2.5.15 tripanosomosis

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 815
C A P Í T U L O 2 . 5 . 1 5 .
TRIPANOSOMIASIS
(Trypanosoma evansi)
RESUMEN
La tripanosomiasis1 causada por Trypanosoma evansi (“surra”) es la tripanosomiasis patogena
animal con una distribución geográfica más amplia, y afecta al ganado doméstico de Asia, África,
América Central y Sudamérica. La especie hospedadora principal varía según el área geográfica,
pero en particular el búfalo, el ganado vacuno, los camellos y los caballos resultan ser los más
afectados, aunque también hay otros animales susceptibles. Es una enfermedad transmitida por
artrópodos y se considera que los vectores más importantes son varias especies de Tabanus. Por
lo general, el diagnóstico de la surra se basa en la demostración de los parásitos en la sangre,
complementándolo con pruebas hematológicas, bioquímicas y serológicas complementarias.
En animales susceptibles la enfermedad se manifiesta por fiebre, vinculada directamente a la
parasitemia, junto con una anemia progresiva, pérdida de la condición normal y decaimiento.
Durante el curso de la enfermedad ocurren episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A
menudo se observa edema, particularmente en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria
y hemorragias petequiales de las membranas serosas. En Asia se han descrito abortos en los
búfalos. Existen indicios de que la enfermedad provoca inmunodeficiencias. Sin embargo, aunque
los signos clínicos de la surra resultan indicativos, no son suficientemente patognomónicos, y se
debe confirmar el diagnóstico por métodos de laboratorio.
Identificación del agente: Se requiere un diagnóstico de laboratorio porque los síntomas clínicos
generales de las diversas formas de infección por T. evansi no son patognomónicos. Cuando
existe una parasitemia alta, el examen de extensiones de sangre fresca, los frotis de sangre teñida
y el material de los nódulos linfáticos deben revelar la presencia de tripanosomas. En los casos
más crónicos, como en la fase de portador, se recomienda el examen de frotis sanguíneos muy
densos, así como métodos de concentración de los parásitos y la inoculación en animales de
laboratorio. En la actualidad se está explorando un enfoque complementario atractivo basado en la
aplicación de pruebas para la detección del antígeno. También existen ensayos piloto con
versiones de enzimoinmunoensayo y aglutinación con látex. Mediante la reacción en cadena de la
polimerasa, se pueden detectar pequeñas cantidades de secuencias del ADN de los tripanosomas,
bien definidas y muy específicas, en la sangre y otras muestras de los hospedadores infectados.
Las pruebas hematológicas y bioquímicas no son específicas de una infección por T. evansi, pero
revelan las consecuencias patológicas de la infección. Tales pruebas ayudan a analizar los
resultados de la quimioterapia en áreas donde la enfermedad es endémica. Las pruebas incluyen
la determinación del volumen de las células sanguíneas empaquetadas y los niveles de
inmunoglobulinas.
Pruebas serológicas: La infección provoca respuestas de anticuerpos específicos y se han
introducido diversas pruebas de detección de anticuerpos. Éstas se han validado en parte, pero
aún están pendientes de evaluación y normalización a gran escala. En el laboratorio se pueden
emplear ensayos de inmunofluorescencia y enzimoinmunoensayos. Para condiciones de campo,
todavía deben desarrollarse pruebas relativamente sencillas. Las mas adecuadas son las pruebas
de aglutinación directa con los tripanosomas del torrente circulatorio, las pruebas de aglutinación
indirecta con eritrocitos recubiertos por antígeno (hemoaglutinación indirecta) o con partículas de
látex. Los ensayos para detectar anticuerpos circulantes tienen un elevado índice de validez. Las
1 Nomenclatura de enfermedades parasitarias: véase la nota en el Capítulo 2.3.15. Tripanosomiasis (transmitida por la
mosca tse-tsé).

Capítulo 2.5.15. — Tripanosomiasis (Trypanosoma evansi)
816 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
estimaciones de los valores predictivos de las distintas pruebas serológicas indican que los
enzimoinmunoensayos (ELISA) para detectar anticuerpos IgG son probablemente los más
indicados para clasificar correctamente los animales no infectados, y que las pruebas de
aglutinación en placa (CATT) son probablemente las más apropiadas para clasificar de modo
correcto a los animales verdaderamente infectados. Por tanto, una prueba ELISA para determinar
IgG sería adecuada para comprobar, antes de un desplazamiento o durante una cuarentena, que
los animales están libres de infección. En situaciones en las que la enfermedad se presenta
abiertamente, las pruebas CATT se pueden utilizar para establecer un tratamiento individualizado
de los animales contra los tripanosomas. Para declarar un estado de ausencia de enfermedad se
recomiendan pruebas seriadas, esto es, una prueba ELISA seguida de una comprobación por
CATT de muestras sospechosas. No obstante, debe destacarse que hay una considerable similitud
antigénica entre las diferentes especies de tripanosomas patógenos, por lo que en zonas en que
ocurre la tripanosomiasis transmitida por la mosca tse-tsé se producirán reacciones cruzadas en
cualquier prueba serológica utilizada.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existen vacunas para la
enfermedad.
A. INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de la infección por Trypanosoma evansi, que es una enfermedad transmitida por artrópodos, se
basa en síntomas clínicos y en la demostración de la presencia de los parásitos por métodos directos o
indirectos.
Los síntomas clínicos de la tripanosomiasis, la enfermedad causada por T. evansi, resultan indicativos, pero no
son suficientemente patognomónicos, por lo que el diagnóstico de la enfermedad se debe confirmar por métodos
de laboratorio. En los animales susceptibles, que incluyen ganado bovino, búfalos, camellos y dromedarios,
caballos, cerdos, ovejas y cabras, la enfermedad se manifiesta con fiebre, asociada directamente a la
parasitemia, junto a una anemia progresiva, pérdida de la condición normal y lasitud. Durante el curso de la
enfermedad ocurren episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A menudo se observa edema, particularmente
en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria y hemorragias petequiales de las membranas serosas. En
Asia se han descrito abortos en los búfalos (15). Existen indicios de que la enfermedad provoca
inmunodeficiencias (26).
Hay una variación considerable en la enfermedad en lo que respecta a la patogenicidad de cepas diferentes y a
la susceptibilidad de diferentes especies de hospedadores. La enfermedad se puede manifestar en forma aguda
o crónica, y en el último caso puede persistir durante muchos meses. A menudo la enfermedad es mortal en
camellos, búfalos, ganado bovino, llamas y perros, pero en estas especies también se pueden presentar
infecciones suaves y subclínicas. Algunos animales salvajes, como los ciervos y los roedores capibaras, pueden
resultar infectados. Los animales sometidos a estrés –malnutrición, embarazo, trabajo- son más susceptibles a la
infección.
Trypanosoma evansi es biológicamente muy similar a T. equiperdum, el agente causal de la durina, y se parece
morfológicamente a las formas delgadas de los tripanosomas transmitidos por la mosca tse-tsé, T. brucei,
T. gambiense y T. rhodesiense. La caracterización molecular de varias cepas de T. evansi aisladas de Asia,
África y Sudamérica indica que tienen un único origen. Además, es también probable que T. evansi y
T. equinoperdum pertenezcan a la misma especie. Como todos los tripanosomas patógenos, T. evansi está
recubierto por una densa capa proteica formada por una única proteína llamada la glicoproteína variable de
superficie. Ésta actúa como el inmunógeno principal e induce la formación de anticuerpos específicos. Los
parásitos con capaces de evitar las consecuencias de estas reacciones inmunes cambiando la glicoproteína
variable de superficie, fenómeno que se conoce como variación antigénica.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1. Identificación del agente
El método directo y clásico para el diagnóstico de la tripanosomiasis condujo al descubrimiento original del
parásito. Todavía se emplea para examinar muestras de sangre o de nódulos linfáticos, pero raramente con
extractos de otros tejidos. No es posible una identificación microscópica específica por frotis de sangre en
regiones donde además de T. evansi se presentan T. brucei y T. equiperdum. En el futuro, se podrá disponer de

sondas de ADN específicas (22,36) que permitan la identificación de especies de tripanosomas por hibridación
no radioactiva de ADN.
• Métodos directos
a) Métodos normales de campo
i) Muestra de sangre
Como el resto de los miembros del subgénero Trypanozoon, T. evansi es un parásito sanguíneo y de
los tejidos; en particular, se encuentra en los vasos sanguíneos profundos en los casos de parasitemia
baja. Por esta razón se recomienda que la sangre para diagnóstico se obtenga tanto de los vasos
periféricos como de los profundos. Sin embargo, es preciso saber que por examen de la sangre
periférica se pueden identificar menos del 50% de los animales infectados.
La sangre periférica se obtiene por punción de una pequeña vena de la oreja o de la cola. Las
muestras más profundas se toman con una jeringuilla de una vena más grande. Primero se limpia con
alcohol un área marginal de la oreja o de la punta de la cola y, cuando está seca, se pincha con un
instrumento adecuado. Es importante esterilizar los instrumentos o emplearlos de un solo uso entre
animales individuales, de modo que la infección no se transmita por sangre residual.
ii) Extensiones de sangre fresca
Se coloca sobre un porta de vidrio limpio una pequeña gota de sangre y se deposita encima un cubre
para extender la sangre como si fuera una monocapa de células. Ésta se examina por microscopía de
fondo claro (x200) para detectar cualquier tripanosoma móvil.
iii) Tinción de frotis densos
En el centro de un porta para microscopía se coloca una gota grande de sangre y se extiende con un
palillo o el borde de otro porta hasta cubrir un área aproximada de 1,0-1,25 cm de diámetro. Se deja
secar durante al menos 1 hora protegiendo la preparación de insectos. El frotis sin fijar se tiñe durante
25 minutos con Giemsa (una gota de Giemsa comercial + 1 ml de solución salina tamponada con
fosfato [PBS, 2,4 g de Na2HPO4.2H2O, 0,54 g de NaH2PO4.2H2O, 0,34 g de NaCl], pH 7,2). Después
de lavar, los portas se examinan en un microscopio de fondo claro a un aumento elevado (x500-
1.000). La ventaja de la técnica de frotis denso es que concentra la gota de sangre en un área
pequeña y se necesita menos tiempo para detectar los parásitos. La desventaja es que se pueden
dañar los parásitos durante el proceso, y el método no es por tanto adecuado para identificación de
especies en el caso de infecciones mixtas.
iv) Tinción de frotis finos
Se coloca una gota de sangre a 20 mm de un extremo de un porta limpio para microscopía y se
prepara una extensión fina del modo usual. La extensión se seca brevemente al aire, se fija durante
2 minutos con alcohol metílico y se deja secar. Luego los frotis se tiñen 25 minutos con Giemsa (una
gota de Giemsa + 1 ml de PBS, pH 7,2). Esta preparación se escurre, se lava con agua del grifo y se
seca. Los frotis no fijados se pueden teñir cubriéndolos 2 minutos con colorante de May-Grünwald, y
se añaden luego un volumen igual de PBS, pH 7,2, dejando los portas durante otros 3 minutos. Esta
preparación se escurre y se añade Giemsa diluido, que se mantiene durante 25 minutos. Ésta se
vierte de nuevo, se lava el porta con agua de grifo y se seca. Los portas se examinan a elevado
aumento (x400-1.000). Esta técnica permite estudios morfológicos detallados y la identificación de la
especie de tripanosoma. También existen técnicas rápidas de tinción (Tinción de Field, Diff Quick®).
v) Biopsias de nódulos linfáticos
Normalmente las muestras se obtienen de los nódulos linfáticos preescapulares o precrurales
(subilíacos). Se selecciona por palpación un nódulo adecuado y se limpia la zona con alcohol. El
nódulo se pincha con una aguja adecuada y el material del nódulo linfático se aspira en la jeringuilla.
Este material se sitúa luego sobre un porta, se tapa con un cubre y se examina como en las
preparaciones de sangre fresca. También se pueden guardar frotis fijados para examen posterior.
b) Métodos de concentración
En muchos hospedadores T. evansi puede inducir infecciones clínicas leves o un estado subclínico de
portador con baja parasitemia en donde resulta difícil poner de manifiesto los parásitos. Pueden necesitarse
métodos de concentración.
i) Centrifugación de hematocrito
Se recoge sangre (70 µl) en tubos capilares (75 x 1,5 mm) con heparina, que luego se cierran por el
extremo seco y se centrifugan, con el extremo cerrado hacia abajo, a 3.000 g durante 10 minutos. Se
pegan a un porta dos trozos de cristal (25 x 10 x 1,2 mm) y se coloca entre ellos el tubo capilar. Se
puede colocar encima un cubre al nivel de la unión de la capa de leucocitos, donde los tripanosomas
aparecerán concentrados. El espacio alrededor de esta parte del capilar se rellena con agua o con

aceite de inmersión, y se examina el área de la capa de leucocitos al microscopio (100-200x). Una
alternativa más simple consiste en examinar el tubo capilar centrifugado colocando una gota de aceite
de inmersión sobre el tubo y asegurándose de que hay contacto entre la lente objetivo y el aceite de
inmersión.
ii) Técnica de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases
Se recoge sangre en tubos capilares con heparina y se centrifuga como se indica arriba. El tubo se
marca y se rompe 1 mm por debajo de la capa de leucocitos, de tal modo que la parte de arriba
contiene la capa superior de eritrocitos (RBCs), la capa de leucocitos y algo de plasma. El contenido
de esta parte se saca parcialmente sobre un porta, se cubre con un cubreobjetos y se examina por
microscopía de campo oscuro, por microscopía de contraste de fases o por microscopía ordinaria de
campo claro.
Como alternativa a la centrífuga de hematocrito que funciona con electricidad, se han utilizado con
éxito microcentrífugas manuales para la detección de la tripanosomiasis en ganado bovino y en
camellos (8,13).
iii) Técnicas hemolíticas
Se puede utilizair dodecil sulfato sódico (SDS) como reactivo para provocar la hemolisis de RBCs y
facilitar así la detección de los tripanosomas móviles en las muestras de sangre parasitada. Como el
SDS es tóxico, se debe evitar el contacto con la piel, su inhalación y su ingestión. La solución de SDS
se puede guardar varios meses a temperatura ambiente. Tanto la solución de SDS como la muestra
de sangre deben utilizarse a temperaturas superiores a 15°C. A temperaturas más bajas, los
tripanosomas pueden destruirse.
Se pueden aplicar dos procedimientos generales2, la clarificación de frotis de sangre fresca y la
centrifugación de hemolisis.
• Método de clarificación de frotis de sangre fresca
Este método usa la lisis parcial de RBC para facilitar la detección de tripanosomas móviles. El método
requiere una solución de SDS: 1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solución salina, pH 7,5, asas de
inoculación (de 10 µl), portas y cubres (24 x 24 mm), y una gota de sangre fresca o heparinizada. Se
disuelven 100 mg de SDS en 100 ml de tampón isotónico Tris/NaCl/glucosa, pH 7,5 (14 g de Trizma
base, 3,8 g de NaCl, 10.8 g de glucosa; disolver los productos en 750 ml de H2
O destilada, añadir 90-
100 ml de HCl 1 N y ajustar el pH a 7,5, luego llevar a un volumen final de 1.000 ml con H2
O
destilada). Este tampón se puede guardar en viales pequeños durante varios meses a temperatura
ambiente. La prueba no aporta una mayor sensibilidad que la técnica de las extensiones de sangre
fresca. Además, el SDS puede causar problemas al enfocar el microscopio y los movimientos de los
tripanosomas se pueden limitar debido a la alta viscosidad del SDS.
Poner aproximadamente 10 µl de sangre en un porta. Añadir 10 µl de la solución de SDS utilizando un
asa de inoculación y mezclar ligeramente. Aplicar un cubre. Visualizar sin retraso toda la preparación a
bajo aumento (x100 o x200).
• Técnica de la centrifugación de hemolisis
Para este procedimiento se requiere una lisis casi completa de RBC. El material requerido incluye:
solución de SDS (0.1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solución salina, pH 7,5), tubos cónicos de
centrífuga, tubos de ensayo ordinarios, pipetas de plástico de punta larga y fina con perilla de goma
incorporada, portas, cubres (24 x 24 mm o 24 x 32 mm), y sangre con heparina.
Utilizando una pipeta o una jeringuilla, se transfieren nueve volúmenes de solución de SDS (máximo
6,3 ml) a un tubo de ensayo ordinario. Aspirar un volumen (máximo 0,7 ml) de sangre heparinizada
con una pipeta con perilla de goma y depositarlo justamente encima de la superficie de la solución de
SDS; mezclar rápida y minuciosamente. Evitar la formación de espuma, que puede destruir los
tripanosomas. Esperar 10 minutos para permitir una hemolisis completa.
Poner la suspensión hemolizada en tubos cónicos de centrífuga y centrifugar a aproximadamente
500 g durante 10 minutos. Sin alterar el sedimento, extraer tanto sobrenadante como se pueda
mediante una pipeta limpia con perilla. Utilizando de nuevo una pipeta de punta fina y con perilla,
extraer más sobrenadante, dejando en el fondo 10-20 µl de sobrenadante sin alterar. Luego se recoge
con mucho cuidado el sedimento completo y se pone sobre un porta. Se aplica un cubre y se examina
la preparación completa sin retraso a bajo aumento (x100 o x200).
iv) Técnica de mini-intercambio aniónico y centrifugación
Cuando se pasa a través de una columna apropiada de intercambio aniónico una muestra de sangre
humana o animal que esté infectada por tripanosomas, como las células sanguíneas del hospedador
2 Se pueden obtener todas las instrucciones y materiales necesarios del Instituto de Medicina Tropical, Laboratorio de
Serología, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Bélgica.

están cargadas más negativamente que los tripanosomas, se adsorben al intercambiador aniónico,
mientras que los tripanosomas resultan eluidos manteniendo su viabilidad y su infectividad. Se ha
desarrollado un método de campo simplificado para la detección de parasitemias bajas (14, 17, 31). La
sensibilidad de esta técnica puede aumentarse aproximadamente diez veces cuando se utilizan
preparaciones de leucocitos en vez de sangre completa (30).
• Preparación de solución salina de glucosa tamponada a pH 8
Na2HPO4 (anhidra) (13,48 g); NaH2PO4.2H2O (0,78 g); NaCl (4,25 g); agua destilada (1 litro).
Las soluciones de diferente fuerza iónica se hacen diluyendo el stock de PBS, pH 8, y añadiendo
glucosa para mantener una concentración adecuada. Para sangre de ratón, de rumiantes salvajes y
domésticos, y de perro, añadir 4 partes de PBS a seis partes de agua destilada y ajustar la
concentración final de glucosa a 1%. Para sangre de cerdos o conejos, añadir tres partes de PBS a
siete partes de agua destilada y ajustar la concentración final de glucosa a 1,5%. La solución de
PBS/glucosa (PSG) debe estar estéril.
• Equilibrado de la matriz de DEAE-celulosa
Suspender 500 g de DEAE-celulosa (dietilamino-etilcelulosa) en 2 litros de agua destilada. Ajustar el
pH a 8 con ácido fosfórico. Dejar sedimentar durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante que
contiene gránulos finos. Repetir el proceso tres veces. Guardar la suspensión equilibrada y
concentrada (con aspecto de gel blando) a 4°C o en pequeñas alícuotas a –20°C.
• Montaje de la matriz de DEAE-celulosa equilibrada
Se dispone una jeringuilla de 2 ml sin su émbolo y provista de aguja (20 G x 1,5 pulgadas) sobre una
gradilla. En el fondo de la jeringuilla se coloca un disco de papel de filtro Whatman No. 41 y se
humedece con unas cuantas gotas de PSG. Se vierten en la jeringuilla 2-2,5 ml del gel de celulosa
equilibrada y se compacta mediante elución con el tampón. La altura del sedimento debe ser
aproximadamente 3 cm. Se lava y se equilibra la columna con 2 ml de PSG sin alterar la superficie.
• Adsorción de la sangre y elución de los tripanosomas
Colocar con cuidado 100-300 µl de sangre heparinizada sobre la superficie de la columna de celulosa.
Añadir diez gotas de PSG y desechar las primeras diez gotas eluídas. Ir añadiendo 1.5 ml de PSG y
comenzar a recoger el eluato en una pipeta Pasteur de punta fina con su extremo cerrado. Poner la
pipeta llena, protegiendo su extremo con la punta de una pipeta cónica de plástico, dentro de un tubo y
centrifugar a 525 g (o hasta 1.000 g) durante 10 minutos. Examinar la parte inferior de la pipeta al
microscopio (x100 o x200) utilizando un dispositivo especial de montaje. Alternativamente, el eluato se
puede recoger en tubos de plástico de 50 ml, con fondo cónico, centrifugar a 1.000 g y examinar el
sedimento por microscopía de fondo oscuro.
Durante el proceso, la columna debe permanecer constantemente húmeda.
c) Inoculación en animales
Se pueden utilizar animales de laboratorio para revelar infecciones subclínicas (no patentes) en animales
domésticos. Trypanosoma evansi tiene un amplio rango de infectividad entre los pequeños roedores, de
modo que se utilizan con frecuencia ratas y ratones. En estudios de infecciones de camellos por T. evansi,
se han hecho comparaciones entre los análisis mediante frotis densos de sangre y las pruebas de
inoculación en rata y en ratón; la inoculación en animales dio resultados más positivos, 15,2% y 17%
respectivamente, que el análisis sólo de frotis densos (7,27). Aunque la inoculación en ratón no es sensible
al 100% (19) se puede mejorar la técnica utilizando como material la capa de leucocitos. Se ha utilizado un
procedimiento modificado de inoculación en ratón que permite detectar un nivel tan bajo como 1.25
T. evansi/ml de sangre (30).
La sangre tratada con el anticoagulante heparina sódica se inocula intraperitonealmente en ratas (1-2 ml) o
ratones (0,25-0,5 ml). Se recomienda la inoculación de un mínimo de dos animales; los animales se
sangran por la cola tres veces a la semana para detectar la parasitemia. El período de incubación antes de
la aparición de los parásitos y su virulencia depende de la cepa de los tripanosomas, su concentración en el
inóculo, y la cepa de animal de laboratorio empleada. La sensibilidad de este sistema de cultivo in vivo tal
vez se pueda mejorar con el uso de animales de laboratorio inmunosuprimidos. A tal fin, se utilizan
compuestos como ciclofosfamida o acetato de cortisona, irradiación con rayos X o esplenectomía.
d) Sondas de ADN recombinante
Se están evaluando sondas específicas de ADN para detectar tripanosomas en sangre o tejidos infectados
(22,36).

• Métodos indirectos
Estos métodos implican pruebas hematológicas o bioquímicas que demuestran los efectos del parásito sobre su
hospedador en vez de detectar directamente el parásito mismo.
a) Hematología
La anemia suele ser un indicio fiable de infestacion por tripanosoma, aunque no es patognomónico. Sin
embargo, hay animales con infección subclínica suave que pueden tener parasitemia sin evidencia de
anemia.
La anemia se puede determinar midiendo el volumen de células empaquetadas y puede utilizarse en la
vigilancia de rebaños o manadas en riesgo. Esta técnica es idéntica a la de centrifugación del hematocrito.
Se examina el tubo capilar y los resultados se expresan como porcentaje del volumen de RBCs
empaquetadas respecto al volumen total de sangre.
b) Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas incluyen la floculación, la formación de gel con formol, la precipitación con cloruro
mercúrico y el ensayo de turbidez con timol. Otros métodos más antiguos que se consideran superados
tienen aún un cierto uso en condiciones de campo debido a que son simples de realizar. Todas las pruebas
dependen de un aumento en las globulinas séricas como consecuencia de la infección, pero este aumento
no es específico de una infección por T. evansi. Los ensayos de formación de gel con formol y los de
cloruro mercúrico constituyen las pruebas de elección. Estas pruebas se han utilizado principalmente en
camellos y se han utilizado raramente en otras especies. No existen datos sobre los niveles de globulinas
que se requieren para producir una reacción positiva.
Para la prueba del gel con formol, se ponen en un tubo aproximadamente 3-5 ml de sangre y se deja
coagular. Se pasa aproximadamente 1 ml de suero sin células a un tubo más pequeño y se añaden dos
gotas de solución de formalina (40% de formaldehído [p/v]). Si el suero se coagula inmediatamente y se
vuelve blanco, la prueba es positiva. En las reacciones negativas, el suero permanece sin cambios o la
coagulación puede tardar en aparecer hasta 30 minutos.
En la prueba del cloruro mercúrico, se ponen aproximadamente 1-2 ml de sangre venosa en un tubo seco y
se deja coagular. Para detectar casos precoces de infestación por T. evansi, es necesario utilizar la
concentración más alta de cloruro mercúrico que no precipite el suero normal, es decir, entre 1/20.000 y
1/30.0000. Se pasa a un tubo pequeño una solución de cloruro mercúrico diluido (1 ml) y se añade con
agitación suave una gota de suero libre de RBCs. Nota: deben tomarse precauciones cuando se maneja el
cloruro mercúrico, especialmente para evitar su absorción a través de la piel.
Una reacción positiva provoca la aparición de opacidad, mientras que una reacción negativa no detecta
cambios en 15 minutos. Algunos autores sostienen que esta prueba solo es válida en el caso de los
camellos (6).
c) Detección de antígeno
Se han presentado y evaluado a escala relativamente grande algunos enzimoinmunoensayos (ELISA) de
tipo piloto para detectar antígenos circulantes no variables de los tripanosomas (11). En principio, se espera
que los sistemas diseñados para T. brucei sean igualmente funcionales con todos los representantes del
subgénero Trypanozoon, incluido T. evansi (4, 5, 18, 25, 37). Recientemente se ha desarrollado una prueba
comercial de aglutinación de antígeno con látex para diagnosticar la surra (23), pero requiere más
evaluación.
d) Detección de ADN de los tripanosomas
En los últimos años, varios centros de investigación han estado trabajando en el desarrollo de
procedimientos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar pequeñas
cantidades de secuencias del ADN de los tripanosomas. Algunas publicaciones recientes sobre su posible
aplicación a T. evansi son las de Ventura et al. (33) y Wuyts et al. (38). Sin embargo, aún no hay sondas
disponibles de ADN específicas de especie para organismos de tipo Trypanozoon. Aunque las técnicas
moleculares tienen una elevada sensibilidad analítica, estudios experimentales con búfalos (9) han
demostrado que la sensibilidad diagnóstica de una PCR fue solo de un 78%, similar a la prueba de
inoculación en ratón.

2. Pruebas serológicas
Los métodos para detectar anticuerpos humorales específicos frente a antígenos de tripanosomas incluyen la
prueba de fijación de complemento (FC), la de hemoaglutinación indirecta y la de precipitación. Éstas no se han
aplicado en inspecciones a gran escala. Más recientemente, se han utilizado ensayos de inmunofluorescencia
indirecta (16, 20, 35), ELISA (2, 5, 16, 24, 28, 32, 40), y aglutinación en tarjeta (CATT) (1,39). En Indonesia y
Vietnam se ha llevado a cabo una extensa evaluación de métodos ELISA y CATT con búfalos (3,34). Se puede
simplificar la toma de muestras utilizando manchas de sangre en papel de filtro para uso posterior en ELISA,
mientras que en ensayos de tipo CATT se puede sustituir la sangre completa por suero (10). Otras
modificaciones innovadoras que se pueden desarrollar en un futuro son el uso de varillas con colorantes
coloidales (12) que podrían permitir la realización de pruebas bajo condiciones de campo.
a) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Como antígeno se utilizan frotis de sangre desecada que contengan de cinco a diez tripanosomas de
T. evansi por campo visual a un aumento de x500, recogida de un ratón o rata de 4 días después de la
infección. Los frotis se secan a temperatura ambiente durante 1 hora y se fijan en acetona durante
5 minutos. Cuando se mantienen secos, los frotis fijados se pueden guardar durante varios meses a –20°C.
En la prueba, los portas se subdividen primero en varias áreas utilizando medio de montaje o portas
multimedia revestidos de Teflon, y luego se lavan con PBS, pH 7,2 a temperatura ambiente durante
10 minutos. La solución stock de PBS contiene Na2HPO4.2H2O (9,72 g); KH2PO4 (2,15 g); NaCl (36,00 g);
NaN3 (1,0 g); y agua destilada (hasta 1 litro). Ésta se guarda a temperatura ambiente y se repone cada
mes. Antes de uso se diluye cinco veces con agua destilada.
Después de lavar, se añade un control de suero positivo y negativo y los sueros a ensayar (diluidos de
1/50 a 1/100 o más en PBS) y se deja reaccionar durante 30 minutos. Los portas se lavan tres veces
sucesivas con PBS durante 5 minutos cada vez. Luego se añade un antisuero conjugado con fluoresceína
que sea específico contra la especie ensayada y se deja durante 30 minutos. Los portas se vuelven a lavar
en PBS, se preparan con medio de montaje para inmunofluorescencia y se examinan en un microscopio de
fluorescencia. La solución de glicerol debe conservarse a 4°C y renovarse cada 2 semanas.
El conjugado de fluoresceína debe guardarse en pequeñas alícuotas a –20°C para evitar congelaciones y
descongelaciones repetidas. El tubo debe protegerse de algún modo de la luz, por ejemplo envolviéndolo
en papel de aluminio. El conjugado se diluye en PBS, pH 7,2, o en PBS que contenga azul de Evans al
1/1.000 (p/v) como un colorante de contraste que facilita la diferenciación entre la fluorescencia positiva
(verde) y la negativa (roja).
En general, los resultados más específicos se obtienen con conjugados anti-IgG monoespecíficos (contra la
cadena gamma).
b) Enzimoinmunoensayo
El principio de esta técnica se basa en que los anticuerpos específicos contra los tripanosomas se pueden
detectar por anti-inmunoglobulinas ligadas a un enzima utilizando como fase sólida placas de poliestireno
recubiertas de antígeno soluble. El enzima puede ser la peroxidasa, fosfatasa alcalina o cualquier otro
enzima apropiado. El enzima conjugado se une al complejo antígeno/anticuerpo y luego reacciona con un
substrato adecuado para producir un cambio de color característico del substrato mismo o de un indicador
añadido (el cromógeno).
El antígeno de recubrimiento de las placas deriva de la sangre de una rata con elevada parasitemia. Los
tripanosomas se separan por medio de una columna de DEAE-celulosa y se lavan tres veces por
centrifugación con PSG frío, pH 8 (PBS con glucosa al 1%). El sedimento final se resuspende en PSG frío a
una concentración del 3-5%, y se somete a ultrasonidos brevemente en hielo durante 30-120 segundos
hasta lograr la desintegración completa de los organismos. Esta preparación se centrifuga a 4°C y 40.000 g
durante 60 minutos. El sobrenadante se diluye con agua hasta obtener una concentración de proteína de
1 mg/ml. El producto así obtenido se puede guardar en pequeñas alícuotas a –70°C durante varios meses.
También se puede liofilizar y mantener a –20°C. Se han aplicado diversos tratamientos a las preparaciones
de antígeno para mejorar la precisión de la detección de anticuerpo (29).
• Procedimiento de la prueba
i) Antes de su utilización, el antígeno congelado o liofilizado se diluye o reconstituye con tampón
carbonato/bicarbonato 0,01 M, pH 9,6, recién preparado. El reactivo (100 µl) se añade a cada pocillo
de una placa de microtitulación y las placas se incuban durante toda la noche a 4°C o durante 1 hora a
37°C.

ii) Se elimina el exceso de antígeno, se lavan las placas con 0.01 M de PBS que contenga 0,05% de
Tween 20 (PBST), y se añaden diluciones de suero en PBST (100 µl). Las diluciones normales de
ensayo están entre 1/100 y 1/1.000.
iii) Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos y se lavan tres veces con PBST.
iv) Se añade la anti-globulina específica conjugada (100 µl) convenientemente diluida en PBST
(normalmente entre 1/1.000 y 1/50,0000).
v) Las placas se reincuban a 37°C durante 30 minutos y se lavan tres veces con PBST.
vi) En conjugados con peroxidasa se pueden utilizar varias soluciones de substrato/cromógeno, que
constan de peróxido de hidrógeno con un cromógeno, como tetrametilbenzideno (TMB), 2,2´-azino-
bis-(3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico) (ABTS) y orto-difeniléndiamina (OPD). Una posible
solución de substrato/cromógeno para conjugados con peroxidasa es peróxido de hidrógeno al 30%
(0,167 ml y 35 mg) en tampón citrato (100 ml), pH 6,0. El tampón citrato se prepara así: Solución A
(36.85 ml): (0,1 mM de ácido cítrico [21,01 g/litro]); Solución B: (65,15 ml): (0,2 M de Na2HPO4 [35,59
g/litro]; y agua destilada (100 ml). Disolver 10 mg de TMB en 1 ml de dimetil sulfóxido y añadir a 99 ml
del tampón citrato. Varias de estas combinaciones están disponibles comercialmente y listas para uso
y pueden permanecer estables a 4°C hasta 1 año.
vii) Se añade el substrato cromógeno (100 µl) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante
15–20 minutos.
viii) La reacción se detiene añadiendo 1M de ácido sulfúrico (50 µl). La absorbancia de la mezcla de cada
pocillo se lee a 450 nm para el cromógeno TMB. Otros cromógenos pueden requerir lecturas a otras
longitudes de onda. Todos los ensayos deben incluir sueros de control positivo de actividad alta y
media conocida, un suero de control negativo y un control del tampón.
Existe una amplia variedad de procedimientos de ensayo. Para especies animales muy relacionadas, con
frecuencia se pueden utilizar reactivos que dan reacción cruzada (por ejemplo, inmunoglobulina anti-bovina
en el caso de los búfalos). Al igual que para la inmunofluorescencia, generalmente se recomienda la
utilización de conjugados anti-IgG monoespecíficos. Hay varios métodos que se pueden utilizar para
determinar un punto de corte de diferenciación entre resultados positivos y negativos. El método más simple
es basar el corte en la inspección visual de los resultados del ensayo con poblaciones negativas y positivas
conocidas. Estos resultados muestran a menudo cierto solapamiento. El operador puede elegir el punto
más adecuado para modificar los resultados de falsos positivos o falsos negativos en función de la
aplicación del ensayo. Una alternativa es establecer el corte en el valor medio + 2 desviaciones estándar
(SD) o +3 SD en una muestra grande de animales negativos. Finalmente, si no se dispone de muestras
positivas/negativas se puede establecer el corte basándose en el análisis de los datos en animales en
situación endémica. Si se separan los animales infectados y los no infectados según una distribución
bimodal, entonces se puede seleccionar un valor adecuado. Es probable que los métodos ELISA
identifiquen correctamente los animales no infectados. Los resultados equívocos pueden volver a
ensayarse mediante CATT. Actualmente no hay antígenos definidos fácilmente disponibles. El Instituto de
Medicina Tropical en Antwerp tiene algunos antígenos todavía en fase de evaluación. Este instituto dispone
de preparaciones CATT. Los ensayos para diagnóstico que incorporan antígenos derivados de un único
VAT deben interpretarse con cautela y ser evaluados por completo en diferentes hospedadores y
áreas geográficas distintas para determinar si su comportamiento es válido en todo el espectro de infección
de T. evansi.
c) Pruebas de aglutinación en placa
Se sabe que varias cepas de tripanosomas de diferentes áreas comparten algunos tipos predominantes de
antígenos variables (VATs). Teniendo en cuenta este hecho, el Laboratorio de Serología del Instituto de
Medicina Tropical de Antwerp desarrolló un ensayo de campo para el diagnóstico de la enfermedad del
sueño, la prueba de la aglutinación en placa CATT/ T. brucei gambiense (21). Esta prueba usa
tripanosomas fijados y teñidos de un VAT definido. En la reacción de aglutinación intervienen antígenos de
superficie, tanto variables como constantes. Se ha desarrollado un sistema de ensayo similar para el
diagnóstico de infecciones por T. evansi (1). La prueba CATT/ T. evansi se basa en la utilización de un VAT
de T. evansi muy distribuido –el RoTat ½. Este antígeno está siendo también evaluado en la actualidad
para ser utilizado en pruebas ELISA. El CATT requiere antígeno liofilizado, PBS, pH 7,4, tarjetas de
plástico, suero o sangre heparinizada y un aparato rotatorio. El antígeno liofilizado se puede conservar
hasta 1 año a 2–8°C. El antígeno reconstituido se puede mantener a 2–8°C durante 2 días, pero debe ser
utilizado preferentemente en 8 horas.
Para el análisis, se ponen 25 µl de suero de ensayo diluido (1/4 o 1/8) y una gota (45 µl) de suspensión de
antígeno en uno de los círculos de la placa de ensayo. Después de mezclar y extender los reactivos, la

placa se agita durante 5 minutos. Una reacción positiva se evidencia por la aparición de depósitos
granulados y azulados que son visibles a simple vista3.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No existen vacunas para esta enfermedad.
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3 En el Laboratorio de Serología del Instituto de Medicina Tropical, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Bélgica, se
encuentran disponibles preparaciones experimentales de CATT/ T. evansi para fines de evaluación. Están siendo
evaluadas en colaboración con el Instituto de Biología Molecular de la Universidad Libre de Bruselas, con apoyo
económico del Laboratorio Internacional para la Investigación de Enfermedades Animales (ILRAD), Nairobi, Kenya.

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