La inmunohistoquímica consiste en una serie de métodos para localizar antígenos específicos en tejidos o células basados en la reacción antígeno-anticuerpo. 1) Se prepara la muestra mediante fijación, deshidratación, aclaramiento e inclusión en parafina. 2) Luego se cortan secciones delgadas y se tiñen usando anticuerpos marcados. 3) Esto permite identificar marcadores como la ciclooxigenasa-2, Ki-67 y la osteopontina para diagnosticar en

1. INMUNOHISTOQUIMICA

2. INMUNOHISTOQUIMICA
Inmunohistoquímica consiste en una serie de
métodos para localizar antígenos específicos en
tejidos o células basados en una reacción
antígeno-anticuerpo. Estos métodos tienen sus
bases en tres disciplinas fundamentales: la
histología, la inmunología y la química.
Los métodos inmunohistoquímicos se
desarrollaron a partir de 1941, año en el que
Albert Hewett Coons, describe un método de
inmunofluorescencia para detectar antígenos
celulares en secciones de tejido.
25 años después Nakane, Pierce y Avrameus,
revolucionaron la técnica hasta hacerla práctica,
útil, de fácil realización y aplicabilidad clínica
general, llegando a la inmunohistoquímica
como es hoy.
Albert Hewett Coons

3. La Inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico que se basa
en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado
mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un
sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un
complejo con el antígeno.

4. INMUNOHISTOQUIMICA
UTILIDAD
 Diagnóstico y clasificación de tumores malignos
indiferenciados.
 Marcadores predictivos y pronósticos de tumores
(receptores estrogenicos y Her2 para C.A. de Mama).
 Identificación de agentes infecciosos en tejidos (Virus,
bacterias, hongos, parásitos).
 Clasificación de leucemias y linfomas.
 Determinación del origen de tumores metastáticos.

5. TOMA DE MUESTRA
RASPADO
AGUJA
DISECCION DIRECTA
CATETER
ENDOSCOPIA

6. PREPARACION DE LA
MUESTRA
FIJACIÓN
Permite preservar el tejido del deterioro provocado por
la putrefacción y autolisis derivada de la muerte celular.
El fijador más empleado es el formaldehído en
microscopía de luz, mientras que en microscopía
electrónica se utiliza más el
glutaraldehído.

7. FIJADORES
FIJADORES POR METODOS
FISICOS
FIJADORES POR METODOS
QUIMICOS
Se emplea enfriamiento por
congelación del tejido. Se
utiliza para estudios
morfológicos o funcionales
que requieran conservar
intacta la estructura antigénica
del tejido.
Ej.: liofilización
Los fijadores desnaturalizan e
insolubilizan la proteínas
tisulares, bloqueando la
autolisis por inactivación
enzimática .
Ejemplo: alcohol etílico,
acetona, acido acético

8. FORMALDEHÍDO O FORMOL
 Barato
 Conserva estructura tisular.
 Buen desinfectante y no endurece los tejidos.
 A temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir
de las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas.
 Compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan
rutinariamente en Anatomía patológica

9. INCLUSION
Consiste en sustituir el agua tisular por un medio liquido
capaz de solidificar a fin de proporcionar a la muestra la
consistencia y homogeneidad adecuadas para obtener
secciones muy delgadas mediante un instrumento llamado
micrótomo.
Deshidratación
Tiene como finalidad la eliminación completa del agua de la
muestra tisular para que se pueda embeber en medios de
inclusión.

10. Deshidratación
Parámetros
1. Se emplean una serie de alcoholes de concentración
ascendente (50,70,80,95 y 100%)
2. El volumen del baño debe ser 10 veces superior al
volumen de la muestra que se va a deshidratar.
3. La deshidratación debe ser completa
4. La exposición prolongada al agente deshidratante
provoca un endurecimiento de los tejidos.
5. Se recomienda el empleo de sulfato de cobre anhídrido,
oxido de calcio, resinas humectantes.

11. El principal agente deshidratante es el alcohol etílico.
Otros: alcohol metílico, acetona, alcohol butírico, dióxido de etilo.

12. Aclaramiento o Desalcoholización
Sustitución del agente deshidratante por una sustancia que pueda disolverse con el
medio de inclusión que va a utilizarse.
Principal agente :
Xileno
 Rápido
 Endurece poco los tejidos
 Se elimina fácilmente del medio de inclusión
Desventajas:
 Toxico
 Solo aclara desde alcohol absoluto
 Por mucho tiempo, endurece el tejido

13. Infiltración o impregnación
Una vez que la muestra ha sido totalmente embebida por el xilol
(aclaramiento) se transfiere a un baño de parafina derretida dentro de una
estufa. La estufa es mantenida a 58 grados centígrados (el punto de
fusión de la parafina es 56-57 grados) y la muestra es transferida a través
de tres baños sucesivos de parafina. De esta forma la parafina caliente
desplaza al xilol y difunde dentro de la muestra o tejido. A este paso se lo
denomina Inclusión en parafina.

14. Consiste en la obtención de un
bloque de tejido, mas el medio de
inclusión, mediante el enfriamiento
lento a 10-15°C
Las Estaciones de Inclusión forman los
bloques; formados por:
 Dispensador de parafina liquida
 Placa caliente para la orientación
de las piezas.
 Placa fría para la solidificación del
bloque.
Encastramiento del tejido y confección de los bloques

15. Corte
Las secciones producidas a partir de un tejido en parafina, suelen
tener un espesor entre 4 y 6 micras. Hay secciones mas gruesas de
entre 10 y 20 micras y se emplean para el estudio del sistema
nervioso central.
Los cortes se realizan con el micrótomo.

17. Coloración
COLORACIONES NUCLEARES
Colorantes: Carmin, Safranina, hematoxilina.

18. COLORACIONES CITOPLASMATICAS
Colorantes: Eosina, Floxina, Cromotropo SR.
Colorantes menos específicos que los nucleares, se fijan a los
componentes extracelulares de los tejidos.

19. Consiste en una serie de métodos para localizar antígenos específicos en tejidos o
células basados en una reacción antígeno-anticuerpo
Diagnóstico, clasificación,
identificación, pronóstico de ciertas
patologías
1. Fijación 2. deshidratación 3. Aclaramiento 4. Infiltración 5.
Encastramienot del tejido y confección de bloques 6. Corte
• Cromógeno
• Ciclooxigenasa-2
(COX1 y COX2)
• K i-67
• Osteopontina
Toma de
Muestra
Colorantes:
Carmin,
Safranina,
hematoxilina
Método
Preparación
de la muestra

20. ….. INMUNOHISTOQUIMICA. TECNICAS DE
INMUNOPEROXIDASA
TECNICAS CON AC MARCADOS
Método Directo

21. Método Indirecto

22. METODO DE AVIDINA-
BIOTINA
1. Incubación de los cortes en antisuero primario especifico.
2. Incubación en anticuerpo secundario biotinizado
3. Incubación en solución ABC (complejo avidina-biotina-
peroxidasa).
4. Incubación en Diaminobencidina y peróxido de
hidrogeno.

26. ASPECTOS PRACTICOS EN EL DESARROLLO
DE LA INMUNOHISTOQUIMICA
 El tiempo de fijación debe ser el necesario para
preservar la muestra, el exceso de fijación reduce la
inmunorreactividad del tejido.
 La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis.
 La inclusión en parafina caliente produce perdida de
la antigenicidad.
 La albumina de huevo, gelatina, poli-L-lisina,
cromogel son adhesivos de las secciones de la
muestra al portaobjeto. Un exceso de éste causa el
aumento de tinción inespecífica de fondo.

27. BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ENDOGENA
Se inhibe su actividad por la incubación de secciones con metanol absoluto que
contenga peróxido de hidrogeno al 3%, de 10-30 minutos a temperatura
ambiente.
BLOQUEO DE LA TINCION DE FONDO
 Tinción de fondo especifica
 Tinción de fondo inespecífica

28. Tinción de fondo especifica
 Presencia de Ag en lugares distintos a aquel en que se
quiere detectar.
 El antisuero contenga Ac contra Ag distintos al que se
quiere determinar .
Tinción de fondo inespecífica
Se forma unión no inmunológica del antisuero a ciertos
componentes del tejido, ejemplo: colágeno.
Se evita usando antisuero primario en diluciones muy altas .

29. PENETRACIÓN DE REACTIVOS
Para la escasa penetración se emplea el uso de detergentes como el Tritón X- 100
y la saponina que permeabilizan las membranas.
CONTROLES
Control negativo: se omite el antisuero primario y se reemplaza por suero no
inmune o Buffer.
Control Positivo: se utiliza una sección de tejido donde se encuentre el antígeno a
determinar.

30. CROMOGENO
Actúan como oxidantes y afectan el grado de tinción:
 Luz intensa
 Incremento o disminución de la porción entre el
cromógeno y sustrato.
Recomendaciones:
 El revelado no debe realizarse en condiciones de
iluminación intensa
 El peróxido de hidrogeno no debe exceder una
concentración del 3%.
 El DAB no debe exceder una concentración del 0.5%.

31. CICLOOXIGEASA-2
La ciclooxigenasa (COX) es una enzima
que cataliza la síntesis de
prostaglandinas.
Se han demostrado incrementos en la
expresión de la COX2 en
enfermedades inflamatorias y en
distintas neoplasias como carcinomas
de colon, estomago, esófago, mama ,
pulmón, hígado, ovario y páncreas.
Se ha relacionado al COX-2 en la
carcinogénesis por la estimulación de
la angiogénesis y esto es un proceso
crucial para el crecimiento y expansión
tumoral.

32. K i 67
 Ki-67 es una proteína nuclear
expresada en las células durante
las fases activas del ciclo celular
(G1,S,G2,M). Es empleada para
medir el crecimiento de tejidos
en las neoplasias malignas.
Establece una relación directa
entre la presencia o no de lesión
intraepitelial y la extensión de
células positivas .
 Marcador poco específico
porque su expresión aumenta en
cuadros reactivos epiteliales
(inflamación).

33. OSTEOPONTINA
La osteopontina (OPN) es una glicoproteína sintetizada
por una gran variedad de células, incluyendo:
linfocitos T, macrófagos, células epiteliales, células
endoteliales, células del músculo liso, fibroblastos,
osteoclastos, osteoblastos y células Tumorales.
La OPN media interacciones célula-célula y célula-
matriz.
Es una proteína anti-apoptotica y se sobreexpresa en
una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de
pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer
de estómago, cáncer de ovario, carcinoma papilar de

34. REPORTE
Cuantificación del resultado inmunohistoquímico (J Histoch
2005; 28:89)
 Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las células
“diana” con menor intensidad que el control.
 Positividad débil (+/-): más del 50% de las células “diana” con
menor intensidad que el control.
 Positivo (+): más del 50% de las células “diana” con igual o
mayor intensidad que el control.
El límite de intensidades entre negativo y positividad débil o
positivo se hace por comparación con un control interno
existente

35. REPORTE
Determinación de c-erbB-2/neu en cáncer de mama: análisis comparativo
de la determinación mediante análisis inmunoenzimático (ELISA) e
inmunohistoquímico.
Dra Maria L Lamelas Suarez-Pola , Dr Julio Vázquez , Dr. Luis O González ,
A Rodil , Dra Paula Vérez , Dr Francisco Vizoso y Dr Pablo Raigoso
 0: no tinción
 +: tinción incompleta o débil de membrana
 ++: tinción completa de membrana en al menos el 10% de las células
 +++: fuerte tinción completa de membrana en la mayoría de las células
.

36. Tinción inmunohistoquímica
(++)cerbB2/neu en un carcinoma de
mama (400x)
Tinción inmunohistoquímica
(+)cerbB2/neu en un carcinoma de mama
(400x)
Tinción inmunohistoquímica (+++) de
c-erbB2/neu en un carcinoma ductal
infiltrante de mama (400x)

37. Ki 67
Tesis doctoral caracterización inmunofenotípica del cáncer de
cuello uterino asociado a la infección por virus papiloma
humano (hpv), Morelva Toro de Méndez. universitat de
valencia, 2006.
 El porcentaje de células neoplásicas o normales con reactividad
fue estimado considerando un mínimo de 100 células por disco
tisular. La distribución de las células inmunoreactivas se efectuó
mediante una escala semicuantitativa como se describe a
continuación:

38. KI 67
Negativo: < del 5% de células reactivas.
+: de 5% a <25% de células reactivas.
++: de 25% a 50% de células reactivas.
+++: > del 50% de células reactivas.
 La evaluación de la inmunoreactividad de Ki-67
consideramos esta reacción como baja cuando
observamos menos del 5% de las células teñidas.

39. CICLOOXIGENASA 2
Tesis doctoral: estudio de la expresión
imuohistoquímica de ciclooxigeasa-2 en pacientes
con cáncer avanzado de laringe sometidos a
quimioterapia de inducción, con la intención de
conservar la función fonatoria. Óscar E. Cazorla
Ramos. Málaga, 2008.
 se utilizo un anticuerpo monoclonal de ratón, COX2,
diluido a 1:900.

40. CICLOOXIGENASA 2
Para la cuantificación de COX-2 utilizaron s el método descrito
por Davies y cols.
La expresión de COX-2 fue evaluada, de manera
semicuantitativa, valorando la intensidad de tinción
citoplasmica clasificada en:
- 0: Ausencia de tinción
- 1: débil tinción
- 2: moderada tinción
- 3: fuerte tinción
Posteriormente se realizo una estimación del porcentaje de
células positivas para cada intensidad en 10 campos de
gran aumento. Se multiplico el porcentaje de células que
presentaba cada intensidad de tinción, y el resultado se

41. OSTEOPONTINA
Osteopontin is overexpressed in colorectal
carcinoma and is correlated with P53 by
immunohistochemistry. 2012
JING LI1, GUANG-ZHI YANG, ZI-MAN ZHU, ZHI-YONG
ZHOU and LIN LI1
The expression of OPN and P53 was determined in each
case when positive cells were >10%, since the positive
pattern was often diffuse and similar in staining
intensity.
OPN only displayed weak staining in a few cells and the
ratios were much <10%, therefore all the cases were
determined as negative

42. OSTEOPONTINA EN
TEJIDO DE COLON