Técnicas de análisis instrumental en enología

TÉCNICAS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL EN ENOLOGÍA
acangi-MAGSRL Página 1 08/03/16
Conocer y aplicar las técnicas de análisis instrumental, que son más comunes en los laboratorios de las bodegas o asesorías
vitivinícolas. Para ello hay que conocer el fundamento teórico de las técnicas, además de saber interpretar los procedimientos de
análisis y llevarlos a la práctica.
Dado que estas técnicas analíticas están en constante evolución, es necesario insistir en que hay que comprender a la perfección
sus fundamentos teóricos. Esta circunstancia favorecerá nuestra adaptación a los continuos avances en el equipamiento
instrumental.
- Conceptos generales de caracterización del análisis instrumental.
- Conocer las técnicas basadas en métodos electroanalíticos, como la determinación de pH y las aplicaciones potenciométricas.
- Las técnicas ópticas espectroscópicas y no espectroscópicas, en las que debemos familiarizarnos con determinaciones de color,
ácido málico o análisis de turbidez y refractometría.
- El fundamento y la aplicación de las técnicas cromatográficas, de gran importancia actual y de cara al futuro.
- Identificar las distintas técnicas de análisis instrumental, con aplicación en el ámbito del análisis enológico.
- Conocer el fundamento y las especificaciones de cada técnica, para poder adecuarnos a los cambios continuos de este tipo de
técnicas, sin que sea necesario un periodo de formación cada vez que se cambia el equipo o se mejora la técnica. Además un
mismo tipo de equipo puede ser utilizado para fines muy diferentes, según las necesidades.
- Aplicar estas técnicas en el laboratorio siguiendo los procedimientos, teniendo en cuenta el código de buenas prácticas y
obteniendo unos resultados acordes con el problema planteado.
- Llevar a cabo o establecer un programa de mantenimiento de estos equipos, de manera que se garantice la fiabilidad de los
resultados y la duración de los mismos.
ANÁLISIS INSTRUMENTAL
En los laboratorios enológicos cada vez hay menos material y equipos clásicos, que van siendo sustituidos por aparatos e
instrumentos electrónicos.
En efecto, los avances tecnológicos y los trabajos de investigación, nos demuestran que pese a la elevada inversión inicial que
supone la adquisición de equipos de análisis instrumental, su rentabilidad es indiscutible siempre y cuando el volumen de muestras
sea el suficiente.
La elección, mantenimiento y buen uso de los modernos equipos de análisis, requiere una comprensión de cuales son los principios
fundamentales en los que se basan. Sólo de esta manera es posible aplicar los procedimientos con un espíritu crítico, eligiendo la
mejor opción y conscientes de que también tienen limitaciones. Además, en la mayoría de los casos, siguen necesitando de un
proceso de preparación de la muestra, lo que asocia el análisis instrumental a los procesos habituales y clásicos de laboratorio.
Una de las ventajas de las técnicas instrumentales, es que van abriendo el camino a la posibilidad de implantación de métodos
automáticos de análisis. Por ejemplo, en el control de materia prima en la recepción de una bodega, donde una sonda extrae una
muestra y analiza el contenido en azúcares, pH y testigos de podredumbre (actividad enzimática).
En la actualidad existen equipos de análisis automático (autoanalizador) que pueden realizar una analítica completa del mosto en
cuestión de minutos. Obteniendo una información que nos abrirá un abanico de posibilidades a la hora de decidir como procesar
las uvas, además de poder aceptar o rechazar la partida analizada.
Otra posibilidad, que nos da el desarrollo de técnicas instrumentales, es la monitorización de los procesos de elaboración, donde,
en una pantalla, se nos permite observar instantáneamente, los parámetros analíticos de cada parte del proceso, permitiéndonos
tomar decisiones sin tener que esperar a los resultados analíticos.
Las técnicas actuales de análisis instrumental son muchas y muy diversas, por lo que es necesario centrarse en aquéllas que tienen
una aplicación en los laboratorios enológicos. Aún así debemos ser conscientes de que es un campo en constante evolución, lo
que supone que técnicas que hoy en día no son usuales en los laboratorios enológicos, en un futuro próximo se pueden convertir en
habituales.
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS INSTRUMENTALES
La importancia de las clasificaciones radica en que agrupar técnicas con un fundamento común, facilita su estudio y comprensión.
Ya que según la finalidad o información que se busca con el análisis, podemos clasificar las técnicas analíticas en cualitativas y
cuantitativas y que, según cual sea la propiedad medida, hablamos de análisis gravimétrico, volumétrico e instrumental.
El análisis instrumental puede tener una finalidad cualitativa, cuantitativa o ambas. Según la propiedad que se va a medir y
simplificando mucho, hablaremos de métodos ópticos, métodos electroanalíticos y métodos cromatográficos.
Casi todos ellos tienen aplicación en el campo analítico de la enología, aunque no en los laboratorios de control de una bodega o
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asesoría vitivinícola.
1. Métodos ópticos: La señal medida está relacionada con la radiación electromagnética.
- Absorción de radiación.
- Emisión de radiación.
- Dispersión de la radiación.
- Refracción.
- Rotación.
2. Métodos electroanalíticos: La señal está relacionada con parámetros eléctricos como:
- Potencial eléctrico.
- Carga eléctrica.
- Resistencia eléctrica.
- Razón masa - carga.
- Otros.
3. Métodos cromatográficos: En realidad se trata de métodos de separación de componentes, pero que siempre necesitan alguno
de los métodos anteriores como paso final para obtener una medida analítica.
- Cromatografía de líquidos.
- Cromatografía de gases.
- Cromatografía de fluidos supercríticos.
PARÁMETROS DE TRABAJO EN ANÁLISIS INSTRUMENTAL
Es necesario fijar cuáles son las características de funcionamiento que necesitamos que cumplan los instrumentos analíticos.
La manera más directa de hacerlo es, definir unos criterios cuantitativos que te permitan saber y decidir si un determinado método
instrumental, es el más adecuado para resolver el problema analítico al que nos enfrentemos.
Los términos numéricos que definen estos criterios, son los parámetros de calidad para un trabajo determinado y nos permiten elegir
entre los métodos instrumentales disponibles, descartando aquellos que no cumplan con estos parámetros. Los parámetros más
importantes son:
- Precisión: Si analizamos una misma muestra un número determinado de veces y de la misma forma, entendemos como precisión,
el grado de concordancia entre los resultados obtenidos.
Los parámetros de calidad para evaluar la precisión, son términos estadísticos como la desviación estándar, la desviación
relativa de la media o la varianza.
- Exactitud: Entendida como la diferencia existente entre el valor medio del resultado obtenido y el valor real de la magnitud medida.
Para evaluarla es necesario recurrir a patrones de referencia. Los parámetros de calidad para evaluar la exactitud se basan en
cuantificar el error sistemático. Se suelen corregir mediante calibración o mediante el ajuste con un blanco.
- Sensibilidad: Entendida como la capacidad que tiene un equipo, para distinguir entre dos muestras con características muy
próximas. Los factores de calidad para evaluar la sensibilidad, están asociados al resultado de la calibración, sobre todo a la
pendiente de la curva de calibración cuando es lineal.
- Límite de detección: Es la cantidad o concentración mínima de analito que es capaz de detectar el equipo. Como parámetro de
calidad se busca que el límite de detección, sea el que corresponda a una lectura igual a la lectura del blanco más 5 veces su
desviación estándar.
Además de estos criterios, es necesario tener en cuenta la capacidad del equipo para ser selectivo con el analito que se pretende
determinar y, por supuesto, que permita adaptarse al rango de concentraciones de las muestras para las que se destina.
Cuando son varios los equipos cuyos parámetros cumplen con los requisitos exigidos, se pueden tener en cuenta otra serie de
características como coste, rapidez, tamaño, etc. que completarán el proceso de elección del equipo más adecuado.

ESTANDARIZACIÓN Y CALIBRACIÓN
En la actualidad, con la implantación de sistemas de control de la calidad en los laboratorios analíticos, las normas de certificación y
acreditación de competencia (ISO-EN 9000, ISO-EN 17025, etc.) y las exigencias de trazabilidad, hacen que estos términos sean
relevantes en las funciones del laboratorio.
- Estándar: Es un término adaptado de la lengua inglesa, sinónimo de patrón.
- Estandarización: Significa comparación de un valor con un patrón de referencia y puede ser aplicado a un equipo, a un método
analítico o simplemente a una disolución. Este término es usado, al establecer la concentración de una disolución frente a un patrón
primario, empleando el término de valoración o estandarización indistintamente.
- Calibración: Es un término definido por la norma ISO como "el conjunto de operaciones que permiten establecer, en determinadas
condiciones experimentales, la relación que existe entre los valores indicados por un aparato o sistema de medida, con los valores
obtenidos de la medida de un valor conocido."
Es una operación de comparación entre la respuesta obtenida con la muestra problema y la obtenida con un patrón de valor
conocido.
Ambas definiciones son muy semejantes, por lo que los términos de estandarización y calibración son empleados en los laboratorios
indistintamente, para comprobar la fiabilidad de los resultados analíticos, sobre todo, en técnicas de análisis instrumental.
Los equipos se deben calibrar, ya que esta necesidad obedece a que los componentes envejecen, a que el funcionamiento está
condicionado por la humedad y temperatura de los locales, así como por el trato de los operarios y operarias del laboratorio. Estos
factores hacen que sus funciones sufran un deterioro paulatino, lo que supone una pérdida de fiabilidad de los resultados obtenidos.
Para evitarlo se recurre al calibrado.
Una correcta calibración, proporciona resultados acordes a las especificaciones de cada equipo.

Existen diferentes procedimientos de calibrado:
- Procedimientos absolutos: Se basan en relacionar la señal del aparato con una magnitud física y realizar el ajuste de la escala o
sistema de medida. La calibración de una balanza con una pesa patrón o la de un refractómetro con agua destilada, son ejemplos
de este tipo de calibración.
- Procedimientos estequiométricos: Se trata de aplicar un mismo procedimiento analítico a un patrón valorado y a una muestra
con relación definida entre ellos. La valoración de un reactivo para volumetría es un buen ejemplo.
- Procedimientos comparativos: Se aplica el mismo procedimiento a patrones y muestras, relacionándolos mediante una función
numérica o gráfica. Este procedimiento es el que se aplica mayoritariamente en análisis instrumental. Los equipos de análisis están
compuestos por una serie de componentes con funciones específicas, que sería necesario calibrar individualmente lo cual resultaría
lento y costoso, por lo que se recurre a calibrar el equipo en su conjunto. En muchos casos, la calibración del equipo es una parte
del procedimiento de análisis. En otros, los aparatos están equipados con sistemas de autocalibrado, introduciendo una muestra
patrón cada x muestras.
Las operaciones de calibrado deben de establecerse de acuerdo a un procedimiento y registrarse para garantizar la trazabilidad de
los resultados analíticos.
MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS
Se trata de métodos que se basan en las propiedades eléctricas que presenta una disolución del analito cuando forma parte de una
celda electroquímica, por lo que también se denominan electroquímicos de análisis. Al tratarse de procesos de oxidación -
reducción.
Una celda electroquímica consiste en 2 electrodos, cada uno sumergido en una solución electrolítica y unidos externamente
mediante un conductor. Según la teoría de los procesos redox, cuando ponemos en contacto dos electrolitos con potencial redox
diferente, uno actuará como oxidante y otro como reductor, generándose una transferencia de electrones, cedidos por el reductor y
aceptados por el oxidante. Si cerramos el circuito mediante un puente salino, obtenemos una diferencia de potencial entre los
electrodos, que es proporcional a las concentraciones de los electrolitos (ecuación de Nerst).
Los aparatos de electroanálisis, amplifican la señal eléctrica generada, para relacionarla con la concentración de un electrolito en
disolución.

Los métodos electroanalíticos con más aplicación en enología, son los métodos potenciométricos, ya que pueden ser usados tanto
para poner de relieve el punto final de una volumetría, como para una medida directa del pH o el potencial redox. Los equipos
utilizados se denominan potenciómetros.
Para poder medir el potencial eléctrico de una disolución, necesitamos un sistema formado por una celda electroquímica de
potencial constante, de manera que al introducirlo en una solución electrolítica, será cuando su potencial se modifique de forma
proporcional a la concentración de dicha solución.
Esta celda está formada por un electrodo indicador, sensible a un determinado tipo de iones y un electrodo de referencia, de
potencial fijo, unidos por un conductor e inmersos en sendas soluciones electrolíticas. Mediante conductores metálicos se completa
el circuito de amplificación de la señal y salida a la pantalla informativa.
- Electrodos indicadores: El más común es el electrodo de vidrio, sensible a la concentración de H+, por lo que es utilizado para
mediciones de pH. También se utilizan, aunque menos, los electrodos de platino para medidas de potenciales redox o para
seguimiento de volumetrías de oxidación - reducción. También se pueden adquirir, electrodos selectivos de iones, específicos para
diversos iones como Cl-, F-, NO2-, NH4+, etc.
- Electrodos de referencia: Los más comunes son los de plata - cloruro de plata y el de calomelanos.
DETERMINACIÓN DE PH
El concepto de pH es un término habitual en la vida cotidiana (pH de los productos higiénicos, de los cosméticos, de los alimentos,
del agua, etc.). Para su determinación en una disolución, vino, mosto o cualquier otro producto derivado, se utiliza un método
potenciométrico, denominándose pH-metro (también peachímetro) al equipo de medida del mismo.
La el cálculo es pH = -log[H+] y por otra banda, el potencial de semicelda, según la ecuación de Nerst para la semireacción 2H+ +
2e- ↔→ H2 es:
Sustituyendo los valores de R, n y F, a 25º C (298 K) y combinando con la definición de pH, nos queda como E = -0,059 pH
Por lo tanto, para saber el valor del pH de una disolución, podemos recurrir a un potenciómetro, pues existe una relación directa
entre el potencial y el pH. Es importante reseñar, que esta relación numérica depende de la temperatura, por lo que es necesario
indicarla para que el equipo realice la corrección correspondiente.
Un pH-metro es un potenciómetro, capaz de medir el potencial dependiente de la concentración de Hidrogeniones (H+), en
una disolución problema y cuya escala está graduada en unidades de pH.
Para la determinación del pH, necesitamos un electrodo indicador, sensible a la variación de la concentración de H+ y un electrodo
de referencia. Ambos electrodos deben tener unas características constructivas que no se alteren al contacto con la disolución del
analito.
Como indicador para medidas de pH se utiliza el electrodo de vidrio y para el de referencia se suele usar el electrodo de plata-
cloruro de plata. Para facilitar el uso de este tipo de electrodos, se construyen electrodos combinados, que incluyen en una misma
carcasa el electrodo de vidrio y el de referencia. Cuando veamos o trabajemos con un medidor de pH, observaremos que aunque
parezca que sólo lleva un electrodo, en realidad se trata de un electrodo combinado.
Debido a que el electrodo sufre una degradación paulatina, es necesario calibrarlo antes de su uso. Para ello, se deben seguir las
instrucciones de uso o la instrucción técnica correspondiente, pues cada equipo lleva una secuencia de teclas o acciones diferentes.
En todo caso, deberemos de seleccionar la calibración con soluciones tampón de pH lo más próximo posible al pH de la muestra.
Las soluciones tampón deben de ser trazables frente a SRM de NIST (Standard Reference Materials del National Institute of
Standards and Tecnology), con precisión ± 0.02, encontrándose en el mercado en monodosis, cápsulas de soluciones concentradas
o listas para usar. Deberás controlar su fecha de caducidad y el certificado de análisis.

EL ELECTRODO DE VIDRIO Y REFERENCIA
El electrodo de vidrio es en la actualidad, el sistema más extendido para la determinación del pH por métodos electroanalíticos.
Pero para poder actuar como electrodo indicador, necesita de un electrodo de referencia, siendo en este caso el electrodo de
calomelano el más usado.
Actualmente se continúa investigando sobre la optimización de estos electrodos y sus posibles sustitutos, pero de momento, no
existe otro sistema para la medición electroanalítica que tenga la misma versatilidad y precisión.
El electrodo de vidrio, como electrodo indicador de pH, fue identificado por M. Cremer en 1906 y posteriormente por F. Haber (1909)
y otros investigadores, que se dedicaron a investigar sobre la composición del vidrio, intentando mejorar la sensibilidad a la variación
de pH modificando la composición del mismo. Pero su utilización como electrodo es posterior, cuando se incorporó el tubo de vacío
que permite la medida de las variaciones de potencial generadas.
Los electrodos empleados en la actualidad tienen como base un vidrio altamente sensible.
El electrodo de vidrio está constituido por las siguientes partes:
- Un tubo soporte del electrodo, de vidrio común (o plástico), no conductor de cargas eléctricas.
- Un bulbo sensible en el extremo inferior, que es el elemento sensible del electrodo, fabricado con vidrio polarizable, sensible a la
variación de la concentración de hidrogeniones. El vidrio polarizable es un conductor de cargas eléctricas, porque en su composición
tiene óxido de litio, además de óxido de silicio, de calcio y algunos otros óxidos.
- Un electrodo metálico de plata y cloruro de plata, que servirá de conductor al potencial generado hasta el sistema de amplificación.
En el interior del bulbo hay una disolución ácido clorhídrico diluido, saturado de cloruro de plata, lo que constituye una disolución
tampón de pH invariable.
En la estructura del vidrio existen iones de litio y sodio, que se pueden mover entre los intersticios de la red tridimensional formada
por grupos SiO46-. Estos iones monovalentes, son los responsables de la conducción eléctrica en el seno del vidrio.
Este tipo de vidrio es higroscópico, por lo que debe de estar hidratado para que funcione como sensor de pH. Al hidratarse se
produce una reacción de intercambio entre los iones monovalentes del vidrio y los cationes del agua.

Donde Vd- representa el grupo aniónico del vidrio.
Con el vidrio hidratado, al sumergirlo en una disolución se establecen dos interfases en la cara interna y externa del vidrio. En el
interior seco del vidrio, los portadores de la carga son los cationes sodio.
En la interfase interna el equilibrio se establece según el proceso:
siendo Hi+ los hidrogeniones de la solución interna del electrodo.
En la interfase externa el equilibrio establecido será:
siendo He+ los hidrogeniones de la solución externa en la que está inmerso el electrodo.
Por lo tanto las posiciones de estos dos equilibrios están determinadas por las actividades (concentraciones) de los hidrogeniones
en las disoluciones interna y externa del electrodo, de tal manera que la interfase en la que tiene lugar más disociación, se
transforma en negativa respecto a la otra superficie. De esta manera, se establece una diferencia de potencial entre la interfase
interna y externa, denominado potencial límite (El), que es el parámetro que usamos para medir el pH con un electrodo de vidrio.
El papel del electrodo de plata / coluro de plata del electrodo de vidrio y el electrodo de referencia externo al electrodo de vidrio, es
el de servir de contactos eléctricos para poder medir el potencial.
El potencial del electrodo de vidrio, será pues el resultante de los dos potenciales de las interfases, el potencial del electrodo de
plata/cloruro de plata interno y el llamado potencial de asimetría.
El potencial de la interfase externa viene dado por la ecuación de Nerst para el sistema:

De igual manera, el potencial de la interfase interna será:
En las que k1 y k2 son constantes, a'1 y a'2 son las actividades del H+ en las interfases externa e interna y a1 y a2 son las
actividades del H+ en las soluciones externa e interna.
Para una membrana de vidrio polarizable homogénea, k1 y k2 son idénticas al igual que a'1 y a'2. Teniendo en cuenta estos valores,
el potencial del electrodo vendrá dado por la expresión:
Como en un electrodo de vidrio, la actividad del H+ interno a2 se mantiene constante, se simplifica la expresión anterior:
o lo que es lo mismo
y donde
El potencial del electrodo de plata/cloruro de plata interno es estable, al ser un electrodo de referencia.
Existe un tercer potencial denominado de asimetría, que se encuentra en la mayoría de los electrodos de membrana, cuya causa no
está del todo clara y que cambia lentamente con el tiempo.
Teniendo en cuenta estos dos potenciales, el potencial del electrodo de vidrio será:
donde
Evidentemente, para poder medir el potencial del electrodo de vidrio se necesita compararlo con un electrodo de referencia,
generalmente de calomelano, cuyo potencial es fijo e independiente del pH. En los electrodos combinados, este electrodo se incluye
en una misma carcasa de vidrio o plástico, que incluso puede incluir también un sensor de temperatura. Para usos industriales se
usan electrodos separados.
Los electrodos de vidrio y el de referencia externo, se conectan a un circuito de amplificación y medida del potencial.

Como es difícil valorar la variación de los valores de L, necesitamos calibrar los equipos de medida frente a patrones de valor de pH
conocido antes de usarlos.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PH
Para medir el pH de un vino o un mosto, debemos de proceder con sutileza, pues a pesar de ser una determinación sencilla, la
exactitud de su resultado es de gran importancia para otros aspectos enológicos. El procedimiento es el siguiente:
Material y reactivos:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura.
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7 con aproximación de 0.01 unidades.
- Agitador magnético.
Preparación del equipo de medida:
1. Enciende el equipo y comprueba que las señales son correctas.
2. Acopla el electrodo combinado y la sonda de temperatura, conectando los cables en las clavijas correspondientes, procurando
sujetarlos por los conectores y sin tirar nunca del cable. Lo más habitual es que cada equipo disponga de un soporte específico para
colocar el electrodo y la sonda, siendo importante asegurarse de que la sujeción es firme, para evitar el deterioro del mismo.
3. Saca el tapón protector lateral del orificio de rellenado del electrodo.
4. Retira el capuchón protector del electrodo y comprueba su estado y limpieza. Si lleva tiempo sin usarse o estuvo almacenado en
seco, será necesario hidratarlo, sumergiéndolo en agua destilada o mejor en una solución tampón, según las instrucciones del
fabricante.
5. Lava con agua destilada y comprueba que la sonda de temperatura funciona.
6. Calibra el equipo con las soluciones tampón de pH 4 y 7.
Procedimiento de análisis:
1. Con vino y mosto opera directamente sobre el líquido. Si se trata de mosto concentrado, diluye con agua destilada hasta 25 ± 0,5
ºBrix (25 % m/m en azúcares totales). En todo caso debes de homogeneizar la muestra.
2. Llena un vaso de precipitado o el vaso específico del equipo con un volumen suficiente para que cubra el orificio del puente salino
del electrodo combinado. En caso de utilizar agitador magnético, evita que el imán tropiece con el electrodo.
3. Pulsa el botón de lectura, esperando a que la lectura sea estable y anota la misma con dos decimales.
4. Realiza la determinación por duplicado.
5. Lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector con líquido de conservación, según indicaciones
del fabricante.
Cálculos:
El resultado será la media aritmética de las dos lecturas, expresada con dos decimales.
ACIDEZ POR POTENCIOMETRÍA
El procedimiento para determinar la acidez total, se basa en una volumetría de neutralización con una solución valorada de hidróxido
de sodio.
Para comprobar el punto final de esta valoración, podemos utilizar un indicador como el azul de bromotimol, pero la percepción del
viraje del indicador no siempre es fácil de distinguir. Piensa en que para que el ojo humano perciba un cambio de color, debe de
existir una proporción mínima de 1 a 10 del nuevo color sobre el inicial. Esta circunstancia implica que en vinos tintos o vinos

blancos y rosados con mucha intensidad colorante, el cambio de color no se perciba con nitidez. Todo ello implica que el error de
valoración aumenta.
Por ello, podemos recurrir a la utilización de un potenciómetro (pH-metro, en este caso), ya que a medida que añadimos hidróxido
de sodio vamos modificando la concentración de H+ o, lo que es lo mismo, el pH.
El método oficial para la determinación de la acidez, nos dice que "la Acidez Total es la suma de los ácidos valorables cuando se
lleva el pH a 7, añadiendo una solución alcalina valorada". Por lo tanto podemos proceder como sigue:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades como mínimo.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura. (No es necesaria si el electrodo lleva incorporada la sonda).
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7.
- Agitador magnético.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitados de 50 mililitros.
- Disolución valorada de hidróxido de sodio 0,1 Normal.
- La preparación del equipo se lleva a cabo tal y como se especifica en el procedimiento anterior para la determinación del pH en un
vino o mosto.
1. Elimina el dióxido de carbono de la muestra, echando 50 ml de vino o mosto en un kitasato. Agita a la vez que haces el vacío con
un trompa de agua, durante unos minutos. Si se trata de mosto concentrado, es suficiente con diluirlo a 25 ºBrix.
2. Monta la bureta y enrásala con la solución de valorada de NaOH 0,1 N.
3. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo otros 10 ml de agua destilada.
4. Coloca el vaso de precipitados sobre el agitador magnético e introduce un imán teflonado. Acopla el electrodo y la sonda de
temperatura, de manera que no toquen las paredes ni tropiecen con el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el orificio del
puente salino, añade más agua destilada. La bureta debe de verter en el vaso sin tocar al electrodo ni la sonda.
5. Pulsa el botón de lectura continua del pH-metro y añade lentamente hasta pH 7.0.
6. Anota el volumen de NaOH 0,1 N consumido.
7. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo más lentamente cuando se aproxime a pH 7.0.
8. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector con líquido de conservación, según
indicaciones del fabricante.
Cálculos:
si se utiliza factor
donde:
AT: Acidez total expresada en gramos de ácido tartárico por litro.
v: Media aritmética del volumen, en ml, de solución de hidróxido de sodio consumida.
N: Concentración Normal (equivalentes/litro) del hidróxido de sodio.
f: Factor de corrección para la concentración.
75: Peso equivalente del ácido tartárico (o 49 en el caso del ácido sulfúrico, en caso de expresarla en este ácido).
CURVA DE VALORACIÓN Y DERIVADA
Cuando se pretende determinar exactamente el punto de equivalencia, se recurre a la curva de calibrado, pues cuando se hace la
derivada 1ª de la curva, nos aparecerá un pico en el volumen correspondiente a dicho punto.

SULFUROSO POR POTENCIOMETRÍA
Se puede hacer la determinación de sulfuroso libre y total mediante la aplicación de la potenciometría aunque con matizaciones.
En primer lugar, ya no se trata de una volumetría de neutralización, ya que se trata de una volumetría de oxidación reducción o
Redox, en la que el reactivo valorante es una disolución de yodo, que actúa como oxidante del dióxido de azufre. Por lo tanto ya no
es válido un pH-metro, sino que necesitamos un potenciómetro graduado en milivoltios y un electrodo sensible a la variación del
potencial.
Este electrodo es denominado, por lógica, electrodo Redox, y es un electrodo de platino o de oro. Como electrodo de referencia se
puede utilizar el de plata-cloruro de plata, aunque lo más normal es usar un electrodo combinado, generalmente con un electrodo
Redox de platino y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata en una sola carcasa.
Otra diferencia con respecto al uso del pH-metro, es que los métodos de análisis no se basan en valoraciones a un valor final de
potencial, sino que es necesario calcular el punto de equivalencia dentro del intervalo. El procedimiento para el sulfuroso libre y total
es el siguiente:
- Potenciómetro con lecturas en milivoltios y electrodo combinado para medida de potencial.
- Agitador magnético e imán teflonado.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitado de 50 mililitros.
- Solución Patrón de 220 milivoltios tamponada a pH 7,0.
- Ácido sulfúrico 1/3 (670 ml de agua destilada + 330 ml de ácido sulfúrico concentrado).
- Solución valorada de yodo 0,02 N.
- NaOH 1 N. (40 gramos de NaOH por litro de agua destilada).
1. Tras encender el equipo y comprobar que las señales son correctas, acopla el electrodo combinado y la sonda de temperatura y
comprueba su funcionamiento.
2. Retira el capuchón protector del electrodo y lava con agua destilada.
3. Calibra el equipo con la solución patrón de 220 mV.
4. Monta la bureta y enrásala con la solución valorada de yodo 0,02 N.
5. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo 5 ml de ácido sulfúrico 1/3.
6. Coloca sobre el agitador magnético e introduce un imán. Acopla el electrodo de manera que no toque las paredes ni tropiece con
el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el orificio del puente salino, añade agua destilada. La bureta debe verter en el
vaso sin que alcance al electrodo.
7. Pulsa el botón de lectura continua del potenciómetro y añade lentamente la solución valorada de yodo 0,02 N hasta que se
produzca un incremento brusco del potencial.
8. Anota el volumen de yodo 0,02 N y continúa añadiendo un par de mililitros más, por si no se trataba del punto de equivalencia.
Sea V' el volumen de yodo consumido.
9. Toma otros 10 ml de vino y mézclalos con 10 ml de NaOH 1N. Espera 15 minutos. Vierte, de golpe, 5 ml de ácido sulfúrico 1/3 y
procede de igual forma que el anterior. Sea V' el volumen de yodo consumido.
10. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo la solución de yodo más lentamente, cuando se aproxime al salto de
potencial de la valoración anterior. Sería interesante que comprobaras el resultado, con la aplicación de hoja de cálculo.
11. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el capuchón protector con líquido de conservación, según indicaciones

del fabricante.
Cálculos:
SO2 libre (mg/L)=V x 64 o SO2 Total(mg/L)=V' x 64 donde V y V' son los volúmenes de Yodo N/50 consumidos.
AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS POTENCIOMÉTRICOS
El uso de las técnicas de electroanálisis, facilita ciertos procedimientos de análisis a la vez que incrementa la exactitud y precisión
de los resultados obtenidos.
Pero eso no es todo, pues el hecho de que sea un equipo el que detecte el punto final de la volumetría, permite abordar la idea de
automatizar el proceso en mayor o menor medida.
Así, por una parte se han diseñado dosificadores automáticos de gran precisión y exactitud, mediante bombas peristálticas u otros
mecanismos, que sustituyen con éxito a las buretas, y por otra evitan la manipulación de los reactivos valorantes.
Al intervenir menos los operarios de laboratorio, se eliminan los posibles errores que se puedan cometer en la manipulación. Piensa
en el cierre y apertura de las llaves de la bureta, en la realización del enrase de la misma, en la lectura del volumen consumido, etc.
Otro aspecto que se automatiza es la detección del punto final, de tal manera que es el propio equipo quien detiene el proceso, sin
la duda que pueda generar la interpretación del mismo.
El siguiente paso es la automatización de los cálculos, operación ésta muy superada en la actualidad, con numerosas aplicaciones
de software y hardware.
Con todo ello se logran componer equipos conocidos como valoradores automáticos o también titradores, aunque esta
denominación proviene de una adaptación de la lengua inglesa y a pesar de que su uso está extendido, es un término que no figura
en el diccionario de la RAE.
Con este tipo de equipos, la realización de los procedimientos es más fácil y rápida, lo que supone una reducción del coste por
análisis, siempre que se supere un número de muestras determinada y variable para cada equipo.
Aún así, el operario u operaria de laboratorio, deberá hacer un correcto mantenimiento, puesta a punto y calibrado de los equipos,
con la frecuencia necesaria, para garantizar la trazabilidad de los resultados analíticos.

MÉTODOS ÓPTICOS: TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS
El fundamento de los métodos ópticos es la interacción de la radiación electromagnética con la materia.
La radiación electromagnética es una combinación de campos eléctricos y magnéticos oscilantes, que se propagan a través del
espacio, transportando energía de un lugar a otro, a una velocidad constante en cada medio.
Las formas más conocidas de esta energía, son la luz y el calor radiante. Otras, son los rayos X o la radiación ultravioleta, tantas
veces mencionada en relación a la capa de ozono o a los problemas cutáneos que provoca, por no hablar de las microondas ya
establecidas en nuestra vida cotidiana.
Pero una radiación electromagnética, puede comportarse simultáneamente como una onda y como un haz o paquete de partículas,
llamadas fotones. Esta dualidad onda corpúsculo fue causa de numerosos estudios que, a la postre, concluyeron en las ecuaciones
que las caracterizan. Así, podemos decir que la energía transportada por un fotón, es proporcional a la frecuencia de la onda
asociada, a través de la constante de Max Planck.
E = h · ν en la que h es la constante de Planck, cuyo valor es 6,626 x 10-34 julios x segundo y v es la frecuencia en hercios (Hz) (1
Hz equivale a 1 partido por segundo (s.-1))
Considerando la radiación como una onda, podemos decir que su frecuencia está relacionada con la longitud de onda a través de
una constante, que es la velocidad de la luz en el medio, según la expresión:
v = c/λ lo que implica que E = h x c/λ
Por esta expresión llegaríamos a la conclusión de que cuanto menor es la longitud de onda de una radiación electromagnética,
mayor será su frecuencia y por lo tanto será mayor la energía asociada.
Pues bien, la luz solar se compone de un elevado número de radiaciones electromagnéticas, atendiendo a los parámetros
anteriores, se clasifica en diferentes agrupaciones o regiones en función de su longitud de onda, o lo que es lo mismo de la energía
que transporta. Si ordenas distintas regiones del espectro electromagnético de la radiación solar, de mayor a menor energía, tendrás
la secuencia siguiente:
Rayos γ → Rayos X → Ultravioleta → Visible → Infrarrojo → Microondas → Ondas de radio
Desde el punto de vista analítico, existen diversos criterios de clasificación de los métodos basados en el uso de la radiación
electromagnética. Teniendo en cuenta las técnicas utilizadas en la actualidad en enología, te proponemos la siguiente clasificación:
- Técnicas espectroscópicas: Cuando se basan en los efectos que provoca la radiación sobre los analitos y que dependerá de la
naturaleza y características de la radiación y del analito.
- Técnicas no espectroscópicas: Se basan en los cambios que provocan las características de los analitos sobre la radiación
electromagnética.
TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS. FUNDAMENTO TEÓRICO
Las técnicas espectroscópicas más comunes en laboratorios enológicos, se basan en la interacción de la materia con radiaciones de
las regiones ultravioleta, visible e infrarrojo. Se trata de radiaciones cuyas longitudes de onda oscilan entre 180 y
780 nanómetros para el ultravioleta visible y entre 0,78 y 5 micrómetros para el Infrarrojo cercano y medio.
La interacción entre la materia y la radiación de estas regiones del espectro, con más o menos restricciones, está regulada por la ley
de Beer.

Supongamos un haz de radiación paralela, que atraviesa una solución absorbente de concentración c, a lo largo de una distancia d.
A causa de la interacción entre los fotones y las partículas absorbentes, la potencia incidente P0 sufre una atenuación con respecto
a la potencia P de la radiación saliente.
Definimos el parámetro Transmitancia como
que también se puede expresar como porcentaje
A su vez definimos también el parámetro Absorbancia.
Según la ley de Beer, la Absorbancia viene dada por la expresión A = d · c · a , donde d es la longitud de la trayectoria a través de la
solución, c es la concentración de la solución y a es una constante conocida como absortividad. La magnitud de a depende de las
unidades en que se exprese b y c, siendo litro dividido por gramo y centímetro ( L g-1 cm-1) cuando se expresa la concentración en
gramos por litro y d en centímetros.
Cuando la concentración se expresa en moles por litro, esta constante se denomina absortividad molar y se representa por e. En
ambos casos, se trata de una constante que depende de la longitud de onda y de la naturaleza de la disolución, por lo que para una
misma sustancia, a una longitud de onda determinada y utilizando un portamuestras de las mismas dimensiones, podemos decir que
entre la Absorbancia y la concentración hay una relación lineal. Este es el fundamento de las determinaciones basadas en la
absorción de radiación visible y ultravioleta, así como algunas de infrarrojo.
Por supuesto que existen desviaciones de este comportamiento, pero la puesta a punto de los métodos analíticos, suele ser
suficiente para evitar su incidencia.
El procedimiento general de trabajo para los métodos espectroscópicos se basa en aplicar la ley de Beer, construyendo una curva
de calibrado con patrones de la misma composición que el analito. Si se cumple dicha ley, obtendremos la ecuación de una recta,
obtenida mediante una regresión lineal:
A = b[C] + a en la que A mayúscula es el valor de la lectura de Absorbancia de la muestra, a minúscula la ordenada en el
origen, [C] será su concentración y b minúscula es la pendiente de la recta.
A pesar de que los equipos actuales llevan incorporado un procesador que realiza los cálculos y nos da el resultado directamente en
una pantalla, en las unidades que se prefiera, es interesante que construyas la curva de calibrado con las lecturas de patrones y
compruebes la linealidad de la misma, mediante el coeficiente de correlación.

CURVA DE CALIBRADO
1. En una hoja de Excel registramos los datos de la curva de calibrado, poniendo los valores de la concentración de los patrones en
una columna y los valores de la absorbancia de cada lectura en otra columna diferente.
2. Una vez introducidos los datos, buscamos la representación gráfica de los mismos, para lo cual vamos a la barra de herramientas
superior y hacemos clic en Insertar, seleccionando insertar Gráfico.

3. Se abrirá el asistente para gráficos, donde deberemos seleccionar el tipo de gráfico, que para este caso será XY (Dispersión). En
el subtipo de gráfico, seleccionaremos "Dispersión. Compara pares de valores".
4. Nos aparecerá el cuadro de diálogo siguiente:
Tendremos que introducir el Rango de datos, tal y como se muestra en el ejemplo, señalando en qué columnas y líneas están los
datos. También se puede hacer arrastrando el cursor con el ratón.
5. Haciendo clic en Serie, podemos observar y cambiar cuales son los datos que aparecerán en el eje X y en el eje Y, así como dar

nombre a la serie.
6. Haciendo clic en Siguiente, aparecerá un cuadro de diálogo como el expuesto a continuación:
En las casillas correspondientes, podemos añadir los nombres del Gráfico, del eje X y del eje Y. También podemos modificar el
aspecto y las divisiones de los ejes y del área de trazado.
7. El siguiente paso nos lleva a decidir la ubicación del gráfico, en una nueva hoja o en la misma en la que se encuentran los datos.

8. Una vez que tenemos el gráfico, podemos modificar su aspecto, pinchando con el botón derecho del ratón sobre las distintas
partes del gráfico (ejes, área de gráfico, rótulos, etc), buscando el aspecto que más nos guste.
9. Si hacemos clic con el botón derecho sobre los puntos de la serie de datos, nos aparecerá un cuadro de diálogo como el
siguiente:
10. Haciendo clic sobre Agregar línea de tendencia, nos aparecerá otro cuadro de diálogo en el que seleccionaremos Tipo Lineal.

11. En la pestaña de Opciones, marcamos la casilla que nos permite Presentar la ecuación y el valor de R cuadrado en el
gráfico. Además nos permite fijar los valores de extrapolación hacia delante y hacia atrás.
12. De esta manera obtendremos la ecuación de la recta de calibrado, que nos permitirá realizar los cálculos con los valores de la
absorbancia de las diferentes muestras analizadas.
Para que la ecuación se aproxime a la de una recta y por lo tanto se cumpla la ley de Beer, el coeficiente R cuadrado tiene que tener
un valor próximo a 1.
Ejemplo:
- Lectura de absorbancia de la muestra A: 0,387
- La ecuación de la recta de calibrado es: y = 0,001x - 0,0007 y R cuadrado es 0,999.
- Sustituyendo en la ecuación: 0,387 = 0,001x - 0,0007, por lo que el valor de la concentración de la muestra A será de x = (0,387 +
0,0007) / 0,001 = 387,7 ppm de Fe.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
Se denomina región visible del espectro, porque es la región, que es capaz de percibir el ojo humano, desde las radiaciones de 700
nm de longitud de onda, correspondientes al color rojo hasta los 380 - 400 nm del violeta y azul. Por debajo empieza el ultravioleta,
no visible para los humanos, pero sí para los insectos.
Cuando una radiación de la región visible interacciona con la materia, es capaz de provocar, en algunos casos, excitación
electrónica y tránsitos de los electrones a orbitales de mayor energía. Pero dado que los distintos estados energéticos están
cuantificados, la energía aportada ha de ser justamente la adecuada. Para lograr una cantidad de energía determinada,
seleccionaremos cual es la longitud de onda de radiación que la aporta.
Las técnicas de análisis de espectroscopia Ultravioleta - Visible, se basan en convertir al analito en una especie absorbente
en esta región.
En algunos casos, el propio analito es una especie absorbente y no necesita transformación alguna, pero en un elevado número de
casos, necesita de una transformación química para convertirse en especie absorbente. La formación de compuestos complejos con
enzimas, es una buena fuente de obtención de especies absorbentes.
Por lo tanto, la puesta a punto de los procedimientos analíticos, empiezan por buscar la especie absorbente y la longitud de onda a
la cual presentan una buena absorción y que será específica para cada especie.
Prepararemos una solución de la concentración adecuada del analito y a realizar la lectura de Absorbancia o Transmitancia a esa
longitud de onda.
Una vez solventada esta fase, se debe encontrar una relación numérica entre la lectura y la concentración del analito (ley de Beer),
realizando una curva de calibrado con una serie de disoluciones patrón de diferentes concentraciones, pero todas ellas próximas a
la del analito.
El siguiente esquema representa un equipo básico de espectroscopia ultravioleta visible:
Las cubetas portamuestras han de ser estar perfectamente limpias y sin rayazos, pues originarían una lectura errónea. Además, el
material de construcción será resistente a las condiciones de uso y no presentar absorción a las longitudes de onda de trabajo.
Para el ultravioleta necesitamos cubetas de cuarzo, mientras que para el visible el vidrio es suficiente (también puede utilizarse
cuarzo en el visible). En la actualidad existen materiales plásticos válidos para ambas regiones (las de plástico normal sólo se

pueden usar para el visible).
Lo ideal es que las lecturas de las soluciones patrón y la solución del analito se hagan con la misma cubeta, eliminando así una
posible causa de error, aunque también puedes usar cubetas plásticas desechables contrastadas.
Son muchos los procedimientos espectroscópicos diseñados para enología, incluso varios para un mismo parámetro, por lo que, a
continuación, veremos solamente algunos de ellos, a modo de ejemplo.
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO L(-) MÁLICO
El ácido málico está presente en los mostos y es transformado, en parte o en su totalidad, en ácido láctico mediante la fermentación
maloláctica. Por ello es una determinación habitual en enología.
Fundamento teórico:
El método analítico se fundamenta en la oxidación del ácido L(-) málico (en forma de L- malato) a oxalacetato, catalizado por la
enzima L-malato deshidrogenasa (L-MDH) en presencia de NAD.
L- malato + NAD+ + L-MDH ↔ oxalacetato +NADH + H+
Oxalacetato + L-glutamato + GOT ↔ L-aspartato + α- cetoglutarato
Para desplazar el equilibrio hacia la derecha, se necesita de la presencia de L-glutamato y la enzima GOT (Glutamato oxalacetato
transaminasa).
Según esta reacción, la cantidad de NADH formado es equivalente a la cantidad de L-malato que es oxidado.
El NADH presenta un máximo de absorción a 340 nm, por lo que puede ser cuantificado por espectrofotometría de absorción
ultravioleta - visible, a esta longitud de onda.
- Espectrofotómetro ultravioleta visible para lectura a 340 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Pipetas automáticas reguladas a 10 µl, 200 µl, 900 µl y 1000 µl.
- Material general de laboratorio y preparación de muestra.
- Kit de reactivos para determinación enzimática de ácido L-málico.
- Agua bidestilada.
- Solución patrón de ácido L(-)málico de 0,2 gramos por litro.
1. Al ser un método enzimático los tiempos y secuencias deben de ser muy rigurosos, según instrucciones del kit.
2. Enciende el equipo con suficiente antelación para que la señal sea estable (normalmente 30 minutos).
3. Selecciona una longitud de onda de 340 nanómetros.
4. Prepara 4 patrones por dilución, entre 0,03 y 0,3 gramos de ácido L(-)málico por litro.
5. Centrifuga el vino o mosto a 3.000 rpm durante 3 minutos.
6. Diluye la muestra (hasta que contenga menos de 2 gramos de ácido L(-)málico por litro).
7. Prepara 1 cubeta contrastada para el blanco, cuatro para los patrones y dos para la muestra (duplicado).
8. Añade los reactivos del kit en el orden y la secuencia de tiempos indicado en las instrucciones.
9. Ajusta el equipo a cero de Absorbancia con la cubeta del blanco. Realiza las lecturas de los patrones y las muestras para analizar.
La Absorbancia de las muestras debe ser intermedia a la de los patrones.
10. Limpia todo el material, cuidando que no queden restos en el equipo de medida.

Cálculos:
a. Si tu equipo tiene autocalibrado, aplica la expresión que figura en las instrucciones del kit:
C = 0,473 · ΔA · f , donde ΔA es la diferencia de Absorbancia antes y después de añadir L-MDH, C mayúscula es la concentración
en gramos de ácido L(-) málico por litro y f es el factor de dilución de la muestra.
b. Sin autocalibrado, representa la curva de calibrado en papel milimetrado o en una aplicación informática, tipo hoja de cálculo,
poniendo en el eje de abscisas la concentración de los patrones y en el de ordenadas la lectura de Absorbancia.
Traza la recta promedio o realiza el ajuste por mínimos cuadrados. Con la lectura de la Absorbancia de la muestra, busca en la
gráfica el valor correspondiente a la concentración de la misma. Compara el resultado con el obtenido mediante la fórmula. Puedes
recurrir de nuevo al para saber más del apartado.
DETERMINACIÓN DE LAS CARACTARÍSTICAS CROMÁTICAS
El color de los vinos es una característica importante en la fase visual de la cata, debido a que puede llevar asociado muchas
connotaciones sobre el estado del vino. Pero desde el punto de vista cuantitativo, es conveniente que saber que no hay un criterio
demasiado uniforme al respecto. El método de referencia busca una definición del color, basado en el diagrama tricromático de la
Comisión Internacional del Alumbrado (CIE), mientras que el método usual aplicable a vinos tintos y rosados, se basa en la
definición de intensidad colorante y la tonalidad.
- Se trata de un método espectrofotométrico, en el que la intensidad colorante se define como las suma de las Absorbancias
obtenidas, en cubetas de 1 cm, a las longitudes de onda de 420, 520 y 620 nm, mientras que la Tonalidad se expresa como la
relación entre la Absorbancia a 420 nm y la Absorbancia a 520 nm.
Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 300 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 0.1, 0.2, 0.5 y 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada
1. Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
2. Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
3. Elige la cubeta en función del vino (el camino óptico de la cubeta, es decir su espesor, entre 0,1 y 1cm), de manera que permita
una lectura de Absorbancia entre 0,3 y 0,7.
4. Para cada longitud de onda, ajustar a 0 de Absorbancia con agua destilada.
5. Realiza la lectura de Absorbancia de las muestras, después de ajustar a 0, a las longitudes de onda de 420, 520 y 620 nm.
6. Lava el equipo y limpia los posibles vertidos o salpicaduras.

Cálculos:
- Si utilizas cubetas que no sean de 1 cm, deberás dividir las lecturas entre el camino óptico utilizado (en cm).
La Intensidad Colorante (I) viene dada por la expresión:
expresada con 3 decimales.
La Tonalidad (N) viene dada por la expresión:
expresada con 3 decimales.
ÍNDICE DE POLIFENOLES TOTALES
Se trata de un método espectrofotométrico, en el que el Índice de Polifenoles Totales (IPT) se obtiene de la lectura de la
Absorbancia a 280 nm de una dilución 1/50 o 1/100 del vino limpio. A 280 nm es la longitud de onda en la que absorben los anillos
bencénicos, componentes de los compuestos fenólicos.
Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 220 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada
- Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
- Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
- Prepara una dilución con agua destilada, 1/100 para vinos tintos y 1/10 para vinos blancos.
- Selecciona una longitud de onda de 280 nm, ajusta a cero con agua destilada y lee la Absorbancia de la dilución 1/10 o la 1/100.
- Lava el material y limpia el espectrofotómetro de posibles derrames o salpicaduras.
Cálculos:
El Índice de Polifenoles Totales (IPT) viene dado por la expresión:
siendo f el factor de dilución.
También podríamos determinar antocianos y otros parámetros, pero los procedimientos de trabajo con el espectrofotómetro son
todos muy semejantes.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA
La región del infrarrojo comprende las radiaciones con una longitud de onda entre 0,78 y 1000 µm y que se divide en 3 subregiones
que son el Infrarrojo cercano, medio y lejano. En procedimientos analíticos, se suele trabajar entre 2,5 y 25 µm, aunque ya se están
utilizando longitudes de onda mayores.
Cuando una sustancia absorbe en el infrarrojo, provoca un cambio neto en el momento bipolar, al modificarse los estados de
vibración y rotación. Las moléculas orgánicas tienen, en su estructura, numerosos enlaces entre átomos de diferente densidad
electrónica, por lo que son moléculas con enlaces polares. Cuando estas moléculas interaccionan con la radiación infrarroja, se
producen cambios en la forma o intensidad de la vibración y/o rotación. Dado que estos estados vibracionales son característicos
de cada tipo de enlace y están cuantificados, podemos utilizar esta característica para lograr una aplicación analítica.
Así existen numerosas técnicas cualitativas y cuantitativas basadas en la espectroscopia con radiación infrarroja. Estas técnicas,
presentan la ventaja de ser muy selectivas, lo que permite determinar analitos presentes en mezclas sin necesidad de aislar el
analito.
Así, si realizamos la medida de la Absorbancia o Transmitancía de una sustancia, en las diferentes longitudes de onda de la región
Infrarroja, obtendremos lo que se conoce como un espectro de absorción, donde representados gráficamente, figuran una serie de
picos, cada uno de los cuales se asocia a una función o tipo de enlace determinado. Es como si tienes una huella de cada
compuesto químico (siempre que absorba en esta región del espectro). Este espectro es característico para cada compuesto y solo
los isómeros presentan espectros muy semejantes. Esta circunstancia ofrece una enorme gama de posibilidades dentro del análisis
cualitativo y cuantitativo.
La incorporación de una aplicación matemática conocida como Transformada de Fourier, permite optimizar los parámetros
espectroscópicos, al simplificar los componentes de los equipos. Además los equipos con esta aplicación son más exactos y
precisos, al permitir una óptima selección de longitud de onda. Presentan, además, la ventaja de ser mucho más rápidos que los
equipos que no la llevan.
A estas ventajas, debemos añadir que las actuales técnicas analíticas en infrarrojo, no suelen necesitar muchos reactivos, ni un
proceso de preparación de la muestra (acaso alguna dilución), lo cual disminuye el coste y el tiempo por análisis.
Es común que encuentres equipos de espectroscopia infrarroja asociados a otras técnicas instrumentales, como detectores para
cromatografía o técnicas de inyección en flujo, que no son objeto de esta unidad de trabajo.
En la actualidad ya existen equipos analíticos basados en espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) a un coste
asequible, que permiten determinaciones multiparamétricas, incluso a partir de una sola gota de vino o mosto.

MÉTODOS ÓPTICOS. TÉCNICAS NO ESPECTROSCÓPICAS
Existen otra serie de técnicas analíticas, cuyo fundamento está también relacionado con la luz, como son las técnicas
refractométricas y turbidimétricas.
Teniendo en cuenta las aplicaciones en el ámbito de la enología, vamos a exponer las técnicas basadas en:
Refracción de la luz:
Por ejemplo observado un objeto semisumergido en el agua, como los remos de una embarcación y la sensación que percibes es
que parece que se deforma. Pues ese efecto óptico se debe a la refracción.
Refracción es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro
diferente, pero también transparente.
Este cambio de dirección también ocurre en un mismo medio al cambiar la temperatura, pues una variación de la misma implica un
cambio de la densidad, lo que provoca que la luz se transmita a una velocidad distinta en función de la densidad de cada medio.
Se denomina Índice de Refracción (n) de un medio transparente, al cociente entre la velocidad de la luz en el vacío (c) y la
velocidad que tiene en ese medio (v). n = c/v
Su valor es adimensional y siempre superior a 1.
La refracción se caracteriza por dos leyes que son:
Primera ley: El rayo de luz incidente, el refractado y la normal están en el mismo plano.
Segunda ley: Si i es el ángulo del rayo incidente y r el ángulo del rayo refractado con respecto a la normal, n1 el Índice de
Refracción del medio 1 (aire en el dibujo) y n2 el Índice de Refracción del medio 2 (agua en el dibujo), se cumple que
n1· sen i = n2· sen r Esta ley se conoce como Ley de Snell.
Dispersión o esparcimiento de la luz:
Cuando un rayo de luz atraviesa una solución coloidal, con partículas en suspensión, una parte de la radiación es transmitida,
mientras que otra fracción es esparcida en todas las direcciones debido al choque con las mismas. Este fenómeno se conoce como
efecto Tyndall. Este efecto, es el que nos permite ser capaces de percibir un haz luminoso a través de una solución con partículas
en suspensión, o simplemente a través del aire con polvo en suspensión, como un rayo de sol cuando entra en una habitación
oscura.
Si en lugar de una suspensión, se tratase de una solución verdadera, no podrías percibir dicha trayectoria.
Podemos decir que la denominada luz de Tyndall o luz difusa, se debe a un fenómeno físico, prácticamente independiente de cual
sea la composición química de las partículas en suspensión.
REFRACTOMETRÍA
La refractometría es una técnica habitual en el ámbito del análisis enológico.
Por ejemplo un refractómetro de mano es un pequeño instrumento en el que se exprime una uva y se pone delante de un ojo, sirve
para comprobar el grado de maduración en época de vendimia.
El Índice de Refracción del agua en relación con el aire a 20º C, es 1,333. Si en el agua disolvemos, por ejemplo sacarosa, el índice
de refracción de la disolución será mayor que el del agua pura y aumentará a medida que aumenta la cantidad disuelta. Así, es
posible relacionar el contenido en azúcares de una disolución con el Índice de Refracción.

Basándose en esta relación, se fabrican equipos con distintas escalas adaptadas al tipo de muestra. Para enología están graduados
en Grados Baume, Grados Brix o en Grado alcohólico probable, que nos permiten hacer una lectura directa a partir de una pequeña
fracción de mosto, siendo común su uso para control de maduración. Con los nuevos refractómetros digitales, eres tú quien
selecciona la escala de lectura. Existen diferentes tablas que relacionan unas unidades con otras, pero las relaciones aproximadas
entre estas escalas podemos calcularlas con las fórmulas siguientes:
ºBrix = ºBe x 1,8 ºBrix = (600,90502 x n) – 799,58215 º Alcohólico probable = ºBrix x 0,59
El valor del Índice de Refracción varía con la temperatura, por lo que tienes dos alternativas: hacer la lectura cuando la muestra a 20
ºC o utilizar un refractómetro equipado con un sistema de compensación de temperatura, que en la actualidad son la mayoría.
El procedimiento de uso de un refractómetro es el siguiente:
- Deja que el aparato alcance la temperatura ambiente, para que el sistema de compensación de temperatura sea lo suficientemente
rápido.
- Limpia los prismas o el portamuestras con una toallita de papel y agua destilada.
- Comprueba el ajuste del aparato, poniendo como muestra agua destilada, debiendo dar una lectura de 1,333 para el Índice de
Refracción o 0 en la escala de ºBrix. De no ser así, consulta el manual de instrucciones y realiza el ajuste correspondiente.
- Pon una gota de mosto entre los prismas o en el dispositivo portamuestras y haz la lectura, anotando el resultado de la escala
elegida.
- Limpia con agua el refractómetro y sécalo con la toallita de papel.
TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
La visión del trayecto de un rayo de sol entre las nubes o las bonitas fotografías de un bosque con niebla: Estas impresionantes
imágenes, se deben a un fenómeno de dispersión o esparcimiento de la luz.
Así basados en este efecto, se desarrollaron las técnicas analíticas de Turbidimetría y Nefelometría.
El fenómeno de esparcimiento de la luz por parte de las partículas en suspensión, es conocido como efecto Tyndall. Este efecto es
más intenso cuanto menor sea la longitud de onda de la radiación incidente. Por ello, el azul y el violeta se corresponden con la
radiación de menor longitud de onda (400 nm) dentro de la región visible y es por esta causa que el cielo y el mar, los vemos
siempre con un tono azulado.
La diferencia entre Turbidimetría y Nefelometría, sólo se debe a sistemas de equipamiento instrumental a la hora de detectar la
radiación, pues mientras la Turbidimetría mide la luz transmitida en la misma dirección de la luz incidente, la Nefelometría mide la
radiación esparcida a 90 grados con respeto a la radiación incidente. Hoy se habla genéricamente de turbidímetros, para designar
a los equipos de medida, sea cual fuere su sistema de detección, aunque también se utiliza el término de nefelómetro.
En disoluciones verdaderas, podemos aplicar técnicas espectroscópicas, mientras que si existen partículas en suspensión
emplearemos técnicas no espectroscópicas.
Estas técnicas son utilizadas en análisis enológico para la determinación de la turbidez de las suspensiones. Son de gran interés en
los procesos de clarificación, en los procesos que tienen presencia de lías, etc.
Los métodos turbidimétricos nos permiten determinar turbiedades midiendo la luz esparcida, por comparación con patrones de
referencia, que son soluciones coloidales muy estables. Uno de los más utilizados es el compuesto por una suspensión
de formacina.
La turbidez se mide en Unidades Nefelométricas de Turbidez (NTU). Un NTU equivale a la turbidez que presenta una suspensión
con una concentración de 7,5 ppm de sílice (SiO2) o una suspensión con una concentración de 1 ppm de formacina estándar.

DETERMINACIÓN DE LA TURBIDEZ
En la actualidad el mercado exige vinos limpios y sin sólidos en suspensión, sea cual sea su naturaleza, lo cual obliga a que las
técnicas de clarificación tengan una especial importancia en los procesos de elaboración.
También en el proceso de fermentación, la medida de la turbidez ayuda al control del proceso, al igual que durante las crianzas
sobre lías.
Para determinar la turbidez, se suelen utilizar equipos de laboratorio o portátiles, existiendo una amplia oferta en el mercado con
detección nefelométrica.
El procedimiento genérico para una determinación de turbidez en vinos o mostos, es el siguiente:
1. Enciende el equipo con antelación suficiente, para conseguir la estabilidad de la señal luminosa.
2. Realiza el calibrado del aparato utilizando los patrones adecuados, siguiendo el manual de uso o la instrucción técnica
correspondiente. Lo más habitual es utilizar 3 ó 4 patrones de diferente grado de turbidez. Para ello, debes de tener en cuenta que
los patrones han de aproximarse al rango de medida que vas a necesitar, pues no es lo mismo determinar la turbidez de un producto
acabado, con patrones de 0 a 10 NTU, que la de un producto en elaboración, donde hablamos de turbiedades entre 100 y 1000
NTU.
3. Normalmente, los patrones se suministran directamente en la cubeta de medida, por lo que se debe evitar su manipulación. Lo
que sí es imprescindible, es comprobar su fecha de caducidad, ya que al tratarse de soluciones coloidales, su estabilidad puede
variar con el paso del tiempo.
4. Comprueba que las cubetas o viales están limpias y secas.
5. Llena la cubeta hasta el aforo y tápala. Homogeneiza la muestra, invirtiendo varias veces la cubeta o vial. Es importante lograr
una suspensión homogénea.
6. Limpia el exterior del vial y pon un poco de aceite de silicona en el exterior del vial, distribuyéndolo con un paño suave. El objeto
del aceite es evitar daños en la superficie del vial o cubeta.
7. Introduce el vial en el equipo, asegurándote de posicionarlo según las marcas y cierra la tapa.
8. Selecciona lectura estable o continua en función del tipo de determinación.
9. Efectúa la lectura de la muestra, expresando su resultado en NTU.
Es importante que te asegures de que las cubetas o viales están contrastadas, pero de todas formas es conveniente que realices
periódicamente la comprobación.
Para ello, llena la cubeta con una muestra, elige la función de medida continua y vete girando la cubeta o vial durante una vuelta
completa, prestando atención a la lectura de la pantalla. La posición que coincida con la lectura más baja, es la que debes de usar
para la lectura, por lo que debes de marcarla en la cubeta y en el equipo (si no tiene marca).
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
Dentro de la química analítica, los métodos para análisis pueden conseguir una mayor o menor selectividad, pero es muy difícil, por
no decir imposible, encontrar un método específico para un analito determinado.
Así, en la mayoría de las situaciones, antes de realizar el análisis nos vemos obligados a separar el analito de otros componentes,

para evitar las posibles interferencias.
Como métodos de separación, consideramos los métodos de cromatografía y electroforesis, en ambos casos con todas sus
variantes, de los cuales nos centraremos en la cromatografía.
Sin duda, el modo más común para realizar separaciones analíticas es la cromatografía, que agrupa un gran número de métodos y
que permite separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas.
La cromatografía se caracteriza por una fase móvil, una fase estacionaria y un sistema de detección.
Estos métodos tienen en común, que la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido
supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, que se mantiene fija en una columna o
sobre una superficie sólida. Ambas fases son elegidas con el objeto de conseguir que los distintos componentes de la muestra
atraviesen a distinta velocidad la fase estacionaria. Al final de la columna o placa se consigue que los componentes lleguen
separados.
Los métodos cromatográficos se clasifican según el tipo de fase móvil, estacionaria y el tipo de equilibrios que se establecen entre
ambas.
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICA EN ENOLOGÍA
Las técnicas cromatográficas "sencillas" cada vez se usan menos, mientras que los equipos modernos es poco probable, a no ser
una bodega de dimensiones importantes, pues a pesar de sus interesantes aplicaciones, el coste y el mantenimiento son elevados.
Si consideramos también el sector de las industrias derivadas, sobre todo el de los destilados y licores, las técnicas cromatográficas
cobran especial relevancia, aunque es necesario matizar de nuevo, que sólo los laboratorios especializados o las grandes destilerías
son capaces de rentabilizar la elevada inversión.
Las técnicas cromatográficas más utilizadas en el sector enológico son la cromatografía de gases y la de líquidos, esta última más
conocida como HPLC o Cromatografía Líquida de Alta Resolución. También se utilizan, aunque cada vez menos, las técnicas de
cromatografía en papel y capa fina.
La cromatografía es una técnica de separación y que para que se convierta en una técnica analítica completa, necesita que un
sistema de detección identifique y cuantifique los distintos componentes de la muestra después de la separación.
El detector elegido será aquél que mejor se adapte a las características físico-químicas del analito y, a nivel general, los sistemas de
detección usados en cromatografía son técnicas analíticas en sí.
Los equipos que se basan en técnicas cromatográficas de separación y que llevan asociado un sistema de detección se
denominan cromatógrafos.
Si al final de la fase estacionaria colocamos un detector que sea sensible a la presencia de los componentes del analito y

representamos su señal en función del tiempo, se obtiene un gráfico con una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a
un componente. Este grafico se denomina cromatograma y en su interpretación se obtienen los resultados analíticos, tanto
cualitativos como cuantitativos.
La utilización de la cromatografía como técnica cualitativa, se basa en una magnitud denominada tiempo de retención, que es el
tiempo que tarda un analito en recorrer toda la fase estacionaria. Simplificando mucho, podemos decir que el tiempo de retención es
característico para cada sustancia, siempre que lo consideremos en un sistema cromatográfico y en unas condiciones determinadas.
La valoración cuantitativa se basa en calcular el área de cada pico del cromatograma. Evidentemente, los sistemas informáticos
actuales permiten simplificar este proceso.
Como comprenderás, el proceso de obtención de resultados tiene muchas matizaciones, causas de error y desviaciones, por lo que
es necesario disponer de un procedimiento de calibración con patrones, cuya composición se asemeje a la del analito.
Una de estas causas de errores, se debe a que se trabaja con volúmenes muy pequeños, del orden de los µL, por lo que un
pequeño error en la dosificación, implica un error importante en el resultado. Para minimizar este error se pueden usar dos métodos:
- Método del estándar o patrón interno: Se introduce en cada muestra y en cada patrón de calibrado una cantidad exactamente
medida de una sustancia patrón interno, de manera que el detector compare el pico de las muestras y patrones de calibración con el
patrón interno.
- Método de la normalización de áreas: Se basa en esperar a que todos los componentes atraviesen la fase estacionaria. El
detector determine cada analito por la relación del área del pico correspondiente con respecto al área total.
A continuación, se expone brevemente las características de la cromatografía de gases, HPLC y sus aplicaciones en enología.

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN ENOLOGÍA
Con un cromatógrafo de gases, podemos disponer de los datos del contenido de residuos de productos fitosanitarios, en el momento
de la recepción de uvas en la bodega, pudiendo discriminar la materia prima por este parámetro. Esto puede contribuir a un uso más
racional de estos productos.
A continuación se describe, aunque sea de forma muy resumida, las características de los cromatógrafos de gases y sus
aplicaciones en enología.
El esquema básico de un cromatógrafo de gases es el que tienes en la figura adjunta, en él observamos que consta de:
- Una Fase móvil gaseosa, que con sus sistemas de regulación, transportará la muestra hasta el final del recorrido. Se emplean
gases inertes como helio, argón, nitrógeno, dióxido de carbono o hidrógeno.
- Un sistema de inyección de la muestra o los patrones, con sistema de vaporización instantánea.
- Una columna de diámetro y longitud variable, rellena con la fase estacionaria. Esta columna está en el interior de un horno, ya que
la temperatura permite modificar las condiciones de desarrollo de la separación.
- Un sistema de detección.
- Sistema de registro o impresión de datos.
Los detectores más usados en cromatografía de gases son el de ionización de llama, como el representado en el esquema y el de
conductividad térmica, aunque ya se utilizan otros más modernos como el detector de captura de electrones o el de emisión
atómica. El acoplamiento de la cromatografía de gases con la espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier, o con la
espectrometría de masas, ofrece un amplio campo de posibilidades analíticas, eso sí, a un elevado coste.
El procedimiento de trabajo para cromatografía de gases, se limita a:
1. Sigue el protocolo de preparación de la muestra, eliminando aquellas interferencias o diluyendo hasta los rangos permitidos.
2. Prepara el cromatógrafo, controlando la presión y flujo de los gases, así como la temperatura del horno y espera a que la señal
del detector sea constante. Atención al uso de los gases, pues sin ser alarmistas, su manejo obliga a ser muy rigurosos con los
protocolos de seguridad y buenas prácticas.
3. Añade una cantidad exacta de patrón interno a los patrones y muestras y las inyectas secuencialmente en el cromatógrafo,
esperando el tiempo necesario para permitir la elución total de la muestra anterior. Deberás inyectar cantidades del orden de 1 µL.
4. Anota o registra los resultados y seguir el protocolo de limpieza y apagado del equipo.
La OIV admite diversos métodos analíticos basados en técnicas de cromatografía de gases, a la vez que se trabaja en la puesta

apunto de nuevos procedimientos. Podemos citar algunas aplicaciones como: determinación de glicerol, etanol, metanol, alcoholes
amílicos y otros alcoholes superiores, restos de plaguicidas, etc.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN ENOLOGÍA
Cuando leemos algún artículo técnico en revistas especializadas o en Internet, podemos comprobar que el acrónimo HPLC es tan
usual y está tan extendido, que da la sensación de que dan por supuesto, que todos los lectores estamos obligados a conocer su
significado.
La Cromatografía de líquidos es una técnica de separación, que asociada a los detectores adecuados, está cobrando mucha
importancia en el análisis enológico, ya que son bastantes los proyectos de investigación que trabajan con esta técnica para lograr la
tipificación de los vinos elaborados con una determinada variedad o mezcla de ellas. En algunos casos, se está intentando emular a
la nariz humana, como rastreadora de aromas, tanto positivos como negativos, en vinos y productos derivados. Quizás sea la
técnica instrumental más vendida en los últimos tiempos, debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a diferentes analitos y la
posibilidad de determinar, con gran exactitud, compuestos no volátiles o termolábiles, que no podrían ser analizados en fase
gaseosa.
El esquema fundamental de un cromatógrafo de líquidos, representado en la figura adjunta, consta básicamente de los siguientes
elementos:
- Fase móvil líquida: Formada por uno o varios disolventes, que se mezclan y pueden usarse con concentración uniforme o
mediante un gradiente de concentración, para optimizar la separación de los analitos.
- Sistemas de bombeo: Formado por bombas recíprocas o neumáticas, reguladores y otros dispositivos que deben de garantizar
un flujo continuo y libre de pulsaciones, trabajando a presiones elevadas y fabricados con material resistente a los disolventes.
- Sistema de inyección: Debe permitir la inyección sin despresurizar el sistema y una buena precisión en la medida, ya que se
trabaja con volúmenes muy pequeños, aunque normalmente superiores a los de cromatografía gaseosa.
- Pre-columna: Sistema de prevención que evita el deterioro de la columna, reteniendo contaminantes de los disolventes y
estabilizando la presión.
- Columna: con diferentes tipos de relleno, según el analito, generalmente fabricadas en acero y más cortas que las de gases.
- Detector: En HPLC se usan dos tipos de detectores. Los que se basan en medir la variación de una propiedad de la disolución
como puede ser el Índice de refracción, la densidad o la constante dieléctrica que se modifica por la presencia de los analitos y los
que se fundamentan en medir una propiedad de los analitos, como la espectroscopia ultravioleta, la espectrometría de masas o los
métodos electroquímicos.
El procedimiento de trabajo para HPLC, semejante al de gases, se limita a:
1. Seguir el protocolo de preparación de la muestra, eliminando aquellas interferencias o diluyendo hasta los rangos permitidos.
2. Preparar el cromatógrafo, programando el caudal y la composición de la fase móvil, ajustando la presión de trabajo y esperando a
que la señal del detector sea constante.
3. Calibra el equipo, si es necesario, con patrones externos o internos.
4. Inyecta un volumen de muestra (del orden de los µL) con la mayor exactitud y precisión posible.
5. Anota o registra los resultados y seguir el protocolo de limpieza y apagado del equipo.
Las aplicaciones de la HPLC en enología, van desde la determinación de los precursores aromáticos, ocratoxina, azúcares,
antocianos, lisozima, pesticidas o aminas biógenas, etc.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CAPA FINA
La cromatografía en papel y capa fina, denominadas cromatografías planas, son técnicas cromatográficas no instrumentales, pero
que por relación las veremos aquí. Su fundamento es el mismo que una cromatografía de columna. En ella la fase móvil es un
líquido, el eluyente, que arrastra a la muestra y la fase estacionaria está extendida sobre la superficie plana de un material inerte.
Puede ser una cromatografía de reparto, si el sólido está impregnado de una sustancia líquida, o de adsorción, si la fase
estacionaria está seca.
El flujo de la fase móvil se debe al fenómeno de capilaridad.
En este tipo de técnicas, la disolución diluida de la muestra, se sitúa sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de
mancha o banda, a corta distancia de uno de los extremos del plano.
Una vez seca la mancha se introduce en el eluyente, manteniendo todo el sistema en una cámara cerrada.
La separación se produce por migración diferencial de los analitos en la dirección en la que se mueve la fase móvil.
Existen dos tipos de cromatografía plana:
- Cromatografía de papel: La fase estacionaria es un papel de grano homogéneo (Whatman nº 1).
- Cromatografía de Capa Fina (TLC): La fase estacionaria es un sólido extendido en forma de una capa uniforme y muy fina, sobre
un soporte de vidrio o aluminio.
La Cromatografía de papel es una cromatografía de reparto, ya que la fase estacionaria es el agua retenida entre las moléculas de
celulosa.
En la Cromatografía de Capa Fina, se utiliza sílice o celulosa y resulta más rápida, eficaz y versátil. Se dispone en el mercado de
placas preparadas en diferentes dimensiones y con diversas fases estacionarias.
El equipamiento básico para una cromatografía plana es:
- Una cubeta de desarrollo, generalmente de vidrio grueso, para mantener estables las condiciones y con tapa.
- Pliego de papel Whatman nº 1 o placa cromatográfica de sílice.
- Capilares para aplicación de muestras.
- Un secador de pelo.
- Fase móvil adecuada.
Para revelar los distintos componentes sobre el papel o la capa fina, se recurre a procesos de tinción nebulizados o incorporados en
la fase estacionaria. Es común incorporar fluoresceína y una vez finalizada la cromatografía, se localizan las manchas bajo una luz
ultravioleta.

ÁCIDOS MÁLICO Y LÁCTICO POR CROMATOGRAFÍA PLANA
La cromatografía en un laboratorio enológico es una técnica que es aplicada para seguir la fermentación maloláctica, pues es muy
fácil y económica además de no necesitar ningún equipo de análisis instrumental.
Mediante esta técnica podemos detectar la presencia de los ácidos málico y láctico, además del tartárico. La determinación
semicuantitativa o aproximada es posible, pero exige muy buena mano.
El procedimiento es como sigue:
Material y productos:
- Equipo para cromatografía plana (cubeta, capilares, secador, etc.).
- Papel Whatman nº 1.
- Ácido acético al 50%
- n-butanol.
- Azul de bromofenol.
Procedimiento:
1. Prepara el eluyente de la fase móvil, mezclando 100 ml de una disolución de azul de bromofenol de 1g/L en n-butanol con 40 ml
de una disolución de acético en agua al 50%.
2. Llena la cubeta con el eluyente hasta una altura de 2 centímetros, tápala y déjala durante una hora, para lograr saturar la
atmósfera con los vapores del eluyente.
3. Prepara una tira de papel Whatman Nº 1 de altura en función del tipo de cubeta que dispongas (20 cm).
4. Con un lápiz, traza una línea horizontal a unos 3-4 cm del borde inferior de la hoja. Marca tantos puntos como muestras más
patrones tengas.
5. Prepara un patrón de cada ácido, tartárico, málico y láctico (un gramo por litro).
6. Aplica las muestras y los patrones usando un capilar diferente para cada uno de ellos. Seca después de la aplicación y repite la
aplicación sobre el mismo punto, 5 ó 6 veces, secando cada vez. De esta manera se concentra la mancha.
7. Introduce la tira de papel con las manchas, de manera que éste se sumerja en el eluyente, pero sin que se mojen las manchas.
Procura que quede vertical, usando pinzas o apoyando sobre la pared.
8. Tapas la cubeta y esperas a que el eluyente ascienda hasta 3/4 de la altura total. (4-5 horas).
9. Saca el papel con cuidado, marca el frente del eluyente y déjalo secar al aire, mejor colgado.
10. Una vez seco, observarás diversas manchas, que interpretarás como sigue:
Interpretación:
- Tomando como base el punto en el que aplicaste el vino, en la vertical te aparece una primera mancha que corresponde al ácido
tartárico. Esa mancha se debe de corresponder en altura con el patrón del mismo ácido.
- Un poco más arriba, te aparece una mancha amarilla correspondiente al ácido málico, si está presente. Esta mancha se
corresponderá con la del patrón correspondiente.
Por encima, puede aparecer otra mancha debida a los ácidos láctico + succínico, que se corresponderá con su patrón.

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