1. INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN
VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS
EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)
TRABAJO FINAL DE CARRERA
TITULACIÓN:
INGENIERO AGRÓNOMO
ALUMNO:
JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ
DIRECTORES:
Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ
Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA
Valencia, Diciembre 2011 DIRECTORA EXPERIMENTAL:
Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO
1

2. ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
5. Conclusiones
2

3. INTRODUCCIÓN
3

4. INTRODUCCIÓN
El cultivo del olivo
•España es el mayor productor de aceitunas y de aceite del mundo.
•Las hojas de olivo son un subproducto con escaso valor añadido procedente de la
elaboración del aceite de oliva y de la poda.
•Su uso normalmente está destinado a la alimentación animal y a la quema.
4

5. INTRODUCCIÓN
Compuestos fenólicos
• Las hojas de olivo presentan compuestos polifenólicos con propiedades bioactivas.
• Es necesario procesar las hojas de olivo para obtener extractos ricos en
compuestos polifenólicos.
•El procesado puede influir tanto en los costes del proceso como en la composición
de los extractos.
Oleuropeína Verbascósido
Luteolina Hidroxitirosol
5

6. INTRODUCCIÓN
Métodos de deshidratación
• La deshidratación previa del material vegetal puede favorecer la liberación de
compuestos polifenólicos.
•El secado por aire caliente es una técnica sencilla y rápida.
• La liofilización es una técnica óptima para preservar la calidad pero es muy
costosa.
6

7. INTRODUCCIÓN
Métodos de extracción
• La extracción convencional es una técnica sencilla pero muy lenta.
• La aplicación de ultrasonidos puede facilitar el intercambio de materia entre sólido
y solvente y reducir el tiempo de extracción.
• Es necesario evaluar cómo influye la aplicación de los ultrasonidos en la cinética
de extracción y en la composición de los extractos.
7

8. INTRODUCCIÓN
Digestión in vitro
• Para determinar la bioaccesibilidad y biodisponibilidad es necesario realizar una
simulación gastrointestinal.
• Durante esta etapa se promueve la degradación y/o formación de nuevos
compuestos polifenólicos.
8

9. OBJETIVOS
9

10. OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo fue contribuir a la mejora de la obtención de
extractos naturales a partir de hojas de olivo.
 Determinar la influencia del procesado en la extracción de compuestos fenólicos.
- Deshidratación.
- Aplicación de ultrasonidos en el proceso de extracción.
 Determinar los cambios en la composición de los extractos durante la digestión
in vitro.
- Cinética de los cambios.
- Degradación y/o formación de los compuestos fenólicos.
10

11. MATERIALES Y MÉTODOS
11

12. MATERIALES Y MÉTODOS
Materia prima
-Hojas de olivo (Olea europea L.
var. Serrana).
- Recogidas en el T.M. de Segorbe.
Determinación de la humedad
AOAC, procedimiento 934.01
12

13. MATERIALES Y MÉTODOS
Deshidratación
Secado por aire caliente Liofilización
70°C-55 min 120°C-12 min 24 h
13

14. MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción convencional
Molienda Extracción Centrifugado
30°C 8°C
Solvente etanol-agua ,80% 10 min
24 h 5000 rpm
120 rpm
Almacenamiento Filtrado
14

15. MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción asistida por ultrasonidos
Controlador
Sonda
Ordenador
ultrasónica
Bomba
Vaso de
Equipo de Depósito- vidrio con
refrigeración pulmón camisa
15

16. MATERIALES Y MÉTODOS
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
Determinación de la potencia aplicada
dT
P ( )  m Cp 
W
t
m Masa de solvente 35
30
Temperatura (°C)
25
Cp Calor específico del 20
solvente 15
y = 0,0668x + 19,3270
10
R² = 0,9993
Incremento de
dT/dt temperatura
5
respecto al tiempo 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo (s)
16

17. MATERIALES Y MÉTODOS
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Amplitud Ø de sonda ultrasónica
60% 80%
40%
100% 40 mm 22 mm 14 mm
Temperatura Tiempo
40 min
50
45 35 min 5 min
40
35
30 30 min 10 min
25
25 min 15 min
20 min 17

18. MATERIALES Y MÉTODOS
EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS
Modelización
Cinéticas de extracción de compuestos fenólicos
Modelo de Naik
Y t
Y
Bt
Y Contenido fenólico en
el equilibrio
t Tiempo de extracción
Tiempo necesario
para alcanzar la
B mitad del contenido
fenólico en el
equilibrio 18

19. MATERIALES Y MÉTODOS
Digestión in vitro
-Adición de pepsina
Toma de
muestras Digestión gástrica - pH 2
-Temperatura: 37°C
1ª h
2ª h -Adición de
3ª h pancreatina y sales
biliares
4ª h Digestión intestinal
- pH 7
-Temperatura: 37°C
19

20. MATERIALES Y MÉTODOS
Propiedades bioactivas
CONTENIDO TOTAL EN COMPUESTOS FENÓLICOS
MÉTODO FOLIN-CIOCALTEU
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
MÉTODO FRAP
MÉTODO TEAC
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS MAYORITARIOS
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-DAD)
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS-MS)
20

21. MATERIALES Y MÉTODOS
Hojas de olivo
Deshidratación
120°C 70°C Liofilización
Extracción
Extracción
asistida por
convencional
ultrasonidos
POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC
Digestión in vitro
-Digestión gástrica (1ª y 2ª h)
-Digestión intestinal (3ª y 4ª h)
POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC
21

22. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
22

23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia del método de deshidratación
Contenido total en fenoles
Método de deshidratación Compuestos fenólicos (mg GAE/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 66±3a
Aire caliente 70°C-55 min 42±3b
Liofilización-24 h 33±3c
Tabla 4.1. Contenido de fenoles totales de los extractos procedentes de hojas de olivo
deshidratadas.
• Con el secado por aire caliente se obtuvieron extractos con mayor contenido fenólico que
con las muestras liofilizadas.
• Conforme aumentó la temperatura de secado los extractos presentaron mayor contenido
total en fenoles.
23

24. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Capacidad antioxidante
Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 92±7a
MÉTODO FRAP Aire caliente 70°C-55 min 87±6a,b
Liofilización-24 h 75±4b
Tabla 4.2. Capacidad antioxidante (FRAP) de los extractos procedentes de hojas de olivo
deshidratadas.
Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)
Aire caliente 120°C-12 min 6,26±0,22a
MÉTODO TEAC
Aire caliente 70°C-55 min 5,12±0,37a,b
Liofilización-24 h 4,65±0,49b
Tabla 4.3. Capacidad antioxidante (TEAC) de los extractos procedentes de hojas de olivo
deshidratadas.
24

25. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Identificación de compuestos bioactivos
Los compuestos mayoritarios son
Absorbancia (UA)
Oleuropeína, verbascósido y
luteolina-glucósido
Tiempo de retención (min)
Figura 4.1. Cromatograma a 280 nm de extracto de hoja liofilizada.
25
Tabla 4.4. Tiempos de retención de los compuestos fenólicos presentes en el extracto de hoja de
olivo.

26. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Cuantificación de compuestos bioactivos
Oleuropeína 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Medias y
80
Concentración (mg/g m.s.)
A
70
60
50
40
30
20
120°C 70°C LF
Tratamiento • Las muestras secadas a 120°C
presentaron los mayores contenidos de
Verbascósido 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
Medias y oleuropeína y verbascósido.
20
Concentración (mg/g m.s.)
B
16
12
8
4
0
120°C 70°C LF
Tratamiento
Figura 4.2. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para la 26
concentración de oleuropeína (A) y de verbascósido (B).

27. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
Luteolina-glucósido
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
• La luteolina-glucósido prácticamente
Concentración (mg compuesto/ g m.s.)
11
no se vio afectada por el método de
10
deshidratación.
9
8
• La sensibilidad de los diferentes
7
compuestos fenólicos al estrés
120°C 70°C LF ocasionado por la deshidratación es
Tratamiento diferente.
27

28. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aplicación de ultrasonidos de potencia
en el proceso de extracción
Selección de variables óptimas
Amplitud eléctrica (%) Potencia aplicada (W)
Amplitud 40 13
60 19
80 24
100 28
Figura 4.3. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos
de los extractos de hoja de olivo para diferentes amplitudes
eléctricas.
Figura 4.4. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos
28
de hoja de olivo para diferentes amplitudes eléctricas.

29. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Diámetro de sonda ultrasónica
Diámetro de sonda ultrasónica (mm) Potencia aplicada (W)
14 28
22 51
40 33
Figura 4.7. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de
los extractos de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda
ultrasónica.
Figura 4.8. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos
de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda ultrasónica. 29

30. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Temperatura de extracción
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
78
CA (mg TROLOX/g m.s.)
75
72
69
66
63
60
25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C
Temperatura
Figura 4.10. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos
de los extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas.
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
42
CTF (mg GAE/g m.s.)
40
38
36
34
32
25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C Figura 4.11. Evolución de la capacidad antioxidante de los
Temperatura extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas. 30

31. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Tiempo de extracción
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
88
CA (mg TROLOX/g m.s.)
83
78
73
68
63
58
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
Tiempo
Figura 4.13. Evolución del contenido de compuestos fenólicos
totales de los extractos de hoja de olivo para diferentes tiempos
de extracción.
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
46
CTF (mg GAE/g m.s.)
43
40
37
34
31
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min
Tiempo Figura 4.14. Evolución de la actividad antioxidante de los extractos de
hoja de olivo para diferentes tiempos de extracción. 31

32. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS
Modelización
Amplitud
Diámetro de sonda ultrasónica
Temperatura
32

33. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
Influencia en la cinética de extracción
50
40
US Extracción estática
CFT (mg GAE/g m.s.)
Extracción convencional
30
US
20 Extracción convencional
10 Extracción estática
80
0
0 3 6 9 12 15 US
Tiempo (min) 70
Figura 4.16. Influencia del método de extracción en la evolución del 60
contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo. Extracción estática
CA (mg TROLOX/g m.s.)
50 Extracción convencional
Extracción convencional
US
40
30
Extracción estática
20
10
0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (min)
Figura 4.17. Influencia del método de extracción en la evolución de la
actividad antioxidante de extractos de hoja de olivo. 33

34. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA
INFLUENCIA EN LA CINÉTICA DE EXTRACCIÓN
Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
40
A
- Los extractos finales mostraron un
CTF (mg GAE/g m.s.)
38
contenido fenólico similar.
36
34
32 Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD
30 76
CA (mg TROLOX/g m.s.)
B
Convencional US
74
Extracción
72
70
- La aplicación de ultrasonidos
permitió obtener extractos con una 68
capacidad antioxidante ligeramente 66
superior. Convencional US
Extracción
Figura 4.18. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para el contenido total
de compuestos fenólicos (A) y capacidad antioxidante (B).
34

35. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia en la Composición de los extractos
Extracción convencional
V
A
O
L
Absorbancia (UA)
Extracción asistida por ultrasonidos
V
B O
L
Absorbancia (UA)
Tiempo de retención (min)
- La aplicación de ultrasonidos
permitió obtener extractos con un
perfil fenólico idéntico a los
obtenidos con extracción
convencional. Tiempo de retención (min)
Figura 4.19. Cromatograma a 280 nm de extracto procedente de hoja
secada a 120°C y obtenido de forma convencional (A) y con aplicación de
ultrasonidos (B).
35

36. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Influencia de la digestión in vitro en las
propiedades de los extractos
Contenido total en fenoles
• La digestión in vitro redujo la cantidad de
compuestos fenólicos en el extracto,
especialmente durante la primera hora de la
digestión.
• La mayor reducción correspondió a los
Figura 4.20. Evolución del contenido total de compuestos
extractos procedentes de muestras secadas
fenólicos durante la digestión in vitro. a 120°C mientras que la menor a las
muestras liofilizadas.
36

37. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Capacidad antioxidante (FRAP)
• La capacidad antioxidante medida
con FRAP de los extractos no varió
prácticamente durante la digestión
gástrica.
• Sin embargo, a lo largo de la
Figura 4.21. Evolución de la capacidad antioxidante (FRAP)
digestión intestinal (3ª h) se produjo
durante la digestión in vitro. un incremento de la capacidad
antioxidante.
Capacidad antioxidante (TEAC)
• La mayor reducción de la
capacidad antioxidante (TEAC) se
produjo durante la primera hora de
la digestión.
Figura 4.22. Evolución de la capacidad antioxidante (TEAC) 37
durante la digestión in vitro.

38. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Identificación de los principales compuestos fenólicos
Extracto inicial Extracto digerido
A
B
VL O
Absorbancia (UA)
Absorbancia (UA)
L
O
Tiempo de retención (min) Tiempo de retención (min)
Figura 4.23. Cromatograma a 280 nm de extractos iniciales (A) y digeridos (B) procedente de hoja secada a 70°C.
38

39. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Cuantificación de los principales compuestos fenólicos
Oleuropeína
• La oleuropeína descendió a lo
largo de toda la simulación,
especialmente durante la primera y
tercera hora de la digestión.
• Todos los extractos presentaron
una reducción de oleuropeína
Figura 4.24. Evolución de la concentración de oleuropeína durante la
digestión in vitro.
superior al 86%.
39

40. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS
Verbascósido
• El verbascósido descendió de
forma moderada durante la primera
hora de la digestión y prácticamente
desapareció durante la tercera hora
de la digestión.
•Los extractos “120°C” mostraron la
mayor degradación de oleuropeína
y verbascósido, mientras que los
extractos “LF” mostraron la menor al
Figura 4.25. Evolución de la concentración de verbascósido durante la
digestión in vitro.
final de la simulación.
40

41. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO
Luteolina-glucósido
12
10
•La luteolina glucósido de los
extractos sufrió una menor
8
degradación que la oleuropeína y el
mg/ g m.s.
6
LF
120 °C-US
verbascósido
70 °C
4
120 °C
2 •Este compuesto se redujo de forma
0
considerable durante la primera
0 60 120
Tiempo digestión (min)
180 240
hora de la digestión (40%).
Figura 4.26. Evolución del contenido de luteolina-glucósido durante la
digestión in vitro.
41

42. CONCLUSIONES
42

43. CONCLUSIONES
• El método de deshidratación de la hoja de olivo influyó en la composición de
los extractos. La liofilización fue la técnica que conllevó una mayor
degradación de los compuestos fenólicos, mientras que el secado por aire
caliente a 120°C fue el método que de deshidratación que mejor preservó estos
compuestos.
•La oleuropeína y el verbascósido presente en los extractos varió en función del
método de deshidratación aplicado, mientras que el contenido de luteolina-
glucósido fue muy similar para todos ellos. Esto indica que la sensibilidad de los
distintos fenoles de la hoja de olivo al estrés producido por la deshidratación es
diferente.
• Una eficiente aplicación de ultrasonidos durante el proceso de extracción
permitió acortar de manera drástica el tiempo de tratamiento. Así, con
únicamente 15 minutos de tratamiento de aplicación ultrasónica, se obtuvieron
un contenido total fenólico y capacidad antioxidante similar que con 24 horas
de extracción convencional. Estos resultados muestran el potencial de esta
tecnología para mejorar la productividad de este proceso a nivel industrial.
43

44. CONCLUSIONES
• La aplicación de ultrasonidos no varió el perfil polifenólico de los extractos,
ya que no se identificaron prácticamente diferencias respecto a los extractos
obtenidos de forma convencional. Así, la energía ultrasónica no implicó la
formación de nuevos compuestos.
• El contenido total fenólico y la capacidad antioxidante de los extractos se
redujeron durante la digestión in vitro. Los cambios más importantes
ocurrieron durante la primera y tercera hora de dicha simulación.
• La digestión in vitro redujo de forma considerable la oleuropeína presente en
los extractos, mientras que el verbascósido prácticamente desapareció. La
luteolina-glucósido fue el compuesto más estable durante la digestión. Estos
resultados sugieren la posibilidad de proteger los extractos de hoja de olivo con
técnicas de micro o nanoencapsulación para evitar la degradación de los
polifenoles más sensibles a la digestión gastrointestinal.
44

45. INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN
VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS
EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)
TRABAJO FINAL DE CARRERA
TITULACIÓN:
INGENIERO AGRÓNOMO
ALUMNO:
JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ
DIRECTORES:
Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ
Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA
Valencia, Diciembre 2011 DIRECTORA EXPERIMENTAL:
Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO
45