Apresentação para alunos da Universidad Veracruzana

1. Impactodelpezcebraembiologíay
neurociencias

2. Programa
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Conociendo al pez cebra
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Ventajas e inconvenientes del uso
del pez cebra en neurobiología
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Dominios conductuales de interés

3. El pez cebra
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Cyprinidae
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Pequeño tamaño (2-4 cm adulto)
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Originario del sudeste asiático
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Vive en cardúmenes
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Los huevos se desarrollan externamente
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Embriones transparentes
Hamilton 1822
Parichy DM (2015). The Natural History of Model Organisms: Advancing biology through a deeper understanding of
zebrafish ecology and evolution. eLife 4: e05635

4. Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología
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Ventajas generales
– Desarollo rapido (2-3 meses post-fertilización)
– Alta densidad de alojamiento / costo comparativamente bajo
– Desarollo externo (larvas de nado libre en 4 dpf)
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Obtención de imágenes / neuroanatomia
– Tamaño reducido ideal para microscopía
– Observación y manipulación neuronal no invasiva gracias a la transparencia de las larvas
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Imágenes en vivo en tiempo real con resolución celular
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Las investigaciones pueden incluir miles de larvas con adquisición y procesamiento
– Conservación de los principales núcleos/regiones cerebrales: núcleo arqueado, hipocampo, amígdala, locus coeruleus, rafe...)
– Red neuronal pequeña/compacta revelada a la vez por microscopia de dos fotones o confocal
– Imágenes en vivo con GECI (indicador de calcio codificado genéticamente)
– Cerebro adulto de pequeño tamaño (5 mm de longitud). Número reducido de secciones para análisis histológico y
neurodegeneración
Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences.
Progr Neurobiol 93: 231-243
Stewart AM, Braubach O, Spitsbergen J, gerlai R, Kalueff AV (2014). Zebrafish models for translational neuroscience
research: From tank to bedside. Trends Neurosci 37: 264-278

5. Ventajas del uso del pez cebra en neurobiología
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Recursos genômicos / genéticos
– Más de 12.000 patrones de expresión génica anotados (incluidos los miARN)
– Transgénesis con vectores retrovirales y transposones (miles de líneas de líneas
generadas)
– Mutagénesis rápida (TILLING, pruebas ENU, mutagénesis insercional, zinc finger
nucleasas)
– Amplia colección de mutantes
– Eliminación rápida de genes mediante morfolinos antisentido
●
Farmacología y fisiología
– Screening de fármacos en formato de 96 pocillos
– Conservación de la mayoría de las dianas farmacológicas
– Conservación de neurotransmisores rápidos clásicos (glicina, GABA,
– glutamato, monoaminas: dopamina, norepinefrina, epinefrina,
– serotonina, melatonina)
– Conservación de la mayoría de los neuropéptidos (por ejemplo, MCH2)
– Conservación de genes tempranos inmediatos (por ejemplo, cFos, Jun, krox24, bdnf,
homer)
Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences.
Progr Neurobiol 93: 231-243
Rihel J et al. (2010). Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation.
Science 327: 348-351

6. Inconvenientes del uso del pez cebra en
neurobiología
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Sin cepas consanguíneas
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Tamaño reducido para muestras de
tejidos
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Evolutivamente distante del ser humano
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Fisiológicamente diferentes
●
Sin recombinación homóloga
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Algunos neuropéptidos no se conservan
(por ejemplo, NPS)
●
No se encuentran algunos genes
tempranos inmediatos (ARC)
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No hay electroencefalograma; no
hay resonancia magnética funcional
●
No hay neocórtex estratificado
●
Algunos núcleos son difíciles de
identificar o aún no se han
encontrado (por ejemplo, el núcleo
accumbens)
●
Neuropatología/trastornos
neurológicos aún no bien definido
en pez cebra
Rinkwitz S, Mourrain P, Becker TS (2010). Zebrafish: An integrative system for neurogenomics and neurosciences.
Progr Neurobiol 93: 231-243

7. Estudios comparativos, conservación evolutiva y
similitud funcional
●
Algunos comportamientos,
enfermedades, trastornos o procesos
neurobiológicos podrían no estar
conservados evolutivamente (es decir, no
existe homología histórica)
●
Los procesos neurobiológicos que se
observan en varias especies diferentes
son probablemente homólogos, o bien
analogías lo suficientemente buenas
como para producir hipótesis en otros
organismos
Gerlai R (2014). Fish in behavior research: Unique tools with a great promise! J Neurosci Methods 234: 54-58

8. Un ejemplo de analogías sin conservación evolutiva: el
papel de la serotonina en el comportamiento tipo-ansioso
Maximino C, Costa BP, Lima MG (2016). A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their
solution. Curr Psychopharmacol 5: 96-138

9. Utilización de herramientas genéticas para
estudiar la función neuroconductual

10. Utilización de herramientas genéticas para
estudiar la función neuroconductual
●
¿Qué regiones cerebrales están asociadas al
aprendizaje aversivo? ¿Qué neuronas son
responsables?
●
Creación de líneas de peces transgénicos que
expresan Gal4FF, una versión modificada del
activador de la transcripción Gal4, en regiones
específicas del cerebro
●
Se cruzaron estos peces que expresaban Gal4FF con
la línea efectora que portaba el gen de la neurotoxina
botulínica (inactiva la exocitosis) de la secuencia de
unión de Gal4 UAS, y se analizaron los peces
transgénicos dobles para el condicionamiento del
miedo por evitación activa evitación activa
●
Dos de estos linajes tenían expresión
de Gal4 en poblaciones de neuronas
localizadas en subregiones de la Dm
(= BLA), que se denominaron
neuronas 120A-Dm

11. Utilización de herramientas genéticas para
estudiar la función neuroconductual
●
Los linajes SAGFF70A y SAGFF120A
se identificaron como líneas de
potenciadores del gen emx3
●
Las neuronas 120A-Dm eran en su
mayoría glutamatérgicas y tenían
proyecciones a otras regiones
cerebrales, como el hipotálamo y el
telencéfalo ventral.

12. Sensibilización dependiente del tiempo como
modelo del TEPT
Lima MG et al. (2016). Time-dependent sensitization of stress responses in zebrafish: A putative model for post-traumatic stress disorder. Behav Proc 128: 70-
82
0 h 24 h
Análisis conductual
Exposición

13. Papel del óxido nítrico en la sensibilización dependiente
del tiempo
Lima MG et al. (2015). Putative involvement of the nitrergic system on the consolidation, but not initiation, of behavioral sensitization after conspecific alarm
substance in zebrafish. Pharmacol Biochem Behav 139B: 127-133

14. Isoformas envolvidas
7-NI (bloqueador NOS-1)
30’ despues de la
exposición
AG (bloqueador NOS-2)
30’ despues de la
exposición
AG (bloqueador NOS-2)
90’ despues de la
exposición

15. Cabeza de riñon (produccion de cortisol) Encéfalo
30’
90’
Cabeza de riñon (produccion de cortisol)

16. Mecanismos downstream
ODQ (bloqueador GC) 90’
despues de la exposición
Ivabradina (bloqueador
canales HCN) 90’ despues
de la exposición

17. Mecanismos upstream?
TRAM-34 (bloqueador de canales
IKCa, expressos en neuronios e
microglia) 30’ despues de la
exposición

18. En resumen...
●
La producción inicial e inmediata de óxido nítrico a través de NOS-1 ayuda en la primera
fase de consolidación, sensibilizando circuitos que aún no han sido definidos
●
La modulación de los receptores IKCa en microglía y neuronas conduce a la activación de
NOS-2
●
La activación de NOS-2 conduce a una elevación sostenida y retardada del óxido nítrico
●
El óxido nítrico activa la guanilato ciclasa, que eleva el GMPc; este GMPc sensibiliza los
circuitos de comportamiento defensivo a través de los canales HCN (quizás también estén
presentes otros mecanismos).

19. Muito obrigado pela atenção!