IT-SEGAI-03 "Verificación de micropipetas"

VERIFICACIÓN DE MICROPOPETAS
INSTRUCIÓN TÉCNICA IT-SEGAI-03 Rev.: 01 Página 1 de 21
Universidad de La Laguna, Vicerrectorado de Investigación, SEGAI. Apartado: 456 CP: 38200
San Cristóbal de La Laguna/ Santa Cruz de Tenerife. Tel.: 922319523 - 922318940.
E-mail: sopinve@ull.edu.es. CIF: Q3818001D.
VERIFICACION DE MICROPIPETAS
ELABORADO / REVISADO APROBADO
FECHA: 23 de enero de 2018 FECHA: 24 de Junio de 2018
Firma: Firma:
RESPONSABLE DE CALIDAD DIRECTORA
Nombre: Antonio Santos Delgado Nombre: José Luis Rodríguez Marrero
MODIFICACIONES A LA EDICIÓN ANTERIOR
No existe versión anterior
CONTROL DE DISTRIBUCIÓN
Destinatario:
Nº de copia controlada:

1. OBJETO
La presente instrucción técnica tiene como objeto verificar la exactitud y reproducibilidad
en la dosificación de volúmenes con micropipetas automáticas mediante el control
gravimétrico de los volúmenes dispensados.
2. ALCANCE
Esta instrucción técnica es de aplicación para las micropipetas automáticas, que se tienen
que someter a verificaciones periódicas.
3. RESPONSABILIDADES
La responsabilidad de la verificación de las micropipetas recae sobre el personal técnico
del SEGAI que posea la cualificación correspondiente recogida en el “Registro de
cualificación” (R.03/PG-05).
Los Responsables de los Servicios tienen la responsabilidad de asegurar que las
micropipetas de los Servicios se encuentren dentro de las fechas de verificación
establecidas en los planes de calibración/verificación.
4. DEFINICIONES
VERIFICACIÓN: Comparación entre el volumen real dispensado por la micropipeta y el
volumen teórico que debería dispensar, según las especificaciones del fabricante. El
volumen real se determina por vía gravimétrica a través de la masa del agua dispensada,
mediante la medición del peso con una balanza de precisión.
5. DIAGRAMA DE FLUJO
No aplica.
6. DESCRIPCIÓN
Esta instrucción técnica es una guía para la determinación de la masa de varias
dosificaciones de agua desionizada, de manera repetitiva, utilizando varios volúmenes en
el rango de medida de cada micropipeta.

La periodicidad de las verificaciones de las micropipetas viene establecida en el
R.01/PG06 “Plan de calibración/verificación de equipos”.
Con el fin de verificar el correcto funcionamiento de estos equipos y asegurar al máximo
posible la integridad de los resultados emitidos con estos, es imprescindible comprobar el
rendimiento de las micropipetas, verificándolas con frecuencia para controlar su exactitud,
reproducibilidad e incertidumbre asociada a las mismas
Las puntas de las micropipetas son un componente del sistema tan importante como las
pipetas, si son de baja calidad o no ajustan bien, la mejor pipeta no podrá dar resultados
satisfactorios.
La hermeticidad, la forma de la punta, el centrado y lisura del orificio de la punta, así como
las propiedades superficiales: humectabilidad y rugosidad superficial influyen y afectan el
comportamiento de salida. Las puntas de alta calidad deben estar libres de metales
pesados, ser incoloras y de polipropileno. Deben ser hidrofóbicas, para garantizar mejores
resultados.
6.1 CONDICIONES GENERALES
La verificación de la exactitud y reproducibilidad de las micropipetas debe efectuarse
dentro de las siguientes condiciones ambientales:
 La temperatura ambiente debe estar comprendida en el intervalo de 21.5±1 ºC.
 La presión atmosférica debe de estar comprendida en el intervalo de 1013 ± 25 mBar.
 La humedad relativa debe mantenerse en el intervalo de 45-75% para reducir el
efecto de la evaporación y evitar la influencia de cargas electrostáticas.
 Las medidas efectuadas deben corregirse de acuerdo con el factor de conversión Z
(µl/mg), que determina la corrección para la densidad del agua desionizada en
función de la temperatura y presión, tal como se recoge en la Tabla 1:

Tabla 1. factor de conversión Z (µl/mg), de la densidad del H2O desionizada en función de la temperatura y
presión.
6.2 ESPECIFICACIONES
El intervalo de volúmenes que puede dispensar cada micropipeta está en función de su
capacidad. Los intervalos recomendados los proporcionar cada fabricante para cada
modelo. En la Tabla 2 podemos apreciar un ejemplo de intervalos recomendados por el
fabricante para distintos modelos de micropipetas:
Modelo Volumen máximo (µl) Intervalo (µl)
P2 2 0.1 - 2
P10 10 0.5 - 10
P20 20 2 - 20
P200 200 20 - 200
P1000 1000 100 - 1000

Tabla 2. Modelo de micropipetas, volumen máximo dispensable e intervalo de volumen
recomendado (µl).
La Tabla 3 muestra un ejemplo de las especificaciones que debe cumplir la micropipeta,
siempre que se opere en las condiciones anteriormente especificadas. Estas
especificaciones son aportadas por el fabricante, y están determinadas acorde a la norma
ISO 8655.
MODELO
micropipeta
VOLUMEN (µl)
EXACTITUD REPRODUCIBILIDAD
Absoluto
(± µl)
Relativo
(%)
Absoluto
(± µl)
Relativo
(± %)
P2
MIN 0,2 0,024 12,0 0,012 6,00
MED 1,0 0,027 2,7 0,013 1,30
MAX 2,0 0,030 1,5 0,014 0,70
P10
MIN 0,5 0,020 4,0 0,014 2,80
MED 5,0 0,050 1,0 0,030 0,60
MAX 10,0 1,000 10,0 0,040 0,40
P20
MIN 2,0 0,060 3,0 0,030 1,50
MED 10,0 0,100 1,0 0,050 0,50
MAX 20,0 0,160 0,8 0,060 0,30
P200
MIN 20,0 0,240 1,2 0,120 0,60
MED 100,0 0,800 0,8 0,250 0,25
MAX 200,0 1,200 0,6 0,400 0,20
P1000
MIN 100,0 1,600 1,6 0,400 0,40
MED 500,0 3,500 0,7 1,000 0,20
MAX 1000,0 6,000 0,6 1,500 0,15
Tabla 3. Rangos de Exactitud y Reproducibilidad aceptados por el fabricante para micropipetas. Estos rangos
solo son aplicables a las pipetas marca Biopette (Labnet International Inc.), en caso de utilizar otras
micropipetas, se debe referir a la documentación aportada por el fabricante.
6.3 MATERIALES Y REACTIVOS
 Agua desionizada.
 Termómetro calibrado con una sensibilidad de 0,10 ºC para medir la temperatura del
agua al principio y al final del ensayo.
 Dos recipientes de material no poroso con una capacidad de 10 a 50 veces el
volumen empleado en el ensayo (dos vasos de precipitado entre 10-50 ml)

 Puntas de pipeta. Durante el ensayo se debe usar la misma punta para todas las
medidas de cada serie. Las puntas de las pipetas deben de ser de una calidad
contrastada, fabricadas con materiales químicos, libre de partículas, con unas
geometrías y tamaños uniformes, de superficies regulares y sin rebabas, y de un
material resistente a diferentes productos químicos.
 Pipetas
 Balanza analítica.
6.4 PROCEDIMIENTO
1. Cumplimentarlos los datos requeridos en el registro “Informe de verificación de
micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03). Las verificaciones serán codificadas de la siguiente
manera “CÓDIGO-MES-AÑO (NÚMERO DE SERIE)”.
2. Comprobar y anotar las condiciones ambientales (presión, humedad y
temperatura), así como la temperatura del agua, en la hoja de registro “Informe de
verificación de micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03).
3. Traspasar 1-5 ml de agua desionizada a un vaso de precipitado de 50 ml y colocar
en el centro de la balanza de precisión.
4. Traspasar 50-100 ml de agua desionizada a un segundo vaso de precipitado y
reservar en la poyata.
5. Ajustar la micropipeta al volumen máximo que se desee verificar.
6. Colocar la punta a la micropipeta y dosificar dos veces en el vaso de precipitado
reservado en el punto 4, para humectar la punta (estas medidas no se registran).
7. Tarar la balanza.
8. Tomar con la micropipeta el volumen máximo requerido del vaso de precipitado
reservado en el punto 4, asegurándose de que no se formen burbujas de agua.
9. Dosificar el agua.

10. Una vez estabilizada la balanza, anotar la masa (mg) en la columna adecuada de
la hoja de registro “Informe de verificación de micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03).
11. Repetir las operaciones anteriores desde el punto 7 al 10, 9 veces más (n = 10).
12. Ajustar la micropipeta al volumen medio requerido, y repetir el proceso desde el
punto 6 a 11, anotando los pesos de las medidas en la columna adecuada de la hoja de
registro “Informe de verificación de micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03).
13. Ajustar la micropipeta al volumen mínimo requerido, y repetir el proceso desde el
punto 6 a 11, anotando los pesos de las medidas en la columna adecuada de la hoja de
registro “Informe de verificación de micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03).
14. Comprobar y anotar la temperatura ambiente, presión, humedad y la temperatura
del agua al final del ensayo en la hoja de registro “Informe de verificación de micropipeta”
(R.01/IT-SEGAI-03).
15. Usar el valor promedio de la temperatura inicial y final, así como de la presión,
para determinar las correcciones necesarias de acuerdo con la Tabla 1 (factor de
conversión Z (µl/mg), de la densidad del agua desionizada en función de la temperatura y
presión.
16. Determinar la exactitud y reproducibilidad de cada micropipeta utilizando la hoja de
registro “Informe de verificación de micropipeta” (R.01/IT-SEGAI-03). Una vez introducidos
los datos, la hoja de cálculo determinará automáticamente si el resultado de la verificación
es “APTO” o “NO APTO”, en función de que cumpla o no los requisitos descritos en la
Tabla 3.
17. Repetir el mismo procedimiento para el resto de micropipetas.
6.5 CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
 Peso medio de las dosificaciones:

Donde:
W = Media del peso de las dosificaciones expresada en mg.
n = Número de veces que se repite las dosificaciones.
Wi= Peso de cada dosificación expresada en mg.
 Volumen medio:
Donde:
V = Volumen medio expresado en µl (volumen real).
W = Media del peso de las dosificaciones expresada en mg.
E = Pérdidas por evaporación expresada en mg. Son despreciables, E = 0)
Z = Factor de conversión que incorpora la densidad del agua destilada a la temperatura y
presión del ensayo (µl/mg). (Tabla 1)
 Exactitud ó desviación cuantitativa del valor real frente al teórico:
Donde:
Ex =Exactitud expresada en µl.
V = Volumen medio expresado µl (volumen real).
Vo = Volumen regulado en el indicador digital de la pipeta expresado en µl (volumen
teórico).
Donde:
Ex(%) = Exactitud expresada como %.

V = Volumen medio expresado en µl (volumen real).
Vo = Volumen regulado en el indicador digital de la pipeta expresado en µl (volumen
teórico).
 Reproducibilidad ó desviación típica del valor real en %:
Donde:
S = Reproducibilidad expresado en µl.
Vi = Volúmenes individuales expresados en µl.
n = Número de veces que se repite las dosificaciones (n=10).
Donde:
CV = Reproducibilidad expresada en %.
S = Reproducibilidad expresado en µl.

Donde:
Vi = Volúmenes individuales expresados en µl.
Wi = Peso de cada dosificación expresada en mg .
E = pérdidas por evaporación expresada en mg (E = 0).
Z = Factor de conversión que incorpora la densidad del agua destilada a la temperatura y
presión del ensayo (µl/mg), véase Tabla 1.
 Cálculo de la incertidumbre asociada a la pipeta
Junto a la calibración de la micropipeta se realizan una serie de cálculos que nos llevan a
conocer la incertidumbre de ésta. Estos cálculos se realizan de forma automática en la
hoja de registro “R.01/IT-SG-15: Verificación de micropipetas”, una vez introducidos los
datos en la misma.
Las ecuaciones utilizadas para el cálculo de incertidumbres son las siguientes:
Donde:
Vm = Volumen medido en la micropipeta, expresado en ml.
M = Media de la masa de agua tomada con la pipeta, expresado en g.

dw = densidad del agua, expresada en g/cm3
.
da = Densidad del aire expresada en g/cm3
(en condiciones de calibración controladas se
supone constante e igual a 1.2 g/cm3
).
Uvol = Incertidumbre combinada de la pipeta, expresado en ml.
UM= Incertidumbre debida a la masa, expresado en g.
Uda = Incertidumbre debida a la variación de la densidad del aire, expresado en g/cm3
.
Udw = Incertidumbre debida al cálculo de la densidad del agua, expresado en g/cm3
.
Puede despreciarse el término debido a que es aproximadamente Mx10-3
que se
considera despreciable al sumarse a M o M/dw2
.
La Densidad del agua, “dw”, se calcula mediante la ecuación de Kell modificada:
Donde:
T = Temperatura inicial, expresada en ºC.
Por lo tanto, la incertidumbre combinada de la pipeta será:
La incertidumbre debida a la masa, “UM”, se calcula con la fórmula:

Donde:
UR = Incertidumbre debida a la repetibilidad de las medidas con la pipeta, expresado en g.
Umed = Incertidumbre de la medida de la balanza, expresado en g.
La incertidumbre debida a la repetibilidad de las medidas con la pipeta, “UR”, se calcula
con la siguiente expresión:
Donde:
S = Desviación estándar de las medidas de los pesos del agua, expresada en g.
n = Número de veces que se repite las dosificaciones (n=10).
La incertidumbre de la medida de la balanza, “Umed”, se calcula con la siguiente expresión:
Donde:
Uc = Incertidumbre combinada de calibración de la balanza, expresada en g.
La incertidumbre debida a la variación de la densidad del aire, “Uda”, se calcula como una
distribución rectangular:

Para el cálculo de la incertidumbre asociada a la densidad del agua, “Udw”, se debe
calcular, en primer lugar, la incertidumbre debida a la temperatura “UT”, utilizando la
ecuación:
Donde:
UT = Incertidumbre de la temperatura, expresada en ºC.
Ures = Incertidumbre asociada a la resolución del termómetro, expresada en ºC.
Ucal = Incertidumbre combinada del termómetro, expresada en ºC.
Uvar = Incertidumbre debida a la variación de la temperatura durante el proceso de
calibración, expresada en ºC.
La incertidumbre asociada a la resolución del termómetro, “Ures”, se calcula con la
siguiente ecuación:
Donde:
resol = Resolución del termómetro, expresada en ºC.
La incertidumbre debido a la variación de la temperatura durante el proceso de
calibración, “Uvar”, se calcula con la siguiente expresión:
Donde:

T = Temperatura inicial, expresado en ºC.
Tf = Temperatura final, expresado en ºC.
Finalmente, la incertidumbre debida al cálculo de la densidad del agua “Udw” se calcula
con la ecuación que incluye el coeficiente de sensibilidad de la temperatura “ct” y la
incertidumbre debida a la temperatura.
Donde:
Ct = Coeficiente de sensibilidad de la temperatura.
UT = Incertidumbre de la temperatura, expresada en ºC.
El término “Ct” se calcula derivando la ecuación de Kell con respecto a la temperatura
Los valores de la incertidumbre se dan para los volúmenes nominales de la pipeta. En el
caso de pipetas de volúmenes variables, se tomará como incertidumbre de un volumen
dado, el valor más alto de incertidumbre de los límites inferior y superior del intervalo en el
que se encuentre dicho volumen.
La incertidumbre expandida asociada a la micropipeta será:
Donde:

UEvol = Incertidumbre expandida asociada a la micropipeta, expresada en ml.
Uvol = Incertidumbre combinada de la pipeta, expresado en ml.
K = es el factor de cobertura que corresponde a un nivel de confianza del 95%. Este factor
es igual a 2.
La incertidumbre asociada a las micropipetas se calculará cada vez que se verifique la
micropipeta.
El resultado de la incertidumbre obtenida se aceptará siempre que sea menor al 5%, en
los volúmenes estudiados. En caso de que la incertidumbre sea mayor a este valor se
realizará la calibración de la misma.
6.6 RESULTADO DE LA VERIFICACION
Los datos de cada verificación se introducen manualmente en la hoja de cálculo “R.01/IT-
SEGAI-03: Informe de verificación de micropipetas”, utilizando las celdas designadas para
ello.
Dicha hoja de cálculo realiza automáticamente todos los cálculos descritos en el apartado
6.5, y determina automáticamente si el resultado de la verificación es “APTO” o “NO
APTO”, en función de que cumpla o no los requisitos descritos en la Tabla 3.
Sólo en el caso de que el valor de exactitud, reproducibilidad y/o incertidumbre superen
los errores máximos permitidos en la ISO 8655 se procederá a calibrar la micropipeta.
7. REGISTROS / ANEXOS
Registro/Anexo Código
Responsable
archivo
Soporte
Tiempo
conservación
Informe de
verificación de
micropipetas
R.01/IT-SEGAI-03
Responsable del
Servicio
Papel/ Digital 3 años

INFORME DE VERIFICACIÓN DE MICROPIPETAS
Referencia R.01/IT-SEGAI-03
Rev. 1
1. Datos de la verificación
CODIGO DE VERIFICACION:
PERSONAL:
PIPETA:
Marca:
Modelo:
Numero de serie:
RANGO DE VOLUMENES (µl):
Minimo:
Medio:
Máximo:
Valores de E y R del fabricante (Tabla 3)
Volumen (µl)
E (µl)
(Accuracy)
E (%)
R (µl)
(Precision)
R (%)
Mínimo 0 0 0
Medio 0 0 0
Máximo 0 0 0
CONDICIONES DE LA VERIFICACION
Fecha:
Hora:
Presión (mbar):
Humedad relativa (%):

Temperatura inicial (ºC)
Max
Min
Temperatura final (ºC)
Max
Min
Factor de conversión (Z) (Tabla 1)
Balanza
Marca/Modelo:
Fecha
calibración:
Incertidumbre
calibración (g):
K =
Resolución (g):
Termómetro
Marca/Modelo:
Fecha
calibración:
Incertidumbre
calibración
(ºC):
K =
Resolución
(ºC):
Temperatura inicial del agua (T) (ºC)
Temperatura final del agua (Tf) (ºC)
Densidad del agua (dw) (g/cm3) 0,99985308
Densidad del aire (da) (g/cm3) 1,2

Resultado de la verificación
CONDICIONES DE LA VERIFICACIÓN:
Humedad relativa (%) 0 NO APTO
Temperatura media (ºC) #¡DIV/0!
#¡DIV/0!
SD Temperatura (ºC) #¡DIV/0!
Presión (mBar) 0 NO APTO
DATOS DE MEDIDAS DE MASAS:
Vol. Min (µl) Vol. Med (µl)
Vol. Max
(µl)
Vol. Min
(µl)
Vol. Med
(µl)
Vol. Max (µl)
0 0 0 0 0 0
nº pesada Masas (mg) Masas (mg) Masas (mg)
Masas
(mg) * Z
Masas
(mg) * Z
Masas (mg) * Z
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0 0 0
9 0 0 0

10 0 0 0
Promedio masas (mg) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! 0 0 0
EXACTITUD
Vol. Min (µl)
Vol. Med
(µl)
Vol. Max
(µl)
0 0 0
Valor absoluto (| |) 0 0 0
Porcentaje (%) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
Para Vol. Min (µl) = 0
Según el fabricante, el E% debe ser < que: 0
, así que
es:
#¡DIV/0!
Para Vol. Med (µl) = 0
, así que
es:
#¡DIV/0!
Para Vol. Max (µl) = 0
, así que
es:
#¡DIV/0!

REPRODUCIBILIDAD
Vol. Min (µl)
Vol. Med
(µl)
Vol. Max
(µl)
0 0 0
Promedio masas 0 0 0
Desviación típica 0 0 0
Porcentaje Desviación #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
Para Vol. Min (µl) = 0
, así que
es:
#¡DIV/0!
Para Vol. Med (µl) = 0
, así que
es:
#¡DIV/0!
Para Vol. Max (µl) = 0
, así que
es:
#¡DIV/0!
CALCULO DE INCERTIDUMBRE
Vol. Min
(µl)
Vol. Med
(µl)
Vol. Max
(µl)
0 0 0
Desviación estándar de las medidas de los pesos (S) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! g

Incertidumbre de medida de la balanza (Umed) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! g
Incertidumbre de repetibilidad de las medidas (Ur) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! g
Incertidumbre debida a la masa (UM) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! g
Incertidumbre de variación de la densidad del aire (Uda)
5,45596E-
05
5,45596E-
05
5,45596E-
05
g/cm3
Incertidumbre de resolución del termómetro (Ures) 0 0 0 ºC
Incertidumbre de variación de la temperatura (Uvar) 0 0 0 ºC
Incertidumbre del termómetro (Ucal) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! ºC
Incertidumbre debida a la temperatura (UT) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! ºC
Coef. Sensibilidad temperatura (Ct)
6,32693E-
05
6,32693E-
05
6,32693E-
05
Incertidumbre de la densidad del agua (Udw) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! g/cm3
Incertidumbre combinada pipeta (Uvol) #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! ml
Incertidumbre expandida pipeta #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! ml
Porcentaje de la incertidumbre #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! %
Criterio de aceptación de incertidumbre #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!

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