Diapositivas de la Dra. Martha Leticia Zamudio Aguilar, para fines didácticos.

1. Métodos diagnósticos en
biología molecular y celular
Dra. Martha Leticia Zamudio Aguilar
Facultad de Medicina Xalapa
UNIVERSIDAD VERACRUZANA.

2. Diagnóstico en medicina
• La etapa diagnóstica en la atención del paciente es fundamental
• Es la base para sustentar el tratamiento y evaluar sus resultados
• Se ha venido sustentando de diferentes modos y según el avance
tecnológico
• Se distinguen varias etapas básicas:
• Dx clínico
• Dx radiológico básico y de laboratorio clínico
• Dx radiológico avanzado y de histopatología
• Dx de biología molecular

3. Diagnóstico de laboratorio
• Toma en cuenta parámetros biométricos
• Según los niveles detectados de diversos marcadores químicos se
infiere el estado funcional del paciente
• Complementa al diagnóstico clínico y radiológico básico
• Permite mayor precisión en la detección de enfermedades, sobre las
poco o nada sintomáticas o de síntomas vagos
• Permite un monitoreo de resultados del tratamiento muy preciso
• Tiene implicaciones pronósticas
• No explora alteraciones estructurales

4. Diagnóstico histopatológico
• Se centra en las alteraciones estructurales
• Se complementa con el Dx clínico, de laboratorio y radiológico básico
y avanzado
• Localiza exactamente el sitio de daño y el tipo de lesión
• Tiene implicaciones pronósticas
• Permite monitorear respuesta al tratamiento

5. Diagnóstico histopatológico. Limitaciones
• Es más invasivo, supone algunos riesgos
• Algunos sitios son difíciles de abordar
• No todas las lesiones son específicas
• Explora básicamente cambios tisulares
• Explora algunos cambios celulares
• Explora pocos cambios moleculares

6. Diagnóstico histopatológico. Nuevo potencial
• Susceptible de extenderse a los métodos de biología molecular, en especial
• Inmunohistoquímica
• inmunoelectromicroscopía
• Citometría de célula aislada
• Citometría de flujo
• Hibridación in situ
• Extracción y análisis de organelos, DNA y RNAm
• Cultivo de tejidos
• Microarreglos
• Se considera al patólogo como el biólogo molecular aplicado al
diagnóstico médico.

7. Inmunohistoquímica
• En una muestra histológica permite detectar moléculas específicas
• Así como identificar tipo celular que las produce, sitio en que se
encuentran (membrana, citoplasma o núcleo) y cantidad relativa en
que se producen
• Esto permite conjugar estructura con función en un mismo material
• Permite distinguir entre lesiones muy parecidas o difíciles de clasificar
• Permite establecer tratamientos altamente específicos

8. Inmunohistoquímica. Bases
• Las preparaciones microscópicas conservan gran parte del inventario
molecular de las células observables
• En especial proteínas, solubles o fijas a membranas
• Es posible detectarlas si se las marca de manera adecuada
• La detección se puede hacer visible al microscopio
• De luz convencional
• De luz ultravioleta
• De rayos electrónicos

9. Inmunohistoquímica. Bases
• Búsqueda de proteínas mediante Anticuerpos
• La proteína buscada se purifica e inyecta a un chivo
• Este produce Ac’s vs la proteína extraña
• Se extraen y purifican los Ac’s
• Se le inyectan a una rata, que a su vez produce Ac’s anti Ac
• A estos se les agrega un marcador capaz de dar color visible al
microscopio

10. Inmunohistoquímica. Técnica
• Sobre la laminilla con las células que supuestamente llevan el Ag
(proteína buscada) se pone una gota del Ac de chivo
• Se incuba (calor y humedad)
• Si está el Ag el Ac se adhiere
• Se lava con agua y otros agregados simples
• Se agrega una gota de Ac de rata y se incuba
• Si esta presente el Ac de chivo, el de rata se adhiere
• Se lava y agrega revelador
• El marcador se hará visible al microscopio si está el Ag buscado

18. Inmunoelectromicroscopía
• Variante de la anterior
• Mismos Ac’s
• Misma técnica
• Ac secundario marcado con Au (oro)
• Las partículas de Au se hacen visibles a los rayos electrónicos
• Se puede determinar con gran precisión en qué organelo y sitio se
encuentra el Ag buscado

19. Hibridación in situ
• Destinada a buscar ciertas secuencias de bases en el DNA, específicas
de ciertos genes (mutados o no) o de agentes virales cuyos genes se
han insertado en el DNA de la célula infectada
• Se somete la preparación histológica donde están las células
supuestamente afectadas a altas temperaturas (90 g C)
• El DNA se desnaturaliza y se aprovecha para agregar una sonda
• La sonda tiene una secuencia de BN propia del gen mutado o del
supuesto virus infectante y no del huésped
• Se induce la renaturalización del DNA bajando la temperatura de la
laminilla

20. Hibridación in situ
• Con la renaturalización se forma el híbrido: DNA del huésped-sonda
• La sonda está marcada (material radiactivo, cromógeno)
• La marca de la sonda es visible al microscopio (cromógeno)
• Si está la marca, está la sonda (el híbrido) y esta la secuencia de BN
propia del gen mutado o del gen viral inserto en el DNA del huésped
• No busca proteínas, sino genes
• Las sondas se solicitan bajo diseño específico, según las necesidades
del investigador.
• Llegan por mensajería. Son más baratas que los anticuerpos.

23. Extracción y análisis de organelos, DNA y RNAm
• A partir de un corte histológico
• Se extraen células mediante microdisección con laser
• Las células seleccionadas son lisadas
• A partir del lisado se extraen organelos mediante ultracentrifugación
• Los diferentes organelos se analizan por separado
• Se pueden extraer ácidos nucleicos y se analizan mediante diferentes
técnicas (hibridación, por ejemplo)

24. Cultivo de tejidos
• A partir de una biopsia sin fijar
• Se separan diferentes tipos de células (mediante centrifugación y
extracción por vaporización, por ejemplo)
• Las células seleccionadas se colocan en diferentes medios de cultivo
(como si fueran bacterias)
• Se generan capas delgadas de células vivas que se reproducen
exitosamente.

28. Microarreglos
• En la era prost-genómica se pueden estudiar muchos genes a la vez
• Con los mismos recursos obtenemos una imagen de menor resolución
pero con una perspectiva más general
• Es un formato experimental,
• Basado en la síntesis o fijación de sondas, que representan los genes
(o proteinas, o metabolitos),
• Sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, silice,...),

29. Microarreglos
• Existen diferentes tipos:
• De Proteínas •
• De Tejidos •
• De DNA

30. Aplicaciones
• Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias
condiciones –
• Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados •
• Clasificación molecular en enfermedades complejas •
• Identificación de genes característicos de una patología (firma o
“signature”) •
• Predicción de respuesta a un tratamiento •
• Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen
• Etc, etc, etc…

31. Affymetrix
• Affymetrix (www.affymetrix.com) es la compañía lider en este tipo de
chips •
• Se denominan genericamente GeneChips •

32. Perspectivas
• Son un instrumento que permite al médico diagnosticar rápidamente
cancer y otras enfermedades en una consulta de rutina
• Podrían facilitar tratamientos personalizados
• Drogas personalizadas, Diagnóstico molecular,
• Integración del diagnóstico con el tratamiento•
• Estas son las promesas a largo plazo de esta tecnología
• Prometye obtener una vision global de los procesos biológicos.

37. PCR
• La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para
hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en
un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
• La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable,
la Taq polimerasa, y requiere de cebadores de ADN diseñados
específicamente para la región de ADN de interés.
• En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios
de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la
región blanco.

38. PCR
• La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica.
Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico
médico y el análisis forense de ADN.
• Cebadores para PCR
• Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede
hacer ADN si hay un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que
proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN.
• Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena
sencilla, generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud