La replicación del ADN es el proceso por el cual el material genético se duplica antes de la división celular. Es semiconservativa, bidireccional y semidiscontinua. En procariotas involucra maquinaria enzimática como ADN polimerasas, helicasas y ligasas. En eucariotas es más complejo con múltiples orígenes de replicación. La replicación in vitro mediante PCR permite amplificar fragmentos de ADN y tiene numerosas aplicaciones.
2. La división celular requiere de la duplicación
del material genético
mitosis
mitosis
meiosis
3. Mecanismo generalMecanismo general
La misma estructura del
ADN sugirió un mecanismo
de replicación de la
información
◦ Cada hebra sirve como molde
para replicar la complementaria
5. Semiconservativa: cada nueva molécula esta
formada por una hebra parental y una recién
sintetizada
◦ Experimentos de Meselson y Stahl
6. Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio
denominado origen de replicación
A cada lado de la burbuja de replicación se forma una
horquilla de replicación
10. MecanismoMecanismo
Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.
◦ Separación de hebras.
◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.
Elongación
◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.
◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.
Terminación
◦ Reconocimiento de señales de terminación.
◦ Desensamble de replisomas.
11. ADN polimerasas:
◦ Pol I
◦ Pol II
◦ Pol III (replicasa)
◦ Pol IV y V
Necesitan 3’ OH libre
12.
13. Maquinaria enzimáticaMaquinaria enzimática
ADN polimerasas: Síntesis de ADN
Primasas: Generación 3’OH libres
Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki
Helicasas: Separación de hebras
Topoisomerasas: Mantenimiento del
grado de superenrollamiento
SSBs: Mantenimiento de simples hebras
21. Los mecanismos son similares
Más de un origen de replicación por cromosoma
Es más complejo
Proteins Functions
RPA
PCNA
RFC
Pol α/primase
Pol δ / ε
FENI
DNA2
DNA ligase I
Mcm2-7
Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases;
facilitates helicase loading
Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase
DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading
RNA-DNA primer synthesis
DNA polymerase; 3'-5' exonuclease
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Ligation of DNA
DNA helicase; primosome assembly, licensing factor
25. TelómerosTelómeros
Son secuencias repetidas que
se encuentran en los
extremos de los
cromosomas lineales
Entre otras funciones
resuelven los problemas de
replicar este tipo de
cromosomas
29. Mantenimiento de la informaciónMantenimiento de la información
hereditariahereditaria
Errores durante la replicación:
◦ Las ADN polimerasas no son 100% fieles
◦ Los errores son reparados en un alto
porcentaje de las veces
◦ Cuando los errores escapan los mecanismos
de reparación ocurren cambios en la
secuencia del ADN: Mutaciones
Las mutaciones también pueden ocurrir
por fenómenos post replicación
(mutágenos físicos, químicos, etc.)
30. Mecanismos de reparaciónMecanismos de reparación
Las propias replicasas son capaces de reparar
sus errores durante la elongación:
◦ actividad correctora de prueba (proofreading)
◦ Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’
32. Replicación de ADNReplicación de ADN in-vitroin-vitro: PCR: PCR
Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés
Algunas aplicaciones:
◦ Clonado acelular de moléculas de ADN
◦ Detección de secuencias sin purificación previa
◦ Análisis de expresión génica
◦ Secuenciación de ácidos nucleicos
◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular
◦ Aplicaciones en medicina:
Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas
Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas)
Tipado de tejidos para transplantes
Detección de células tumorales
Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos)
Identificación individual
Tests de paternidad
◦ Filogenia
◦ Análisis de genética poblacional
33. Reacción de replicaciónReacción de replicación in-vitro:in-vitro:
Molde
ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable)
Cebadores:
◦ 3’ OH libre
◦ Definen la región a amplificar
dNTPs (A, C, G, T)
Condiciones para el funcionamiento de la enzima:
◦ Buffer
◦ Mg++ (cofactor de la enzima)
35. Luego de terminados los ciclos se obtienen
millones de moléculas de la región blanco
La hace una técnica extremadamente sensible
◦ Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material
◦ Desventaja: Contaminaciones
36.
37. Variantes del métodoVariantes del método
rt- PCR:
◦ Se usa una transcriptasa reversa para pasar
una muestra de ARN a ADN obteniendose
ADN copia (ADNc)
◦ Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de
interés
◦ Estudios de expresión génica
◦ Clonado de genes eucariotas (eliminación de
intrones)
38. PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):
◦ Se diferencia en que en cada ciclo de amplificación
se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦ Permite inferir la cantidad de moléculas de molde
que existía originalmente en la muestra:
Cuantificación de la expresión génica
Cuantificación de microorganismos
39. Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN
Método de Sanger (nobel en 1980)
Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN in-
vitro
40.
41. Realizando 4 reacciones independientes
(una para cada base) se puede inferir la
secuencia original
42. Secuenciación automáticaSecuenciación automática
Sigue el mismo principio
A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente
Esto permite realizar una unica reaccion en la cual
estan presentes los 4 ddNTPs marcados
Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
La detección se realiza en un punto fijo al final de la
corrida
43.
44. Secuenciación de genomasSecuenciación de genomas
Cada reacción de secuencia es capaz de leer
unas 500 pb
Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos?
Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb
(genoma completo 109
)
45. Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
Lectura de secuencias individuales
Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
Para asegurarse de que todas las secuencias estén
representadas se leen unas 10 veces la cantidad de
bases del genoma
46. La velocidad de producción de las secuencias ha ido
en aumento.
Recientemente se dio un salto en este sentido con el
desarrollo de los secuenciadores de “próxima
generación”
No usan terminación de cadena
Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
108
1010
bases por corrida (menos de 1 día)
De esta forma se secuencio el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo