenientes de un cultivo que
ha crecido previamente hasta la saturación.
Replicación bacteriana en medio líquido depende de:
•La especie bacteriana.
•La composición del medio de cultivo.
•La temperatura.
TMG: 37ºC entre 30 y 60 min.
106 UFC/ml: Turbidéz
Psicrófilas: Bacterias que crecen a bajas
tº
Termófilas: Bacterias que crecen a altas
tº
Mesófilas: Bacterias que crecen entre
las tº de los otros dos grupos extremos
(casi todos los patógenos del hombre).
FASE DE LATENCIA
FASE EXPONENCIAL
FASE ESTACIONARIA
FASE DE DECLINACIÓN
densidad
FASE DE LATENCIA:
Este primer período del cultivo consiste en la adaptación de
las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase,
las células microbianas se encuentran empobrecidas en
cuanto a enzimas y metabolitos vitales para un óptimo uso
de los nutrientes del medio hasta que alcanzan las
concentraciones necesarias de estos componentes para
reiniciar el crecimiento.
Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio
de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan
diferentes que las células sean genéticamente incapaces de
sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán
subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que
éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento
de células.
FASE LOGARÍTMICA O EXPONENCIAL:
Una vez adaptadas, las bacterias crecen hasta que
alcanzan rápidamente la máxima velocidad de replicación.
La velocidad de replicación es constante y la proporción
de bacterias que mueren es mínima.
Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante,
pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta
de manera exponencial.
Esto continua hasta que uno o más nutrientes se agoten,
o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos
tóxicos que se inhiba el crecimiento. El oxígeno suele ser
el limitante para los organismos aerobios: cuando la
densidad bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml
es necesario aumentar el ingreso de oxígeno mediante
agitación o burbujeo ; pero cuando la concentración
alcanza 4 o 5 x 109 bacterias/ml, la tasa de difusión de
oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un
medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye
progresivamente.
N=No*2r
N: número total de bacterias después de “r”
replicaciones y a partir de un inóculo inicial No
FASE ESTACIONARIA MÁXIMA.
Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio, cambio de
pH o la acumulación de metabolitos tóxicos, el ritmo de
crecimiento disminuye y se alcanza una fase estacionaria
de crecimiento.
Las bacterias se adaptan a las nuevas condiciones del
medio y el ritmo de crecimiento ahora equivale al de muerte
bacteriana.
Debemos considerar que, para una célula microbiana,
muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para
reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba
cuando una célula es incapaz de producir una colonia en
cualquier medio. Entonces, designar a una célula
microbiana como muerta no implica su destrucción física.
La duración de esta fase depende de la naturaleza del
microorganismo y de las condiciones del medio.
FASE DE DECLINACIÓN:
Esta fase, también conocida como fase de muerte,
representa el deterioro y disminución de la densidad de
células vivas debido al aumento progresivo de la tasa de
mortalidad, la que tarde o temprano alcanza un valor
sostenido.
Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha
muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente,
por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden
persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia
puede deberse a que las células consiguen crecer
gracias a los nutrientes liberados por las células que
mueren y se lisan, observándose recambio celular.
REGULACIÓN Y
ADAPTACIÓN
Reacciones metabólicas: Forma coordinada.
Para adaptar su metabolismo a las condiciones del medio: Sistemas de
Regulación
•Control de la actividad enzimática (enzimas alostéricas).
•Control de la expresión génica (modifican la cantidad de diferentes
enzimas que contienen). Ocurre generalmente al comienzo de la
transcripción. Existen represores (regulador proteico) que se une al
operador del operón (unidad de transcripción) para inhibir la
transcripción. En algunos casos existen correpresores (se unen al
represor) que son ligandos de enzimas alostéricas y se comportan
como inductores. Las proteínas que se necesitan para el inicio de la
transcripción son Activadores.
•En general esto sirve para soportar cambios ambientales y stress.
Regulon: grupo de genes sujeto al regulador. (Sist. de represión
catabólica: Para que usen Glucosa cuando está presente. Enzima
regulatoria: CRP y AMPc como ligando inductor. AMPc bajo cuando se
degrada Glucosa).
ADAPTACIÓN: SOS, Esporulación y quimiotaxis.
GENÉTICA
BACTERIANA
Genotipo: es en conjunto, la totalidad de información a
nivel genómico que codifica para las características de
un organismo.
Fenotipo: es el conjunto de características que
realmente se expresan en un organismo. Es un reflejo
del genotipo, aunque no siempre refleja la totalidad
del mismo.
•Gen: segmento de ADN que contiene toda
la información necesaria para la expresión
controlada de una proteína.
•Transcripción: es el proceso mediante el
cual la información contenida en una
secuencia de ADN se transmite a una
molécula de ARN.
•Traducción: es el proceso por el cual a
partir de una molécula de ARN se sintetiza
una proteína.
Mutación: es un cambio en la secuencia de
nucleótidos, originado por errores en el proceso de
replicación del ADN, o por agentes mutagénicos.
En función de la magnitud del cambio se pueden
clasificar en microlesiones o macrolesiones.
MICROLESIONES
Por desfasaje: hay alteración del marco de lectura de la secuencia.
Puede ser una deleción o una inserción de una base nitrogenada.
Por sustitución:
Transición: cambio de una base nitrogenada por otra del mismo tipo.
Transversión: cambio de una base púrica (adenina y guanina) por
una pirimidínica (timidina, citosina y uracilo) y viceversa.
MACROLESIONES:
Deleción: Pérdida de un grupo de bases.
Inserción: Se insertan o se intercalan trozos de
ADN en el interior de una secuencia.
Duplicación: Repeticiones en tandem.
Inversión: Una porción de ADN se separa y
vuelve a unirse pero en sentido inverso.
Translocación: Una porción de ADN se
desprende y se inserta en otra región del
genoma.
Una mutación siempre produce un cambio en el
genotipo, pero ese cambio no siempre se ve
reflejado en el fenotipo.
Según el efecto producido, se puede clasificar en:
•mutación sin sentido: generación de un codón de
terminación. Cadena polipeptídica incompleta.
•mutación con sentido erróneo: cambio de un aa
por otro.
•mutación supresora: reversión al
fenotipo/genotipo original en células que ya habían
sufrido mutaciones anteriormente.
Agentes mutagénicos
Pueden ser físicos o químicos.
Químicos:
Modificadores de bases: normalmente generan transiciones
de base. (ácido nitroso, ag. alquilantes).
Modificadores de la estructura secundaria del ADN:
agentes intercalantes, pueden generar inserciones y
deleciones. (colorantes de acridina).
Análogos de base: se incorporan en la síntesis de ADN ya
que son sustancias análogas a las bases de ADN, y al
replicarse nuevamente generan transiciones. (5-bromouracilo,
2-aminopurina)
MUTACIONES: espontáneas, motivadas por el sistema SOS o causadas por
agentes mutagénicos.
Físicos:
Luz UV/visible: producen dimerización de
timidinas que al separarse producen
alteraciones del código.
Radiación ionizante: (X, gamma y cósmicos)
producen radicales libres que originan rupturas
en la cadena de ADN, y la reparación origina las
mutaciones.
Sistemas de reparación o recuperación
Fotorreactivación: a través de la fosfoliasa, que rompe los
dímeros de timidina. Requiere de luz visible para actuar.
Reactivación negra: no necesita luz, es un poco más
complejo, son varias enzimas que cortan la región dañada
(también dímeros de timidina) e insertan los nucleótidos
complementarios correspondientes.
SOS: se activa post-replicación, frente a la aparición de
regiones unicatenarias sintetizando las cadenas
complementarias.
Recombinación genética
Es el proceso por el cual elementos genéticos
contenidos en dos genomas separados llegan a
estar juntos dentro de una misma unidad.
En procariotas es un fenómeno que ocurre en
forma azarosa por tres mecanismos:
•Transformación: captación de ADN libre en el medio por
células competentes (receptora).
•Transducción: transferencia de material genético bacteriano
por medio de bacteriófagos (virus bacterianos).
•Conjugación: transferencia de ADN entre dos células en
contacto (plásmido F y otros plásmidos).
Transformación (neumococo-
experimento)
Se da naturalmente sólo en algunos géneros
bacterianos (Streptococcus, Haemophilus), aunque
se puede inducir competencia experimentalmente
en diversos géneros.
El ADN libre debe ser bicatenario para ser
reconocido y solo habrá recombinación si hay
homología con alguna secuencia del receptor.
Transducción
Transducción generalizada: después de un ciclo lítico
normal, se generan partículas víricas conteniendo ADN
viral o bacteriano, que luego infectarán otras células
descargando el material genético en su interior. El material
bacteriano que se transmite es totalmente inespecífico.
Transducción restringida o especializada: vía virus con
ciclos lisogénicos. El material transmitido corresponde a
secuencias adyacentes al sitio de inserción del genoma
viral en el cromosoma bacteriano, y por consiguiente son
genes próximos a secuencias homólogas al virus.
Conjugación (La única que puede
darse en bacterias de diferente
género)
Depende de la presencia del plásmido F, que codifica
para una estructura denominada pili sexual, que
media la transferencia de material célula-célula.
El plásmido F y otros plásmidos se replican de forma
independiente al cromosoma bacteriano. Atraviesan
el pili en forma unicatenaria.
Se puede dar entre células de diferente género,
siempre que una de ellas tenga plásmido F.
ESTERILIZACIÓN Y
DESINFECCIÓN
DECONTAMINACIÓN: Procedimiento o tratamiento que hace
segura la manipulación y el uso de dispositivos, aparatos e
instrumentos. Esterilización, desinfección o limpieza simple.
ESTERILIZACIÓN: Completa eliminación o destrucción de toda
forma vida microbiana, incluyendo las esporas.
DESINFECCIÓN: Eliminar o reducir la densidad de los
microorganismos patógenos que se encuentran sobre objetos
inanimados, con excepción de las esporas bacterianas.
ANTISEPSIA: Se emplea un agente químico sobre superficies
animadas (piel o tejidos vivos) con el propósito de inhibir su
crecimiento o destruir a los microorganismos.
LIMPIEZA: Remoción de toda materia ajena al objeto (suciedad,
materia orgánica, etc.). Generalmente se lleva a cabo con agua,
detergentes y acción mecánica.
La limpieza debe preceder a todo proceso de desinfección y
esterilización.
Pérdida irreversible de la capacidad de
reproducción.
Curva de muerte bacteriana:
Se grafican número de sobrevivientes (UFC/ml) en
escala logarítmica y en función del tiempo de
exposición al agente en escala aritmética. Se obtiene
una recta. La ordenada al origen indica el log del
número inicial de bacterias y la pendiente define la
velocidad de muerte de la población durante la
esterilización.
MUERTE
BACTERIANA
MÉTODOS DE
ESTERILIZACIÓN
Métodos Físicos:
Aplicación de calor: Húmedo a sobrepresión
(Autoclave).
Seco.
Tindalización.
Filtración: Uso de Membranas.
Irradiación: Gamma.
UV.
Métodos Químicos:
Exposición: Oxido de etileno.
Glutaraldehido.
DESINFECCIÓN Y
ANTISEPSIA
Físicos: Pasteurización.
Químicos: - Desinfectantes de alto nivel
Glutaraldehídos, formaldehídos y peroxígenos.
- Desinfectantes de nivel intermedio
Alcoholes, clorógenos, iodóforos y fenoles.
- Desinfectantes de bajo nivel Compuestos
de amonio cuaternario, anfóteros, mercuriales y sales
de plata.
MEDIOS DE CULTIVO
BACTERIANO
MEDIOS
Sólidos.
Semisólidos.
Líquidos.
Gelatinas
Definición:
Las sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el
crecimiento de microorganismos se conocen como medio de
cultivo. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente
en casi cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios
especiales y aún hay algunas que no pueden crecer en
ninguno de los medios inertes desarrollados hasta ahora.
Los microbios que crecen y se multiplican dentro o sobre un
medio de cultivo constituyen lo que se denomina cultivo
microbiano. En éste los gérmenes desarrollan sus procesos
bioquímicos vitales.
Disolvente de las sustancias nutritivas y además es el solvente de los
electrolitos que mantienen el equilibrio ácido-base y la presión osmótica
bacteriana.
Deben contener sustancias nutritivas adecuadas : hidratos de carbono,
proteínas, lípidos, sales minerales, y en algunos casos vitaminas o
factores de crecimiento que son sustancias indispensables para acelerar
el metabolismo bacteriano y actuar como coenzimas de procesos
enzimáticos.
Debe tener un pH adecuado: pH neutro ligeramente alcalino (la mayoría
de las bacterias se desarrollan a pH entre 6,5 (acidófilos) y 7,5
(neutrófilos)).
Debe mantenerse en condiciones estériles: para evitar que se desarrollen
gérmenes no deseados dificultando identificar la bacteria que hemos
sembrado.
oxígeno libre o combinado, según que las bacterias respiren por un
mecanismo aerobio, anaerobio facultativo o microaerofílico.
Aceptores y donadores de hidrógeno: todos los organismos
requieren una fuente de energía en forma de donantes de
hidrógenos (sustratos oxidables).También se requieren aceptores
de hidrógeno en las reacciones de oxidorreducción que suministran
energía.
- Gérmenes aerobios: oxígeno libre
- Gérmenes anaerobios estrictos: Sust. Inorgánicas (carbonatos,
nitratos, sulfatos)
- Gérmenes anaerobios facultativos: Sust. Orgánica
(fermentadores).
Fuente de Carbono, Nitrógeno y minerales (Azufre, Fósforo, etc.)
Debe ser mantenido a una temperatura óptima: ésta temperatura
esta alrededor de los 37º C.
Hay una gran variedad de medios disponibles para el cultivo de
microorganismos. Comercialmente la mayoría de ellos tienen sus
componentes previamente mezclados y sólo necesitan la adición de
agua y esterilización.
En los medios líquidos las sustancias nutritivas se
encuentran disueltas y los microorganismos quedan en
suspensión. Por otro lado en fases liquidas el crecimiento
suele ser mayor que en medios sólidos porque la
disponibilidad de nutrientes también es mayor.
No contienen ningún tipo de agente solidificante y son
también denominados caldos.
Los medios líquidos pueden ser: de origen animal, de origen
vegetal y también de composición química definida.
* Origen animal: pueden ser naturales (la leche o el suero) o
pueden ser elaborados (caldo de extracto de carne).
* Origen vegetal: corresponde generalmente a infusiones:
infusiones de papa y de zanahoria .
LIQUIDOS
Se utiliza un agente solidificante (el agar-agar) en
una proporción por encima del 15% (12-15 g/L). En
ellos las bacterias crecen con mayor dificultad,
pues los nutrientes se agotan con rapidez en el
punto donde se desarrollan no obstante nos
permite el aislamiento, purificación y visualización
de su crecimiento en colonias, así como su posible
identificación a través de medios específicos y
diferenciales de caracteres sólidos, elaboración de
antibiogramas, etc.
SOLIDOS
AGAR TSA AGAR TCBS
AGAR CHOCOLATE AGAR SANGRE
SEMISOLIDOS
Presentan agar-agar en su composición en una proporción menor al
5% (2,5g/L). Se utiliza especialmente para el estudio de algunas
propiedades bioquímicas (oxidación-fermentación) .
GELATINA: Agente solidificante que se emplea mucho menos
ya que bastantes bacterias provocan su licuefacción. Es
proteica, de origen animal y tiene la facultad de absorber
agua. Se elabora agregándole al caldo común gelatina
extrafina en proporción del 12-15 % lo cuál permite solidificar
el medio. Se filtra, se esteriliza y se coloca en tubos.
Se utiliza para cultivos de menos de 22º C, ya que licua a esta
temperatura.
En Bacteriología la gelatina se emplea, sola o mezclada con
otras sustancias, como medio de cultivo y también para la
conservación de preparaciones microscópicas.
TIPOS DE MEDIO:
- General
- Selectivo: aislamiento directo o de enriquecimiento
- Diferencial
- Químicamente definido
- Complejos
- Mínimo

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  • 2. CRECIMIENTO BACTERIANO La replicación de una bacteria es el resultado de una serie de procesos metabólicos ordenados y que conducen a la FISIÓN BINARIA. Crecimiento bacteriano abarca tres grandes áreas de estudio: •El METABOLISMO BACTERIANO, genera el material celular a partir de nutrientes simples presentes en el medio. •La REGULACIÓN, coordina centenares de procesos metabólicos y permite la síntesis coordenada y eficiente de los componentes y estructuras de las bacterias. •La DIVISIÓN CELULAR, es la formación de dos células hijas independientes a partir de una única célula madre.
  • 3. METABOLISMO Es la suma de todos los procesos químicos que ocurren en un organismo. - Catabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que liberan energía. - Anabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que utilizan energía. -Una ruta metabólica es una secuencia de reacciones químicas intracelulares catalizadas por enzimas. -Las enzimas son codificadas por los genes.
  • 4. BACTERIANO Tiene muchos procesos semejantes a los de las células eucariotas. PARTICULARIDADES: •Metabolismo adaptado para el crecimiento veloz. Es entre 10 y 100 veces más rápido que en células humanas. •Tienen mayor versatilidad en cuanto al tipo de nutrientes que puede utilizar para producir energía. •Mayor versatilidad en la utilización de oxidantes y no están limitadas al solo uso del oxígeno. •Gran diversidad de requerimientos nutricionales ya que no todas poseen todos los caminos biosintéticos. Ayuda para la identificación. •Sintetizan macromoléculas por mecanismos menos engorrosos. Síntesis de Mureína, LPS y Acidos teicoicos son procesos únicos de las bacterias. Aerobicas. Anaerobicas facultativas. Anaerobicas estrictas.
  • 5. COMPLEJIDAD DEL METABOLISMO BACTERIANO Por medio de 2000 reacciones metabólicas diferentes la bacteria puede sintetizarse a si misma y generar la energía que necesita para procesos como la Motilidad y Transporte Activo. REACCIONES METABOLICAS DE LA BACTERIA: •Reacciones de abastecimiento. •Reacciones de biosíntesis. •Reacciones de polimerización. •Reacciones de ensamblado.
  • 6. REACCIONES DE ABASTECIMIENTO Proveen la energía y los 12 precursores que la bacteria necesita para las reacciones biosintéicas. Precursores: Glucosa-6-P, Fructosa-6-P, Pentosa-5-P, Eritrosa-4-P, triosa-P, 3-Fosfoglicerato, Fosfoenol- piruvato, Piruvato, Acetil-CoA, alfa-Cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. CO2 O2 Agua …. Son los únicos nutrientes que entran por difusión simple a las bacterias. Los nutrientes utilizan Difusión facilitada y transporte activo para ingresar.
  • 7. RESPIRACIÓN Hidratos de Carbono y otras moléculas: Fuente de Carbono y Energía. GLUC OLISIS RESPIRACIÓN (no siempre es el oxigeno el aceptor de electrones.) FERMENTACIÓN (poco eficiente) GLUCOSA Acido Pirívico AT P NAD H C.C Acetil CoA AT P CO2 NAD H Electrones- Cadena Respiratoria AT P O2 H2 O Acido Pirúvico o derivado FERMENTACI ÓN Productos finales de la fermentación: Ej. Acido láctico. NAD H
  • 8. RESPIRACIÓN CARACTERISTICAS - fosforilación oxidativa ( ADP + P - ATP) - Requieren una cadena de transporte de electrones - Pueden ocurrir en presencia de oxígeno (respiración aeróbica) o en su ausencia (respiración anaeróbica). - Tiene como aceptor final de electrones un compuesto inorgánico RESPIRACION AEROBICA: - El aceptor de electrones es el oxígeno. - Utiliza la cadena de transporte de electrones para generar un gradiente de protones imprescindible para que las ATPsintasas formen ATP. RESPIRACION ANAEROBICA: Existen bacterias (por ej. Pseudomonas o bacillus ) que utilizan aceptores de electrones distintos al oxígeno. Aceptor de electrones: NO3 - (productos: NO2 - N2 N2O) FERMENTACIÓN CARACTERÍSTICAS - fosforilación a nivel de sustrato (citoplasma) - no necesita cadena de transporte de electrones (CTE) - utiliza como aceptor final de electrones una molécula orgánica. - El ATP se forma por donación de ATP de un fosfato de alta energía a partir de un producto intermedio fosforilado.
  • 9. REACCIONES DE BIOSÍNTESIS A partir de 12 precursores se sintetizan Aminoácidos, nucleótidos, hidratos de carbono, aminoazúcares, ácidos grasos y otras moléculas que son unidades necesarias para la síntesis de macromoléculas. Además de la fuente de Carbono, las bacterias necesitan para la biosíntesis: Grandes cantidades de NADPH, ATP, Nitrógeno amínico y una fuente de Azufre. Las moléculas que no pueden ser sintetizadas por una bacteria, obligatoriamente la obtienen del medio. SULFONAMIDAS: Inhibe la síntesis de Acido fólico en las bacterias unirse (IC) a la enzima que sintetiza Ac fólico a partir de PABA (compuesto
  • 10. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN REPLICACIÓN: Comienza siempre en un mismo sitio oriC. Síntesis del ADN bidireccional. Adición de nucleótidos en dirección 5’-3’. TRANSCRIPCIÓN: La diferencia con eucariotas es que todas las formas de ARN (mensajero, transferencia, ribosomal) son sintetizados por la misma ARN polimeraza bacteriana. Además no hay transporte de ARNm porque no hay membrana nuclear. TRADUCCIÓN: Síntesis de proteínas. Diferencias con eucariotas: •Inicio de traducción requiere número menor de proteínas. •ARNm policistrónico: Cada ARNm transcribe más de un gen, por lo que sintetiza más de una proteína. •No requiere ni procesamiento ni transporte de ARNm. •Traducción transcurre simultánea y a igual velocidad que la transcripción. Alta eficacia del proceso. •OTRAS moléculas polimerizan (aunque se sintetizan en el citosol) en la membrana citoplasmática: Peptidoglicano (mureína), LPS, Fosfolípidos y polisacárido Capsular.
  • 11. REACCIONES DE ENSAMBLADO ESPONTÁNEO: Autoensamblado (Ej: flagelos y ribosomas) ESPECIAL: Mediado por mecanismos específicos de ensamblado guiado (algunas moléculas se sintetizan en el lugar de ensamblado y otras en el citosol y luego se ensamblan en su lugar..
  • 12. DIVISIÓN CELULAR FISIÓN BINARIA: Al azar se forman dos células hijas de una célula madre. Más de 30 genes están involucrados en este proceso. Muchas bacterias tardan 20 min en replicar su genoma a 37ºC. Las células hijas heredan cromosomas que ya están parcialmente replicados. Complejo sistema de regulación para que se termine un ciclo de replicación y las células hijas sean ambas viables.
  • 13.
  • 14. DESARROLLO DE LAS BACTERIAS EN CULTIVO INÓCULO: Introducción de células bacterianas viables en un medio de cultivo líquido o sobre la superficie de un medio sólido. CULTIVO: Se llama de esa manera a un conjunto o población de bacterias que crecen en un medio determinado. Si es homogénea hablamos de un cultivo puro (población de la misma cepa de la misma especie). COLONIAS: Pequeñas masas visibles que forman las bacterias diseminadas mecánicamente sobre la superficie de un medio sólido cuando se replican en un tiempo determinado. CLON: Cuando las bacterias de una colonia derivan de una única célula. UFC: Puede estar compuesta por una bacteria o un cúmulo de bacterias y al crecer sobre medio sólido son capaces de generar una colonia aislada. DENSIDAD: Cuando hacemos referencia al contenido de bacterias en un cultivo líquido.
  • 15. CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un medio líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación. Replicación bacteriana en medio líquido depende de: •La especie bacteriana. •La composición del medio de cultivo. •La temperatura. TMG: 37ºC entre 30 y 60 min. 106 UFC/ml: Turbidéz Psicrófilas: Bacterias que crecen a bajas tº Termófilas: Bacterias que crecen a altas tº Mesófilas: Bacterias que crecen entre las tº de los otros dos grupos extremos (casi todos los patógenos del hombre).
  • 16. FASE DE LATENCIA FASE EXPONENCIAL FASE ESTACIONARIA FASE DE DECLINACIÓN densidad
  • 17. FASE DE LATENCIA: Este primer período del cultivo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las células microbianas se encuentran empobrecidas en cuanto a enzimas y metabolitos vitales para un óptimo uso de los nutrientes del medio hasta que alcanzan las concentraciones necesarias de estos componentes para reiniciar el crecimiento. Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de células.
  • 18. FASE LOGARÍTMICA O EXPONENCIAL: Una vez adaptadas, las bacterias crecen hasta que alcanzan rápidamente la máxima velocidad de replicación. La velocidad de replicación es constante y la proporción de bacterias que mueren es mínima. Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta de manera exponencial. Esto continua hasta que uno o más nutrientes se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El oxígeno suele ser el limitante para los organismos aerobios: cuando la densidad bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario aumentar el ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo ; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias/ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente. N=No*2r N: número total de bacterias después de “r” replicaciones y a partir de un inóculo inicial No
  • 19. FASE ESTACIONARIA MÁXIMA. Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio, cambio de pH o la acumulación de metabolitos tóxicos, el ritmo de crecimiento disminuye y se alcanza una fase estacionaria de crecimiento. Las bacterias se adaptan a las nuevas condiciones del medio y el ritmo de crecimiento ahora equivale al de muerte bacteriana. Debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. Entonces, designar a una célula microbiana como muerta no implica su destrucción física. La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio.
  • 20. FASE DE DECLINACIÓN: Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el deterioro y disminución de la densidad de células vivas debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, la que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrientes liberados por las células que mueren y se lisan, observándose recambio celular.
  • 21. REGULACIÓN Y ADAPTACIÓN Reacciones metabólicas: Forma coordinada. Para adaptar su metabolismo a las condiciones del medio: Sistemas de Regulación •Control de la actividad enzimática (enzimas alostéricas). •Control de la expresión génica (modifican la cantidad de diferentes enzimas que contienen). Ocurre generalmente al comienzo de la transcripción. Existen represores (regulador proteico) que se une al operador del operón (unidad de transcripción) para inhibir la transcripción. En algunos casos existen correpresores (se unen al represor) que son ligandos de enzimas alostéricas y se comportan como inductores. Las proteínas que se necesitan para el inicio de la transcripción son Activadores. •En general esto sirve para soportar cambios ambientales y stress. Regulon: grupo de genes sujeto al regulador. (Sist. de represión catabólica: Para que usen Glucosa cuando está presente. Enzima regulatoria: CRP y AMPc como ligando inductor. AMPc bajo cuando se degrada Glucosa). ADAPTACIÓN: SOS, Esporulación y quimiotaxis.
  • 23. Genotipo: es en conjunto, la totalidad de información a nivel genómico que codifica para las características de un organismo. Fenotipo: es el conjunto de características que realmente se expresan en un organismo. Es un reflejo del genotipo, aunque no siempre refleja la totalidad del mismo.
  • 24. •Gen: segmento de ADN que contiene toda la información necesaria para la expresión controlada de una proteína. •Transcripción: es el proceso mediante el cual la información contenida en una secuencia de ADN se transmite a una molécula de ARN. •Traducción: es el proceso por el cual a partir de una molécula de ARN se sintetiza una proteína.
  • 25. Mutación: es un cambio en la secuencia de nucleótidos, originado por errores en el proceso de replicación del ADN, o por agentes mutagénicos. En función de la magnitud del cambio se pueden clasificar en microlesiones o macrolesiones. MICROLESIONES Por desfasaje: hay alteración del marco de lectura de la secuencia. Puede ser una deleción o una inserción de una base nitrogenada. Por sustitución: Transición: cambio de una base nitrogenada por otra del mismo tipo. Transversión: cambio de una base púrica (adenina y guanina) por una pirimidínica (timidina, citosina y uracilo) y viceversa.
  • 26. MACROLESIONES: Deleción: Pérdida de un grupo de bases. Inserción: Se insertan o se intercalan trozos de ADN en el interior de una secuencia. Duplicación: Repeticiones en tandem. Inversión: Una porción de ADN se separa y vuelve a unirse pero en sentido inverso. Translocación: Una porción de ADN se desprende y se inserta en otra región del genoma.
  • 27. Una mutación siempre produce un cambio en el genotipo, pero ese cambio no siempre se ve reflejado en el fenotipo. Según el efecto producido, se puede clasificar en: •mutación sin sentido: generación de un codón de terminación. Cadena polipeptídica incompleta. •mutación con sentido erróneo: cambio de un aa por otro. •mutación supresora: reversión al fenotipo/genotipo original en células que ya habían sufrido mutaciones anteriormente.
  • 28. Agentes mutagénicos Pueden ser físicos o químicos. Químicos: Modificadores de bases: normalmente generan transiciones de base. (ácido nitroso, ag. alquilantes). Modificadores de la estructura secundaria del ADN: agentes intercalantes, pueden generar inserciones y deleciones. (colorantes de acridina). Análogos de base: se incorporan en la síntesis de ADN ya que son sustancias análogas a las bases de ADN, y al replicarse nuevamente generan transiciones. (5-bromouracilo, 2-aminopurina) MUTACIONES: espontáneas, motivadas por el sistema SOS o causadas por agentes mutagénicos.
  • 29. Físicos: Luz UV/visible: producen dimerización de timidinas que al separarse producen alteraciones del código. Radiación ionizante: (X, gamma y cósmicos) producen radicales libres que originan rupturas en la cadena de ADN, y la reparación origina las mutaciones.
  • 30. Sistemas de reparación o recuperación Fotorreactivación: a través de la fosfoliasa, que rompe los dímeros de timidina. Requiere de luz visible para actuar. Reactivación negra: no necesita luz, es un poco más complejo, son varias enzimas que cortan la región dañada (también dímeros de timidina) e insertan los nucleótidos complementarios correspondientes. SOS: se activa post-replicación, frente a la aparición de regiones unicatenarias sintetizando las cadenas complementarias.
  • 31. Recombinación genética Es el proceso por el cual elementos genéticos contenidos en dos genomas separados llegan a estar juntos dentro de una misma unidad. En procariotas es un fenómeno que ocurre en forma azarosa por tres mecanismos: •Transformación: captación de ADN libre en el medio por células competentes (receptora). •Transducción: transferencia de material genético bacteriano por medio de bacteriófagos (virus bacterianos). •Conjugación: transferencia de ADN entre dos células en contacto (plásmido F y otros plásmidos).
  • 32. Transformación (neumococo- experimento) Se da naturalmente sólo en algunos géneros bacterianos (Streptococcus, Haemophilus), aunque se puede inducir competencia experimentalmente en diversos géneros. El ADN libre debe ser bicatenario para ser reconocido y solo habrá recombinación si hay homología con alguna secuencia del receptor.
  • 33. Transducción Transducción generalizada: después de un ciclo lítico normal, se generan partículas víricas conteniendo ADN viral o bacteriano, que luego infectarán otras células descargando el material genético en su interior. El material bacteriano que se transmite es totalmente inespecífico. Transducción restringida o especializada: vía virus con ciclos lisogénicos. El material transmitido corresponde a secuencias adyacentes al sitio de inserción del genoma viral en el cromosoma bacteriano, y por consiguiente son genes próximos a secuencias homólogas al virus.
  • 34. Conjugación (La única que puede darse en bacterias de diferente género) Depende de la presencia del plásmido F, que codifica para una estructura denominada pili sexual, que media la transferencia de material célula-célula. El plásmido F y otros plásmidos se replican de forma independiente al cromosoma bacteriano. Atraviesan el pili en forma unicatenaria. Se puede dar entre células de diferente género, siempre que una de ellas tenga plásmido F.
  • 36. DECONTAMINACIÓN: Procedimiento o tratamiento que hace segura la manipulación y el uso de dispositivos, aparatos e instrumentos. Esterilización, desinfección o limpieza simple. ESTERILIZACIÓN: Completa eliminación o destrucción de toda forma vida microbiana, incluyendo las esporas. DESINFECCIÓN: Eliminar o reducir la densidad de los microorganismos patógenos que se encuentran sobre objetos inanimados, con excepción de las esporas bacterianas. ANTISEPSIA: Se emplea un agente químico sobre superficies animadas (piel o tejidos vivos) con el propósito de inhibir su crecimiento o destruir a los microorganismos. LIMPIEZA: Remoción de toda materia ajena al objeto (suciedad, materia orgánica, etc.). Generalmente se lleva a cabo con agua, detergentes y acción mecánica. La limpieza debe preceder a todo proceso de desinfección y esterilización.
  • 37. Pérdida irreversible de la capacidad de reproducción. Curva de muerte bacteriana: Se grafican número de sobrevivientes (UFC/ml) en escala logarítmica y en función del tiempo de exposición al agente en escala aritmética. Se obtiene una recta. La ordenada al origen indica el log del número inicial de bacterias y la pendiente define la velocidad de muerte de la población durante la esterilización. MUERTE BACTERIANA
  • 38. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Métodos Físicos: Aplicación de calor: Húmedo a sobrepresión (Autoclave). Seco. Tindalización. Filtración: Uso de Membranas. Irradiación: Gamma. UV. Métodos Químicos: Exposición: Oxido de etileno. Glutaraldehido.
  • 39. DESINFECCIÓN Y ANTISEPSIA Físicos: Pasteurización. Químicos: - Desinfectantes de alto nivel Glutaraldehídos, formaldehídos y peroxígenos. - Desinfectantes de nivel intermedio Alcoholes, clorógenos, iodóforos y fenoles. - Desinfectantes de bajo nivel Compuestos de amonio cuaternario, anfóteros, mercuriales y sales de plata.
  • 41. MEDIOS Sólidos. Semisólidos. Líquidos. Gelatinas Definición: Las sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos se conocen como medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios especiales y aún hay algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios inertes desarrollados hasta ahora. Los microbios que crecen y se multiplican dentro o sobre un medio de cultivo constituyen lo que se denomina cultivo microbiano. En éste los gérmenes desarrollan sus procesos bioquímicos vitales.
  • 42. Disolvente de las sustancias nutritivas y además es el solvente de los electrolitos que mantienen el equilibrio ácido-base y la presión osmótica bacteriana. Deben contener sustancias nutritivas adecuadas : hidratos de carbono, proteínas, lípidos, sales minerales, y en algunos casos vitaminas o factores de crecimiento que son sustancias indispensables para acelerar el metabolismo bacteriano y actuar como coenzimas de procesos enzimáticos. Debe tener un pH adecuado: pH neutro ligeramente alcalino (la mayoría de las bacterias se desarrollan a pH entre 6,5 (acidófilos) y 7,5 (neutrófilos)). Debe mantenerse en condiciones estériles: para evitar que se desarrollen gérmenes no deseados dificultando identificar la bacteria que hemos sembrado.
  • 43. oxígeno libre o combinado, según que las bacterias respiren por un mecanismo aerobio, anaerobio facultativo o microaerofílico. Aceptores y donadores de hidrógeno: todos los organismos requieren una fuente de energía en forma de donantes de hidrógenos (sustratos oxidables).También se requieren aceptores de hidrógeno en las reacciones de oxidorreducción que suministran energía. - Gérmenes aerobios: oxígeno libre - Gérmenes anaerobios estrictos: Sust. Inorgánicas (carbonatos, nitratos, sulfatos) - Gérmenes anaerobios facultativos: Sust. Orgánica (fermentadores). Fuente de Carbono, Nitrógeno y minerales (Azufre, Fósforo, etc.) Debe ser mantenido a una temperatura óptima: ésta temperatura esta alrededor de los 37º C. Hay una gran variedad de medios disponibles para el cultivo de microorganismos. Comercialmente la mayoría de ellos tienen sus componentes previamente mezclados y sólo necesitan la adición de agua y esterilización.
  • 44. En los medios líquidos las sustancias nutritivas se encuentran disueltas y los microorganismos quedan en suspensión. Por otro lado en fases liquidas el crecimiento suele ser mayor que en medios sólidos porque la disponibilidad de nutrientes también es mayor. No contienen ningún tipo de agente solidificante y son también denominados caldos. Los medios líquidos pueden ser: de origen animal, de origen vegetal y también de composición química definida. * Origen animal: pueden ser naturales (la leche o el suero) o pueden ser elaborados (caldo de extracto de carne). * Origen vegetal: corresponde generalmente a infusiones: infusiones de papa y de zanahoria . LIQUIDOS
  • 45. Se utiliza un agente solidificante (el agar-agar) en una proporción por encima del 15% (12-15 g/L). En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan no obstante nos permite el aislamiento, purificación y visualización de su crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres sólidos, elaboración de antibiogramas, etc. SOLIDOS
  • 46. AGAR TSA AGAR TCBS AGAR CHOCOLATE AGAR SANGRE
  • 47. SEMISOLIDOS Presentan agar-agar en su composición en una proporción menor al 5% (2,5g/L). Se utiliza especialmente para el estudio de algunas propiedades bioquímicas (oxidación-fermentación) . GELATINA: Agente solidificante que se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuefacción. Es proteica, de origen animal y tiene la facultad de absorber agua. Se elabora agregándole al caldo común gelatina extrafina en proporción del 12-15 % lo cuál permite solidificar el medio. Se filtra, se esteriliza y se coloca en tubos. Se utiliza para cultivos de menos de 22º C, ya que licua a esta temperatura. En Bacteriología la gelatina se emplea, sola o mezclada con otras sustancias, como medio de cultivo y también para la conservación de preparaciones microscópicas.
  • 48. TIPOS DE MEDIO: - General - Selectivo: aislamiento directo o de enriquecimiento - Diferencial - Químicamente definido - Complejos - Mínimo