IT-SG-14 " Identificación y recuento de patógenos en placa "

1. IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE PATÓGENOS EN PLACA
INSTRUCCIÓN TÉCNICA IT-SG-14 Rev.: 01 Página 1 de 6
SEGAI. Vicerrectorado de Investigación e Internacionalización. Universidad de La Laguna.
C/ Delgado Barreto s/n. 38071 La Laguna (Tenerife). Tel.: 922319523 - 922316502 (ext. 8940).
E-mail: segai@viinv.ull.es. CIF: Q3818001D.
IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE
PATOGENOS EN PLACA
ELABORADO/REVISADO REVISADO APROBADO
FECHA: 18 Mayo 2015 FECHA: 20 Mayo 2015 FECHA: 22 Mayo 2015
Firma:
Firma: Firma:
RESPONSABLE SERVICIO
Nombre: Basilio Valladares
Hernández
RESPONSABLE CALIDAD
Nombre:
DIRECTORA
Nombre: Raquel Marín
Cruzado
MODIFICACIONES A LA EDICIÓN ANTERIOR
CONTROL DE DISTRIBUCIÓN
Destinatario:
Nº de copia controlada:

2. IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE PATÓGENOS EN PLACA
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1. OBJETO
La presente Instrucción Técnica tiene como objeto describir la sistemática para realizar
Identificación de patógenos desde material sólido o líquido.
2. ALCANCE
Se aplica a todas las muestras de origen animal o vegetal, cultivos celulares, etc que
recibe el servicio y que se necesita conocer si la muestra presenta contaminación por
microorganismos e identificar el patógeno concreto.
3. RESPONSABILIDADES
La responsabilidad de la identificación recae sobre el personal (Técnico y/o Becario) que
realice el proceso de “Identificación o/y recuento de patógenos en placa”.
4. DEFINICIONES
 PLACA DE PETRI: es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta
de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se
pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética. Se
utiliza en Microbiología para cultivar células, observar la germinación de las
semillas o examinar el comportamiento de pequeños animales.
 MEDIO AGAR: es una placa de Petri que contiene un medio de cultivo
(comúnmente agar más nutrientes) usada en microbiología para cultivar
microorganismos o pequeñas plantas. Se pueden agregar compuestos como
antibióticos, para hacer el medio selectivo.
 POTTER: es un homogeneizador utilizado para la homogeneización de distintos
tipos de materiales, tales como tejidos, plantas, alimentos, suelo, y muchos otros.
5. DIAGRAMA DE FLUJO
No aplica.

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6. DESARROLLO
La determinación del contenido de patógenos en una muestra se realiza, normalmente,
por siembra en una placa, de un volumen o cantidad determinada de la muestra, por
incubación a una temperatura concreta y en un tiempo determinado, y por recuento
posterior de las colonias desarrolladas y con la aceptación implícita de que cada colonia
es originada por una bacteria de la muestra inicial, por lo tanto, el número de colonias
equivaldrá al número de bacterias en el volumen sembrado.
6.1. MATERIALES Y REACTIVOS
 Muestra de un volumen mínimo de 100 ml o de una cantidad mínima de 10 gr
obtenida en recipientes estériles.
 3 tubos de ensayo conteniendo c/u 9 ml de agua de peptonada estéril para diluciones.
 Gradilla.
 Homogeneizador Potter
 Pipetas estériles de 1 ml graduadas en décimas.
 3 cajas Petri estériles.
 Mechero Bunsen.
 Encendedor.
 Incubadora.
6.2. PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS
El personal del servicio realiza el procesamiento y el análisis para el diagnóstico
microbiológico de las muestras siguiendo el Reglamento (CE) 2073/2005, de la comisión
de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los
productos alimenticios y sus posteriores modificaciones.
El procesamiento y el análisis se realiza en condiciones asépticas, siguiendo los
siguientes pasos:
1.- Antes de que el medio de cultivo solidifique verter el medio agar en cada una de
las placas rotuladas de 10-1
a 10-3
(10ml/placa) y repartir el agar mediante movimientos de
translación y rotación en una superficie plana aproximadamente durante 1 minuto

4. IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE PATÓGENOS EN PLACA
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evitando que se mojen la tapa y los costados de la caja, de esta manera el agar se
distribuye homogéneamente.
2.- Dejar reposar las placas el tiempo necesario para que solidifique el agar.
3.- Agitar vigorosamente la muestra si es líquida, para homogeneizar.
4.- Pipetear 1 ml u obtener 1 mg de muestra y verterlo en el primer tubo con 9 ml de
agua peptonada de dilución estéril, quedando entonces una dilución de 10-1
.
5.- Agitar para homogeneizar o homogenizar con un potter si la muestra es sólida y
tomar 1 ml de esta dilución (10-1
) y verterlo en el segundo tubo, quedando una dilución de
10-2
.
6.- Agitar para homogeneizar y tomar 1 ml de esta dilución (10-2
) y verterlo en el
tercer tubo, quedando una dilución de 10-3
.
7.- Utilizando pipeta estéril, tomar 1 ml de la dilución 10-1
y verterlo en la caja Petri
estéril con el medio marcada con 10-1
, distribuyéndolo bien la muestra en la superficie del
agar.
8.- De la misma manera, tomar 1 ml de la dilución 10-2
y verterlo en la caja Petri
marcada con 10-2
.
9.- Hacer lo mismo con el tubo de la dilución 10-3
y la placa marcada con 10-3
. Es
recomendable usar una pipeta estéril para cada dilución.
10.- Una vez la muestra se ha secado, incubar en posición invertida con objeto de
que el agua de condensación del agar no caiga sobre la superficie del cultivo. Las
condiciones de incubación son: 37 °C (±1 °C) durante 24-42 horas.
12. Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han desarrollado
en cada una de las placas.
NOTA: Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:
- Seleccionar la dilución que contengan entre 25 y 250 colonias y descartar las
otras.
- Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la incubadora, se
pueden conservar las placas dentro del refrigerador entre 5 y 10 °C, durante un período
máximo de 24 horas.

5. IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE PATÓGENOS EN PLACA
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6.3. CÁLCULO Y PRESENTACION DE RESULTADO
La expresión del resultado es directa, si la cantidad de muestra sembrada ha sido de 0.1
ml, el número de colonias contadas habrá de dividirse por el volumen de muestra
sembrada, es decir, por 0.1, para obtener el número de colonias por mililitro.
Los resultados se expresarán así en las siguientes unidades:
Número de bacterias: ____ UFC/ml ó gr.
El personal responsable del ensayo registrará en el R.01/IT-SG-14, “Identificación o/y
recuento de patógenos en placa”, el resultado del recuento indicando el código de las
muestras, el patógeno, el medio de cultivo y las unidades de formación de colonias (UFC)
y los resultados de la identificación, indicando el código de las muestras, el patógeno y si
el resultado es positivo o negativo.
7. REGISTROS
Registros /Anexos Código
Responsable
archivo
Soporte
Tiempo
conservación
Identificación o/y
recuento de
patógenos en placa
R.01/IT-SG-14
Responsable del
Servicio
Papel 3 años

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IDENTIFICACIÓN O/Y RECUENTO DE
PATÓGENOS EN PLACA
Referencia R.01/IT-SG-14
Rev. 01
ID
Datos de la muestra
Código/s laboratorio
Personal responsable del ensayo
Tipo de muestra:
Muestra sólida
Muestra líquida
Resultado del recuento
Código/s de Laboratorio Patógeno Medio de cultivo UFC
Resultado de la identificación
Código de Laboratorio Patógeno
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Observaciones
Personal del Servicio
Fecha - - 20
Fdo.: