Este documento describe los conceptos básicos de las secuencias de ADN y los métodos para secuenciar ADN. Explica que una secuencia de ADN es una sucesión de nucleótidos que pueden ser codificantes u no codificantes. Luego resume los principales métodos históricos de secuenciación como el método de Sanger y el método de Maxam-Gilbert, así como métodos más modernos como la pirosecuenciación y la secuenciación de una sola molécula. Finalmente, menciona algunos hitos en la secuenciación

1. Alumno: Francisco Muñoz Maestre

2.  ¿Qué es una secuencia de ADN?
 Una secuencia de ADN tiene factor biológico
 En que consiste la secuenciación del ADN
 ¿Por qué se llego a secuenciar el ADN?
 Métodos de secuenciación del ADN
 Curiosidades
 Bibliografía

3.  Sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula
de ADN. Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro
subunidades de nucleótidos de una banda ADN.
 las secuencias se presentan pegadas unas a las otras como en la
secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izq. a derecha.
 Para que pueda llamarse secuencia tiene que haber una sucesión de al
menos 4 nucleótidos

4.  una secuencia puede tener sentido o anti sentido, y ser tanto
codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden
contener “ADN no codificante”.
◦ Secuencia de ADN codificante: región del ADN que transcribirá en ARN y
este a su vez se traducirá a una proteína (Exones).
◦ Secuencia de ADN no codificante: región del ADN que no se transcribirá ni
se traducirá a una proteína (La mayor parte se encuentra entre los genes
en el cromosoma o se encuentran dentro de los genes, intrones).
 Las secuencias pueden derivarse de material biológico de
descarte a través del proceso de secuenciación del ADN.

5.  Determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la
investigación básica de los procesos biológicos
fundamentales , así como en campos aplicados, como la
investigación de los embriones o la investigación forense.

6.  En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro
mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro
nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN
polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido
didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El
nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con
su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se
está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el
momento y lugar donde se incorpora.
método enzimático de terminación de cadena

7.  Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de
moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan
todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el
extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).
 Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de
reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles
verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran
longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN
que se diferencian en un solo nucleótido. Los productos de cada una de
las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles
diferentes del gel.

8.  Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con
una película fotográfica de autoradiografía. La aparición de una
banda en una posición concreta de la autoradiografía en una de las
cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN
de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base
correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de
reacción correspondiente.
 Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la
dirección 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de
menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de
los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de
nueva síntesis en la dirección 5' 3'.

9.  Los instrumentos modernos automáticos de secuenciación del ADN
(secuenciadores de ADN) pueden secuenciar más de 384 muestras
marcadas por fluorescencia de una sola vez y llevar a cabo 24 ciclos
de secuenciación al día. No obstante, los secuenciadores
automáticos de ADN llevan a cabo solamente separación del ADN
basada en el tamaño (por electroforesis capilar), detección y registro
de la coloración fluorescente, y los datos resultantes se dan como
cromatogramas que registran los picos de fluorescencia. Se efectúan
por separado las reacciones de secuenciación mediante una
termocicladora, lavado y resuspensión en una solución tamponada
antes de pasar las muestras al secuenciador.
Automatización y preparación de las muestras

10.  En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método
para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y
posterior escisión en bases específicas.
 En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los
extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea
secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña
proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las
cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de
fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el
primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos
posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel,
separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras
distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar los fragmentos
generados en cada reacción, se hace una autoradiografía del mismo, lo
que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras
correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a
partir de las cuales se puede inferir la secuencia.
 Ventajas: utilización directa del ADN
 Desventajas: complejidad técnica, uso extensivo de productos peligrosos
Secuenciación de Maxam-Gilbert

11.  La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN en
tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) que
tiene lugar en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus
dNTPs. Inicialmente, esta metodología se empleaba para monitorizar
de forma continua la actividad de la ADN-polimerasa. Este método
requiere de la preparación de una molécula monocatenaria de ADN a
la cual se hibrida un pequeño cebador. A medida que la reacción
transcurra, se irá sintetizando la cadena complementaria e iremos
obteniendo una serie de picos de señal en el pirograma que nos
permitirán determinar la secuencia.
Pirosecuenciación

12.  Secuenciación de alto rendimiento
 La elevada demanda de secuenciación de bajo coste ha dado lugar a
las distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Se
pretende que las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento
disminuyan los costes de secuenciación de las bibliotecas de ADN
más allá de lo que se puede hacer con el método corriente del
terminador marcado basado en la separación del ADN por
electroforesis capilar. Muchos de los nuevos métodos de alto
rendimiento usan métodos que paralelizan el proceso de
secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias a la vez.

13.  El método tSMS (siglas en Inglés de True Single-Molecule
Sequencing) de Helicos es uno de los más modernos
comercializados hoy día para la secuenciación. A diferencia de sus
predecesores, no lleva a cabo ningún tipo de amplificación de la
muestra, sino que es capaz de secuenciar a partir de una única
molécula monocatenaria de ADN.
 La ventaja radica en la secuenciación simultanea de millones de
fragmentos distintos de ADN y que podemos seguir a tiempo real
gracias a las imágenes captadas. Un software analiza dichas
imágenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales
deben ser ensambladas posteriormente por programas informáticos.
Secuenciación de una única molécula de ADN

14.  2007 Por primera vez se secuencia un grupo de especies
estrechamente relacionadas. Se secuencian 12 Drosofílidos (mosca
de la fruta), haciendo despegar la era de la filogenómica. En ese
mismo año Craig Venter publica su genoma diploide completo: el
primer genoma humano en ser completamente secuenciado
 En octubre de 2006, la Fundación Premio X estableció el Premio
Arconte X (Archon X Prize), que premia con 10 millones de dólares al
"primer equipo que pueda construir un dispositivo y utilizarlo para
secuenciar 100 genomas humanos en 10 días o menos, con una
exactitud no menor a un error por cada 100.000 bases
secuenciadas, con secuencias que cubran correctamente al menos el
98% del genoma, y a un coste no mayor de 10.000 $ por genoma

15.  http://es.wikipedia.org/wiki/Secuencia_de_ADN
 http://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_de_ADN
 http://www.genome.gov/GlossaryS/index.cfm?id=137
 http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuen
cia.htm

16.  Muchas gracias por vuestra atención
Gracias por …