Este documento describe los métodos de preparación y esterilización para el cultivo celular, incluyendo la preparación de la cristalería, reactivos y medios, y técnicas para cultivos primarios y subcultivos. En particular, se detalla el proceso de cultivo primario, que incluye la adquisición de la muestra, aislamiento del tejido, disección y/o desagregación, y el cultivo inicial. Se discuten varias técnicas de desagregación de tejidos, como las técnicas mecánicas y enzim

1. Cultivo Celular
Métodos de preparación y esterilización.
Cultivo primario.
Subcultivo y Líneas celulares.

2. Preparación
y
esterilización

3. Preparación
y
esterilización

4. Preparación
y
esterilización
CRISTALERIA
Los detergentes alcalinos cáusticos hacen que la superficie del vidrio no sea adecuada para la fijación de la
celula y requieran una neutralización posterior con HCl diluido o H2SO4. Los detergentes neutros no alteran
la superficie del vidrio y se eliminan más fácilmente.
El procedimiento de lavado más eficaz es el siguiente:
1. No permita que la cristalería sucia se seque. Se debe incluir un agente esterilizante, como el hipoclorito
de sodio, en el agua utilizada para recoger la cristalería sucia (para eliminar cualquier riesgo biológico
potencial y para prevenir el crecimiento microbiano en el agua).
2. Seleccione un detergente que sea efectivo en el agua de su área, que se enjuague fácilmente y que no
sea tóxico.
3. Antes de secar la cristalería, asegúrese de que se haya enjuagado completamente con agua del grifo y
luego con agua desionizada o destilada.
4. Seque la cristalería invertida para que se escurra fácilmente.
5. Esterilice la cristalería con calor seco para minimizar el riesgo de depositar residuos tóxicos de la
esterilización con vapor.

5. Preparación
y
esterilización
1. El calor húmedo es más efectivo que el calor seco; sin embargo, conlleva el riesgo de dejar
residuos.
2. Para que el calor húmedo sea efectivo, se debe garantizar la penetración del vapor:
CRISTALERIA
Estas botellas fueron esterilizadas en autoclave con indicadores de esterilidad Thermalog en su interior (se vuelve azul con alta temperatura y
vapor, y el área azul se mueve a lo largo de la tira con el tiempo en las condiciones de esterilización requeridas) La tapa de la botella más a la
izquierda estaba apretada, y cada tapa sucesiva se aflojó gradualmente, hasta que, finalmente, no se usó tapa en la botella más a la derecha. Las
tres botellas siguientes están todas estériles, pero la mancha marrón en el indicador muestra que tenían líquido al final del ciclo.

6. Preparación
y
esterilización
REACTIVOS Y MEDIOS
El objetivo final en la preparación de reactivos y medios es producirlos en forma pura:
(1) para evitar la inclusión accidental de inhibidores y sustancias tóxicas.
(2) para permitir que el reactivo esté totalmente definido y las funciones de sus
constituyentes sean completamente entendido.
(3) para reducir el riesgo de contaminación microbiana.
La mayoría de los reactivos y medios se pueden esterilizar mediante autoclave, si son
termoestables (p. ej., agua, soluciones salinas, hidrolizados de aminoácidos) o mediante
filtración por membrana, si son termolábiles.
Para el autoclave, las soluciones deben dispensarse en vidrio de borosilicato o
policarbonato y mantenerse selladas para evitar la evaporación y la contaminación
química del autoclave.
Si se utilizan botellas de vidrio de soda, es mejor dejarlas con las tapas flojas para
minimizar la rotura.

7. Cultivo
Primario
Un cultivo primario es esa etapa del cultivo después del aislamiento de las células
pero antes del primer subcultivo. Hay cuatro etapas a considerar:
(1) Adquisición de la muestra.
(2) Aislamiento del tejido.
(3) Disección y/o desagregación.
(4) Cultivo después de la siembra en el recipiente de cultivo.
Después del aislamiento, se puede obtener un cultivo celular primario ya sea
permitiendo que las células migren desde fragmentos de tejido adheridos a un
sustrato adecuado o desagregando el tejido mecánica o enzimáticamente para
producir una suspensión de células, algunas de las cuales finalmente se unirán al
sustrato.

8. Cultivo
Primario
• Antes de intentar trabajar con tejido humano o animal, asegúrese de que su trabajo se ajuste a
las normas éticas médicas o la legislación vigente sobre experimentación con animales. El
trabajo con biopsias humanas o material fetal generalmente requiere el consentimiento del
comité de ética local y el paciente y/o sus familiares.
• Se debe intentar esterilizar el sitio de la resección con alcohol al 70% si es probable que esté
contaminado (p. ej., piel). Retire el tejido asépticamente y transfiéralo al laboratorio de cultivo
de tejidos en BSS (DBSS) tan pronto como sea posible.
• No diseccione animales en el laboratorio de cultivo de tejidos, ya que los animales pueden
tener contaminación microbiana.
• Si es inevitable un retraso en la transferencia del tejido, puede conservarse a 4◦C por hasta 72
h, aunque generalmente se obtendrá un mejor rendimiento con una transferencia más rápida.
Nota de seguridad. El trabajo con tejido humano
debe llevarse a cabo en el Nivel de Contención 2 en
una cabina de seguridad biológica Clase II.

9. Cultivo
Primario
Aunque cada tejido puede requerir un conjunto diferente de condiciones, la mayoría de ellos
comparten ciertos requisitos:
1. La grasa y el tejido necrótico se eliminan mejor durante la disección.
2. El tejido debe cortarse finamente con instrumentos afilados para causar el mínimo daño.
3. Las enzimas utilizadas para la desagregación deben eliminarse posteriormente mediante
centrifugación suave.
4. La concentración de células en el cultivo primario debe ser mucho mayor que la que normalmente
se usa para el subcultivo, porque la proporción de células del tejido que sobrevive en el cultivo
primario puede ser bastante baja.
5. Un medio rico, como Ham's F12, es preferible a un medio simple, como Eagle's MEM y, si se
requiere suero fetal bovino a menudo proporciona una mejor supervivencia que de ternera o de
caballo. El aislamiento de tipos de células específicos probablemente requerirá medios selectivos.
6. El tejido embrionario se disgrega más fácilmente, produce células más viables y prolifera más
rápidamente en cultivo primario que el tejido adulto.

10. Cultivo
Primario
Técnicas
de
desagregación
de
tejidos.
Técnicas mecánicas
(Implican disección con o sin alguna
forma de maceración)
La desagregación mecánica funciona bien con
tejidos blandos y algunos tejidos más firmes
cuando el rendimiento no es importante
Técnicas enzimáticas
La desagregación enzimática da un mejor
rendimiento cuando el volumen del tejido
disponible es mayor.

11. Cultivo
Primario
• Las enzimas utilizadas con mayor frecuencia para la desagregación de tejidos son preparaciones
crudas de tripsina, colagenasa, elastasa, pronasa, dispasa, DNasa y hialuronidasa, solas o en
varias combinaciones, por ejemplo, elastasa y DNasa para el aislamiento de células alveolares tipo
II.
• Las preparaciones crudas a menudo tienen más éxito que las preparaciones de enzimas
purificadas, porque los primeros contienen otras proteasas como contaminantes, aunque los
segundos son generalmente menos tóxicos y más específicos en su acción.
La tripsina y la pronasa dan la
desagregación más completa, pero
pueden dañar las células.
La colagenasa y la dispasa, por otro
lado, dan una desagregación
incompleta, pero son menos dañinas.
La hialuronidasa se puede usar
junto con la colagenasa para digerir
la matriz intracelular.
La ADNasa se usa para dispersar
el ADN liberado de las células
lisadas. El ADN tiende a alterar la
proteólisis y promover la
reagregación.

12. Cultivo
Primario

13. Cultivo
Primario
Explante primario
El tejido se corta finamente y se enjuaga, y las piezas se siembran en la
superficie de un matraz de cultivo o placa de petri en un pequeño volumen
de medio con una alta concentración (es decir, 40-50%) de suero, de modo
que la tensión superficial mantenga las piezas en su lugar hasta que se
adhieran espontáneamente a la superficie.
Esta técnica es particularmente útil para pequeñas cantidades de tejido,
como biopsias de piel, para las que existe el riesgo de perder células
durante la desagregación mecánica o enzimática.
Sus desventajas radican en la escasa adhesividad de algunos tejidos y la
selección de células en el crecimiento. En la práctica, sin embargo, la
mayoría de las células, en particular las embrionarias, migran con éxito.

14. Cultivo
Primario
Explante primario

15. Cultivo
Primario
La desagregación mecánica y enzimática del tejido evita problemas de
selección por migración y produce un mayor número de células
representativas de todo el tejido en un menor tiempo. Sin embargo, al igual
que la técnica de explante primario las técnicas de disociación
seleccionarán células resistentes a la proteasa y al estrés mecánico.
La elección del grado de tripsina a utilizar
siempre ha sido difícil, ya que existen dos
tendencias opuestas:
(1) cuanto más pura es la tripsina, menos
tóxica se vuelve y más predecible su
acción.
(2) cuanto más cruda es la tripsina, más
eficaz puede ser, debido a otras proteasas.
En la práctica, puede ser necesario un
experimento de prueba preliminar para
determinar el grado óptimo para el rendimiento
de células viables.

16. Cultivo
Primario
Tripsina Caliente
Es importante minimizar la exposición de las
células a la tripsina activa para preservar la
máxima viabilidad. Por lo tanto, cuando todo el
tejido se tripsina a 37◦C, las células disociadas
deben recolectarse cada media hora y la
tripsina debe eliminarse por centrifugación y
neutralizarse con suero.
Esta técnica es útil para la desagregación de
grandes cantidades de tejido en un tiempo
relativamente corto. No funciona tan bien con
tejido adulto, en el que hay mucho tejido
conjuntivo fibroso, y la agitación mecánica
puede dañar algunos de los tipos de células
más sensibles, como el epitelio.
Tripsina Fría
Una de las desventajas de usar tripsina para
disgregar el tejido es el daño que puede
resultar de la exposición prolongada del tejido
a la tripsina a 37◦C; de ahí la necesidad de
cosechar células después de incubaciones de
30 minutos en el método de tripsina caliente
en lugar de exponerlas durante todo el tiempo
(es decir, 3-4 h).
Un método simple para minimizar el daño a
las células durante la exposición es sumergir
el tejido en tripsina a 4◦C durante 6–18 h para
permitir la penetración de la enzima con poca
actividad tríptica.

17. Otros procedimientos enzimáticos
La desagregación en la tripsina puede ser dañina (p. ej., para algunas células
epiteliales) o ineficaz (p. ej., para tejido muy fibroso, como el tejido conjuntivo
fibroso), por lo que se han hecho intentos para utilizar otras enzimas:
• Colagenasa (Debido a que la matriz extracelular a menudo contiene
colágeno, particularmente en el tejido conjuntivo y el músculo)
• Pronasa (proteasa bacteriana)
• Hialuronidasa y neuraminidasa (participación de los carbohidratos en la
adhesión intracelular)
Proteasa: Bromelina
Cultivo
Primario

18. Desagregación mecánica
La digestión enzimática es bastante más laboriosa,
aunque, potencialmente, da un cultivo que es más
representativo del tejido. Como existe el riesgo de
daño proteolítico a las células muchas personas
han optado por utilizar la alternativa de la
disgregación mecánica, por ejemplo:
• Recolectando las células que se derraman
cuando el tejido se corta cuidadosamente.
• Presionando el tejido disecado a través de una
serie de tamices para los cuales la malla se
reduce gradualmente en tamaño, o,
alternativamente, forzando los fragmentos de
tejido a través de una jeringa (con o sin una
aguja de calibre ancho).
• Pipeteándolo repetidamente.
Cultivo
Primario

19. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
• El primer subcultivo representa una transición importante para un cultivo primario.
La necesidad de subcultivar implica que el cultivo ah aumentado hasta ocupar todo
el sustrato disponible.
• Después del primer subcultivo, la fracción de crecimiento suele ser alta (80% o
más).
• A partir de un cultivo primario muy heterogéneo, que contiene muchos de los tipos
de células presentes en el tejido original, surge una línea celular más homogénea.
• Además de su importancia biológica, este proceso tiene una importancia práctica, ya
que el cultivo ahora se puede propagar, caracterizar y almacenar, y el aumento
potencial en el número de células y la uniformidad de las células abren una gama
mucho más amplia de posibilidades experimentales.

20. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
TERMINOLOGIA
a) Una vez que se subcultiva (o pasa ) un cultivo primario , se lo conoce como
línea celular. Este término implica la presencia de varios linajes celulares de
fenotipos similares o distintos.
b) Si se selecciona un linaje celular, por clonación, por separación celular física,
o por cualquier otra técnica de selección, esta línea celular se conoce como
cepa celular.
c) Si una línea celular se transforma in vitro, da lugar a una línea celular
continua y, si se selecciona o clona y caracteriza, se conoce como cepa
celular continua.
d) El primer subcultivo da lugar a un cultivo secundario , el secundario a uno
terciario etc..
e) El número de pases es el número de veces que se ha subcultivado el
cultivo, mientras que el número de generación es el número de
duplicaciones que ha sufrido la población celular.

21. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
Las líneas celulares con
vidas de cultivo limitadas se
conocen como líneas finitas.
Estas líneas celulares se
comportan de una manera
bastante reproducible, tienen
un numero limitado de
generaciones de células,
generalmente entre 20 y 80
duplicaciones de la población
celular, antes de la extinción.
Las líneas celulares
continuas han escapado del
control de la senescencia,
por lo que el número de
generación se vuelve menos
importante y el número de
pases desde la última
descongelación se vuelve
más importante.
EDAD
DEL
CULTIVO

22. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
DESIGNACIONES DE LÍNEAS CELULARES
A. Las nuevas líneas celulares deben recibir un código o una
designación [p.ej., cerebro humano normal (NHB)].
B. Una cepa celular o número de línea celular (si varias líneas
celulares se derivaron de la misma fuente; por ejemplo,
NHB1, NHB2, etc.).
C. Si se clonó, un número de clon (p. ej., NHB2-1, NHB2-2,
etc.).
D. Para líneas celulares finitas, el número de duplicaciones de
población debe estimarse e indicarse después de una barra
diagonal, por ejemplo, NHB2/2, y aumenta en uno para una
proporción de división de 1:2 (por ejemplo, NHB2/2, NHB2/3,
etc).
E. Cuando se trata de una línea celular continua, a menudo se
usa un número "p" al final para indicar el número de pases
desde la última descongelación p. ej., HeLa-S3/p4 .

23. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
ELEGIR UNA LINEA CELULAR:
1. Finito vs. Continuo. ¿Existe una línea celular continua que exprese las funciones
correctas? Una línea celular continua generalmente es más fácil de mantener, crece
más rápido, se clona más fácilmente, produce un mayor rendimiento de células por
matraz y se adapta más fácilmente al medio sin suero.
2. Normal o Transformada. ¿Es importante si la línea se transforma malignamente o
no? Si es así, entonces podría ser posible obtener una línea inmortal que no sea
tumorigénica, por ejemplo, células 3T3 o BKK21-C13.
3. Especies. ¿Es importante la especie? Las líneas celulares no humanas tienen menos
restricciones de riesgo biológico y tienen la ventaja de que el tejido original puede ser
más accesible.
4. Características de crecimiento. ¿Qué necesita en términos de tasa de crecimiento,
rendimiento, eficiencia de siembra y facilidad de cosecha?
5. Disponibilidad. Si tiene que usar una línea celular finita, ¿hay suficientes existencias
disponibles o tendrá que generar sus propias líneas? Si elige una línea celular
continua, ¿hay existencias autenticadas disponibles?

24. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
ELEGIR UNA LINEA CELULAR:
6. Validación. ¿Qué tan bien caracterizada está la línea, si ya existe o, si no,
puede hacer la caracterización necesaria? ¿La línea es auténtica? Es vital
eliminar la posibilidad de contaminación cruzada antes de embarcarse en un
programa de trabajo con una línea celular, ya que se han informado muchas
contaminaciones cruzada.
7. Expresión fenotípica. ¿Se puede hacer que la línea exprese las
características correctas?
8. Línea celular de control. Si está utilizando una línea celular mutante,
transfectada, transformada o anormal, ¿hay un equivalente normal disponible?
¿Debería ser necesario?
9. Estabilidad. ¿Qué tan estable es la línea celular? ¿Ha sido clonado? Si no,
¿puedes clonarlo? y ¿cuánto tiempo llevaría este proceso de clonación para
generar suficientes existencias congeladas y utilizables?

25. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
MANTENIMIENTO DE RUTINA
Una vez que se inicia un cultivo, ya sea un cultivo primario o un subcultivo de una
línea celular, necesitará un cambio de medio periódico, o "alimentación", seguido
eventualmente por un subcultivo si las células están proliferando.
Las líneas celulares transformadas de rápido crecimiento, como HeLa, se
subcultivan normalmente una vez por semana y el medio debe cambiarse cuatro
días después.
• Una caída en el pH. La mayoría de las células dejan de crecer cuando el pH
cae de pH 7,0 a pH 6,5 y comienzan a perder viabilidad entre Ph 6,5 y pH 6,0,
por lo que si el medio pasa de rojo a naranja a amarillo, se debe cambiar el
medio.
• Concentración celular. Cultivos con una alta concentración de células agotan
el medio más rápido que aquellos en un baja concentración.
• Tipo de célula. Las células normales (p. ej., fibroblastos diploides) por lo
general dejan de dividirse cuando la densidad celular es alta, debido al
hacinamiento celular, la depleción del factor de crecimiento y otras razones.
Sin embargo, las células transformadas, las líneas celulares continuas y
algunas células embrionarias se deterioran rápidamente a altas densidades
celulares a menos que se cambie el medio diariamente o se subcultiven.
• Deterioro morfológico. Este factor debe anticiparse mediante exámenes
regulares y familiarización con la línea celular. Si se permite que el deterioro
progrese demasiado, será irreversible, ya que las células tenderán a entrar en
apoptosis.

26. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
SUBCULTIVO
Cuando se subcultiva una línea celular, el nuevo crecimiento de las células hasta un
punto listo para el siguiente subcultivo generalmente sigue un patrón estándar.
a) Un período de latencia después de la siembra es seguido por un período de
crecimiento exponencial.
b) Cuando la densidad celular (células/cm2 de sustrato) alcanza un nivel tal que todo
el sustrato disponible está ocupado, o cuando la concentración celular (células/mL
de medio) excede la capacidad del medio, el crecimiento cesa o se reduce
considerablemente.
c) Para una línea celular adherente, la división de un cultivo, o subcultivo como se le
llama, generalmente implica la eliminación del medio y la disociación de las células
en la monocapa con tripsina, aunque algunas células poco adherentes (p. ej.,
HeLa-S3) pueden subcultivarse mediante agitar el frasco, recolectar las células en
el medio y diluir según corresponda en medio fresco en frascos nuevos.

27. Subcultivo
y
Líneas
Celulares
CRITERIOS PARA EL SUBCULTIVO
La necesidad de subcultivar una monocapa está determinada por los
siguientes criterios:
A. Densidad del cultivo. Las células normales deben subcultivarse tan
pronto como alcancen la confluencia. Si se dejan más de 24 h, se
retirarán del ciclo y tardarán más en recuperarse cuando se vuelvan a
sembrar. Las células transformadas también deben subcultivarse al llegar
a la confluencia; aunque seguirán proliferando más allá de la confluencia.
B. Agotamiento del medio. El agotamiento del medio generalmente indica
que el medio requiere reemplazo, pero si ocurre una caída en el pH tan
rápidamente que el medio debe cambiarse con más frecuencia, entonces
puede ser necesario realizar un subcultivo.
C. Tiempo desde el último subcultivo. El subcultivo de rutina se realiza
mejor de acuerdo con un programa estricto, de modo que se logre y se
controle un comportamiento reproducible.
D. Requisitos para Otros Procedimientos. Cuando se requieren células
para fines distintos a la propagación de rutina, también deben
subcultivarse para aumentar el stock o cambiar el tipo de recipiente o
medio de cultivo.

28. Subcultivo
y
Líneas
Celulares