1. Estructura de los ácidos nucléicos
Naturaleza química
Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes
principales:
Azúcar, en concreto una pentosa.
Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas.
Ácido fosfórico.
El azúcar, en el caso de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa y en el caso de los ácidos
ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.
Reglas de Chargaff
1. La composición de bases del DNA varía de una especie a otra.
2. Las muestras de DNA aisladas a partir de tejidos diferentes de la misma especie tienen la misma
composición de bases.
3. La composición de bases del DNA de una especie no varía con la edad del organismo, ni con
el estado nutricional, ni con las variaciones ambientales.
4. La proporción de A = T y C = G
5. La suma de los residuos de purina es igual a la suma de los residuos de pirimidinas, es decir que
A+G =C+T.
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2. El modelo de la doble hélice de Watson y Crick
El ADN es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido dextrorso).
Enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas como si fuera un
sacacorchos.
Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un grupo fosfato
forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del
siguiente).
Las dos hélices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las
bases nitrogenadas de cada hélice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hélice
aparea con la Timina de la hélice complementaria mediante dos puentes de hidrógeno. Igualmente,
la Guanina de una hélice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de
hidrógeno.
Las dos hélices por razones de complementaridad de las bases nitrogenadas son antiparalelas,
teniendo secuencias de átomos inversas. Una hélice lleva la secuencia 5’P → 3’ OH , mientras que la
hélice complementaria sigue la secuencia de átomos 3’OH → 5’P.
Alternativas al modelo de la doble hélice de Watson y Crick
El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado en estudios del ADN en disolución
(hidratado). La denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor interés biológico ya que es la que presenta el
ADN en interacción con las proteínas nucleares. Además de la forma B, existen otras estructuras posibles que
puede presentar el ADN. Algunas de estas alternativas son las siguientes:
ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza
iónica se corresponde con el modelo de la Doble Hélice. 10 pb por giro
ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de
bases por giro completo y 23 Å de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la
de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN.
ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases
por giro completo y 19 Å de diámetro.
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3. ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro completo,
18 Å de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y
pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un
curso en zig-zag. Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en
cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería
posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina
son más accesibles.
ADN con enrollamiento paranémico: Las dos hélices se pueden separar por traslación, cada hélice
tiene segmentos alternantes dextrorsos y sinistrorsos de unas cinco bases. Uno de los principales
problemas del modelo de la doble hélice (ADN-B) es el enrollamiento plectonémico, para separar las
dos hélices es necesario girarlas como un sacacorchos, siendo necesario un gran aporte energético.
ADN triple hélice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple
hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas)
en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C
mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del
oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H
aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.
ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas
mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G).
Los extremos de los cromosomas eucarióticos (telómeros) tienen una estructura especial con un
extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una
secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los
extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en
guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
Fuerzas presentes en la doble hélice
Enlace de H con poca contribución (fuerza entrópica)
Apilamiento de bases (fuerza entálpica)
Interacciones hidrofóbicas (fuerza entálpica)
Interacciones iónicas de repulsión de fosfatos y la presencia de cationes que actúan como contra
iones estabilizando el DNA (los cationes divalentes son más eficientes que los monovalentes – el Mg2+
estabiliza la estructura del RNA).
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4. Densidad de los ácidos nucleicos
Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un
gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el DNA esto se debe al
apilamiento e interacción hidrofóbica de las bases.
Cuando se centrifuga a alta velocidad un solución densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular
(ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusión del soluto y la
fuerza de sedimentación, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la
dirección de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga).
Si añadimos al centrifugar una molécula de ADN, está migrará hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto
en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del
ADN centrifugado (densidad de flotación).
Desnaturalización del DNA
Desnaturalización: la proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar
con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el
contenido en G+C de una molécula, mayor cantidad de pares G-C
presentará, como consecuencia tendrá una mayor cantidad de triples enlaces
y, por consiguiente, será necesario suministrar una mayor cantidad de energía
a esa doble hélice para separar sus dos hebras (desnaturalización o fusión del
ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que
hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La
temperatura de fusión o melting (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad
del ADN de una mezcla está directamente relacionada con el contenido en
G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).
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5. ¿Cómo se mide?
La desnaturalización puede verificarse midiendo la absorbancia de la
luz UV que atraviesa una solución con DNA. El DNA absorbe a 260 nm;
cuando se encuentra como dsDNA, absorbe un 40% menos que
cuando se encuentra como ssDNA porque el efecto de apilamiento
entre las bases disminuye la capacidad de absorción. (ssDNA efecto
hipercrómico)
Efecto de la fuerza iónica
Al aumentar la fuerza ionica (concentración de Na) aumenta la Tm
porque esta aisla las cargas negativas de los fosfatos estabilizando la
doble hélice
Efecto de la concentración del DNA
Si variamos la concentración del DNA no tiene ningún efecto sobre la Tm porque siempre hay el mismo
porcentaje de GC, solo varia en el volumen en el que estaría disuelto
¿Cómo se pone en manifiesto?
Utilizando agentes desnaturalizantes como:
Variar la fuerza iónica afectando a las bases y favoreciendo la repulsión de los fosfatos.
Destruir la estructura del agua utilizando agentes caotrópicos y por lo tanto afectando las fuerzas
hidrofóbicas.
Aumentando el pH para desproteger a las bases e incentivar la tautomerización.
Introducir agentes formadores de puentes de hidrogeno para desfavorecer la unión entre bases.
Aumentar la temperatura para romper todas las fuerzas entálpicas.
Absorbancia del DNA
Absorbancia a 260nm: El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de
absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble
hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla
(efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a
nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.
Nucleótido
Doble s libres
Doble
hélice
hélice
sencilla
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EFECTO HIPERCRÓMICO

6. Renaturalización del DNA
La renaturalización es un proceso que depende del estado de desnaturalización. Cuando las hebras no están
completamente separadas, es un proceso muy rápido, pero deben existir al menos 12 residuos apareados por
complementariedad. Si las dos hebras ya estaban completamente separadas, el proceso se da en dos pasos.
En el primero, y relativamente lento, se encuentran las cadenas y se unen por complementariedad en una
pequeña secuencia. El segundo paso, más rápido, las bases se aparean sucesivamente como una
“cremallera” para formar la doble hélice.
La temperatura de renaturalización se define como: Trenaturalización= Tm – 20°C
La etapa limitante es la nucleación ya que depende de la frecuencia de choque de las moléculas y esta
depende de la concentración de las mismas.
Cinética de renaturalización, curvas Cot
Velocidad de renaturalización: la velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada
con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleotidos que tiene cada tipo
de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en
su mayoría sólo tiene secuencias que están una sola vez en el genoma (secuencias únicas). Sin embargo, los
organismos más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los
eucariontes tienen secuencias únicas (SU), secuencias de bajo número de copias (SBNC, 2-10 copias),
secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).
Distintos tipos de secuencias que se observan en el ADN de organismos eucarióticos
Genes o secuencias de copia única. En general, la mayor parte de los genes que codifican para polipéptidos,
los llamados genes estructurales, se encuentran en una sola copia en el genoma.
Secuencias moderadamente repetidas. Se trata de genes o secuencias funcionales que codifican para
proteínas relacionadas encuentran generalmente dispersas en el genoma, intercaladas en los brazos
cromosómicos, lo que da origen a una nueva clasificación, en secuencias intercaladas cortas (SINES) o largas
(LINES).
Secuencias altamente repetidas. Las secuencias altamente repetidas se encuentran agrupadas en sectores
cromosómicos definidos, generalmente alrededor del centrómero o de los telómeros de los cromosomas.
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7. Cot ½ es el valor de Cot cuando se reasocia el 50%
del DNA A mayor complejidad (tamaño),
aumenta Cot ½
La re asociación depende de la probabilidad de que
una secuencia encuentre a su complementaria por
lo tanto:
A mayor complejidad (tamaño) aumenta Cot
½ y aumenta la velocidad de renaturalización
Al aumentar el número de secuencias
repetidas, aumenta la probabilidad de re
asociación y aumenta Cot ½ (Ej. DNA satélite)
La velocidad disminuye al aumentar el % de
bases mismatch y por lo tanto disminuye Cot
½
Las curvas de renaturalización o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus
y bacterias, tienen forma de S, tienen un sólo punto de inflexión o punto medio de la reacción. Todas las
secuencias son únicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble
hélice. En cambio en eucariotas, la complejidad es mucho mayor porque existen diferentes secuencias y
cada una de ellas esta repetida. Por lo tanto la velocidad de renaturalización del DNA aumenta con respecto
a procariotas.
Para poder realizar el experimento y medir las concentraciones en el tiempo, se utiliza la propiedad de
absorbancia a 260 nm. La A260 de un DNA responde a:
Se puede medir la diferencia de los picos ss y de ds para ver la relación C/Co.
Para separar el dsDNA del ssDNA, se puede realizar
una cromatografía en columna usando hidroxiapatita,
un compuesto que es más afín por el DNA de simple
cadena. De manera que eluye primero el DNA de
doble cadena cuando se lava la columna con una
solución de hidróxido de sodio.
A partir de la segunda ecuación planteada se puede
observar que:
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8. Es decir que para 2 DNA distintos estamos renaturalizando en las mismas condiciones, nos permite hallar su
longitud.
K es proporcional a la complejidad del DNA y está relacionada con el factor N (que es la “longitud” de la
molécula de DNA). Se define a N como el número de nucleótidos de secuencias no repetidas, de donde:
De donde:
Dividiendo:
Para una secuencia poli dA-dT, el número de complejidad es 1, dado que no hay secuencias repetidas, para
una secuencia del tipo ACGTTAG el número de complejidad es 7, porque hay 7 diferentes nucleótidos.
Parámetro Efecto sobre Tm Efecto sobre la velocidad de
renaturalización
Composición de Incremento de Tm con el aumento del %G-C no ejerce efecto
bases
Longitud <150 bp; incremento de Tm con el incremento de Incrementa la velocidad con la
longitud; >500 bp no hay efecto longitud
Fuerza ióncia Incremento de Tm con el aumento de [Na+] optimo a 1.5M Na+
%bp mismatch Disminuye Tm con el aumento de %mismatch Disminuye la velocidad con el
aumento de %mismatch
Concentración no ejerce efecto Aumenta la velocidad con el
aumento de [DNA]
Agente disminuye Tm wcon el aumento de [formamide], optimo a 50% formamide
denaturalizante [urea]
Temperatura - optima at 20°C por debajo de Tm
Estructura del Cromosoma Eucariota
En el caso de los organismos eucariontes el cromosoma
nace fundamentalmente de la interacción entre el ADN,
las histonas y las proteínas no histónicas. Los cromosomas
eucarióticos son moléculas muy largas de ADN doble
hélice en interacción con proteínas (histonas y no histonas)
que se pueden encontrar desde estados relajados o poco
compactados como en los núcleos de las células en
interfase hasta en estados altamente compactados como
sucede en la metafase mitótica.
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9. Estructura del Cromosoma del los Virus
El material hereditario de los virus está organizado en cromosomas de diferente tipo. Desde el punto de vista
genético, los virus pueden clasificarse en virus ADN o ARN, doble hélice o hélice sencilla, y en circular o lineal.
Virus cuyo material hereditario es ADN.
Virus cuyo material hereditario es ARN.
Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN.
Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.
¿Cómo armamos un cromosoma artificial de levadura?
ARS1: secuencia de replicación autónoma
CEN4: centrómero del cromosoma IV, permite la segregación del plásmido durante la división celular
TELs: secuencias teloméricas.
HIS3, TRP1, URA3, TRP1: marcadores de selección
en levadura confieren prototrofía para histidina, triptófano y uracilo
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