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Biotecnología de proteínas
Proteínas usadas en la salud humana
Preparaciones hormonales Insulina, glucagon, hGH
Productos de la sangre Factores de coagulación, hSA
CitokinasInterleukinas, interferones
Enzimas Urokinasa, asparaginasa, tPA
Vacunas HBsA, HV
Anticuerpos monoclonales Contra varios antígenos.
Proteínas de usos industriales
ENZIMA APLICACIÓN INDUSTRIAL
 Proteasas
 Detergentes
 Fabricación de quesos
 Industria de la cerveza
 Industria del cuero y carne
 Digestivos para consumo humano y animal
AMILASAS
 Industrias de procesamiento de almidón
 Celulasas/hemicelulasas
 Industria de la cerveza
 Producción de jugos
 Aditivos para la alimentación animal

PECTINASAS
 Industrias procesadoras de frutas
 Producción de jugos
LIPASAS
 Industria Láctea
 Industria de aceites vegetales
GLUCOSA ISOMERASA
 Producción de jarabes de alta fructosa
LACTASA
 Hidrólisis de lactosa de leche
CICLODEXTRINGLICOSILTRANSFERASA
 Producción de ciclodextrina
PENICILINACILASA
 Producción de penicilinas semisintéticas
Downstreamprecessing
Recuperación y producción del producto
El downstreamprocessing no solo involucra la recuperación y purificación del producto sino también la evaluación del control de la
calidad, estabilización del producto final y ajuste de potencia.
NUNCA SE PURIFICA MAS DE LO NECESARIO
 Reducen la estabilidad biológica
 Disminuyen el rendimiento
Características del producto
 Costo razonable
 Rendimiento máximo
 Pureza adecuada
Construcción de un
organismo
recombinante.
INGENIERIA
GENÉTICA
Obtención del
producto.
FERMENTACIÓN.
Recuperación y
purificación del
producto.
PURIFICACIÓN.
Eliminacion de
desperdicios.
TRATAMIENTO DE
EFLUENTES

2. Página 2
 Propiedades físico químicas y biológicas deseadas
Las proteínas se clasifican en dos grandes grupos
 Terapéuticas y diagnostico  alto grado de pureza y pequeñas producciones
Enzimas para alimentación y bebidas  baja pureza
Escalado del proceso de purificación
Se inicia de acuerdo con las necesidades del mercado.
 Protocolo escala laboratorio
 Estudios en planta piloto
 Proceso en escala
Técnicas de recuperación y producción de productos
Recuperación
 Comprende la remoción de los componentes gruesos, como las células de un medio de cultivo en el caso de un producto
extracelular o de las proteínas contaminantes que están en mayor proporción.
 Son bastante generales y se aplican en casi todos los casos.
 Una vez que el producto ha sido recuperado, a veces es necesario purificarlo.
 Recuperación es sinónimo de aislamiento o enriquecimiento.
Purificación
Los métodos utilizados son muy dependientes del producto en particular y de su uso:
 Van ser distintos si se quiere purificar una pequeña molécula orgánica soluble ensolventes orgánicos que una enzima soluble
en agua. Además, también serán diferentessegún que el producto sea para uso industrial o farmacológico inyectable.
 Las técnicas de purificación son más sofisticadas por naturaleza, más lentas, y procesanmenores volúmenes de material.
 Algunas técnicas de recuperación pueden ser usadas en operaciones de purificación.
Técnica de separación Recuperación Purificación
Centrifugación X
Filtración X
Ultrafiltración X X
Precipitación X X
Partición X X
cromatografía X
Parámetros de evaluación de la purificación
Rendimiento o
Pureza y
Factor de purificación
Costo

3. Página 3
Separación sólido-liquido (Sedimentación y
centrifugación)
En los biorreactoes los microorganismos están suspendidos como células simples, fóculos o micelios. Un proceso de separación sólido-
líquido consta:
Pretratamiento
Para facilitar la operación, reducir la viscosidad y romper las estructuras gelatinosas. Ayudan a incrementar el tamaño de la
partícula a través de diferentes efectos como puede ser la neutralización de cargas o la generación de redes 3D a través de iones Ca.
Al, Fe o polímeros naturales o sintéticos. También se usa el cambio de pH
Físicos:
 Térmico
o Floculación
o Esterilización
Químicos:
 Floculantes
o Iones inorgánicos / pH
o polielectrolitos
 Ayuda filtros
o Tierra diatomeas
o Perlas de vidrio
Sistemas mecánicos de separación solido-liquido
Sedimentacion
Se basa en el movimiento de una partícula sólida en un líquido por la gravedad. Si las partículas tienen entre 5 a 50 µm pueden
usarse decantadores, si son mas pequeñas se necesitarán separadores centrífugos u otros. Hay que tener en cuenta la diferencia de
densidad ente el sólido y el líquido.
Centrifugación
Separa sustancias de diferente peso específico. Aplicaciones:
 Separación de biomasa
 Eliminación de desechos celulares
 Separación de proteínas
 Separación de matrices cromatograficas en batch
 Recuperación de cuerpos de inclusión
Pretratamiento Concentración Separación
Post-
tratamiento

4. Página 4
Filtración centrífuga
Separa por filtración donde la fuerza impulsora en lugar de ser una diferencia de presión es la centrífuga.
Centrífuga canasta
 Puede manejar un caldo con 1 – 5 % de sóldios
 Trabaja en el rango de 5000 – 9000 g
Sedimentación centrífuga
 Centrífuga tubular
 Centrífuga de cámara múltiple
 Centrífuga de tazón sólido
 Centrífuga de tornillo o decantadora
 Centrífuga de discos
Centrífuga tubular
 Mas eficiente y sencilla
 Contenido de sólidos < 0,5%
 Aceleración 12000 – 62000 g / alimentación 100 1/hr – 3500 1/hr
Centrífuga de cámara multiple
Aumenta la superficie del rotor por el agregado de rotores concéntricos. La velocidad de rotación es menor pero se compensa en
parte con el aumento del radio.
 2 a 6 cámaras
 Contenido de sólidos 1 – 5%
 5000 – 9000 g
Centrpifuga de razón sólido
Los sólidos son eliminados continuamente a través de un tubo ubicado sobre la superficie interna de la cámara. Sin embargo para
que los sólidos puedan ser removidos continuamente deben tener una proporción de líquido.
 Permite trabajar de forma continua
 Contenido de solidos entre 1 – 5 %
Centrífuga decantadora
Ideal para suspensiones con alto contenido de sólidos
 Descarga de sólidos entre 30 kg/hr – 60000 kg/hr
 Contenido de sólidos entre 2 – 60%
 Aplicación principal: tratamiento de aguas residuales
Centrífuga de discos
Se aumenta de manera muy importante la superficie de sedimentación. Es la ms usada en bioseparaciónes
 Flujo entre 0,5 – 1500 1/hr
 Contenido de sólidos:
o 1% centrífuga de retención
o <10% centrífuga de descarga intermitente y continua
 5000 – 15000 g

5. Página 5
Resumen
Tipo de
centrífuga
Tamaño
partícula
Contenido de
sólidos (%)
Prueba de
sedimentación
Prueba de
consistencia de
sólidos
Flujo de
alimentación
(L/min)
Fuerza g. max
Tubular 0,1 – 200 ≤ 0,5 2 – 20 Torta firme 8 – 120 12000 – 16000
Cámara simple 0,5 – 5000 1 – 5 2- 20 Torta firme 1,5 – 335 5000 – 9000
Discos y
boquillas
0,5 – 200 2 – 20 1 – 10 Lodo 30 – 3780 5000 – 8500
Discos de tazón
abierto
0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 1500 5000 – 7000
Discos y
boquillas
0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 570 1400 – 1500
Discos
intermitente
0,25 – 200 ≤ 1 1 – 10 Torta firme 0,4 – 1500 500 – 800
Tazón solido 2 – 5000 1 – 5 0 – 3 Torta firme 1,5 – 250 500 – 800
decantadora 2 – 5000 2 – 60 0 – 3 Lodo – torta 3,8 – 1900 2000 – 3200
Fundamentos de la sedimentación y centrifugación
El número de Reynolds relaciona las fuerzas inerciales y de fricción. Los sitemas que vamos a analizar están entre la condición de
Re<1 por lo tanto corresponden a la zona conocida como de resistencia viscosa y la fuerza de fricción se puede calcular a través de la
ley de Strokes (solo para partículas esféricas) y teniendo en cuenta que_
 Las partículas están en una suspensión muy diluida
 La sedimentación no es influenciada por otras partículas
 Re<1
Encontramos que la velocidad de sedimentación es:
Y la velocidad de centrifugación es:
 Donde = velocidad angular de la centrífuga
 R= radio del rotor de la centrífuga
 Dp= diámetro de partícula
 µ= viscosidad
 ρ= peso específico de la partícula
La viscosidad para la mayoría de los caldos bacterianos esta entre 1 y 2 cP dependiendo de la composición del medio. Cuando hay
ácidos nucleicos aumenta. La diferencia de peso específico en general es muy pequeña ya que las bacterias están constituidas por un
70-80% de agua. µ≤1. El diámetro de partícula es el principal factor que controla la eficiencia de la centrifugación. Al centrifugar
cosas de menor tamaño, hay que aumentar para mejorar la centrifugación.
El tiempo de sedimentación se puede calcular usando la siguiente ecuación:

6. Página 6
Si se conoce el radios inicialR0 y el radio final R1de la centrífuga.
Factor G
El factor G permite relacionar la velocidad de sedimentación con respecto a la gravedad:
Se usa para calcular el tiempo equivalente de centrifugación para producir una sedimentación aceptable.
Como determinar el flujo óptimo de alimentación de una centrífuga tubular
El tiempo que permanece la suspensión dentro de la centrífuga (tiempo de residencia) debe ser mayor o igual al tiempo de
sedimentación de la/s particula/s que deseamos sedimentar. Tiempo de Residencia > sedimentación
El cauldal depende del caldo de cultivo y de los parámetros de la centrífuga
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN: depende del caldo de cultivo
PARÁMETROS DE LA CENTRÍFUGA: depende de la centrífuga (Σ) que depende de la geometría de la centrífuga.
Σ= área equivalente de sedimentación
Todos los parámetros excepto g dependen de las características geométricas de la centrífuga
Hay que sedimentar una partícula hasta el 50% del volumen de una partícula determinada
Escalado
La velocidad de sedimentación es constante e independiente de la escala de trabajo. Y como no hay correspondencia entre las
centrífugas, la velocidad de sedimentación es:
Operación de centrífugas continuas
Hay que tener 3 factores en cuenta, la generación de calor, de aerosoles y de ruido.

7. Página 7
Filtración
Separa un sólido de un fluido por acción de un medio filtrante y una diferencia de presión
Métodos tradicionales
Filtración en lecho profundo
Los sólidos se depositan en el interior del filtro
Filtración convencional
Los sólidos se depositan en la superficie del filtro formando una torta. Se puede clasificar según:
La fuerza impulsora
 Gravedad
 Vacío
 Fuerza centrífuga
El mecanismo
 Formación de una torta
 De profundidad
El producto
 Retentato (torta)
 Filtrado (clarificado)
El modo de operación
 En batch
 En continuo
Tipos de equipos
Filtro prensa
 Simplicidad de operación
 Bajo costo
Opera bajo presión positiva donde los sólidos se acumulan en el filtro mientras el permeato fluye a través de las placas filtrantes y
sale a una cañería colectora de los canales de flujo. Los sólidos son posteriormente recuperados separando las placas y lavando
manual o semiautomáticamente cada placa. Las placas deben ser limpiadas en ciclos.
Filtro de cámara
Posee una mayor superficie de filtración y se los utiliza en el caso de que los filtro prensa tengan un bajo flujo de operación.
Filtro de tambor rotatorio
La fuerza impulsora es el vacío (presión negativa de filtración) que se produce en el interior de un tambor hueco. El tambor rota y
parte de éste está sumergido en un contenedor donde se encuentra la suspensión a filtrar. Es un equipo de filtración continua y más
complejo de operar.
Métodos modernos
La retención ocurre solo en la superficie.
Sistemas de filtración de membrana
Las membranas filtrantes son de 3 materiales distintos:
 Celulosa modificada (acetatos, nitratos, etc)

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 Polímeros sintéticos (polisulfona, polipropileno,
polietileno, etc)
 Minerales (óxidos de Al y/o Zr)
Microfiltración (MF)
 Rango de partículas 0,1 – 10 µm
 No retiene macromoléculas disueltas
 Se utiliza para esterilizar líquidos o gases
 Presión de operación: <2 bar
Ultrafiltración (UF)
 Discriminan macromoléculas disueltas en solución
que se clasifican de acuerdo al PM minimo de una
molécula globular que puede retener (MWCO)
 Rango de poros 5 – 300 kDa
 Son usados para concentrar, diafiltrary fraccionar
proteínas
 Reemplaza a la diálisis en el escalado
 Presión de operación: 1-10 bar
Nanofiltración
 Las membranas retienen iones divalentes y pequeñas
moléculas orgánicas
 Se usa para la purificación de agua para uso
farmacéutico y biotecnológico
 Presión de operación: 5-35 bar
Osmosis reversa
 Las membranas son capaces de retener iones y
pequeñas moléculas orgánicas.
 Se usan para purificar el agua para uso farmacéutico
y biotecnológico
 Se usan presiones más altas porque hay que vences
la fuerza osmótica
 Presión de operación: 15-150 bar
Electrodiálisis
 Se emplean membrana intercambiadoras de iones
pero impermeables al agua. La separación es forzada
por un campo eléctrico a diferencia de la filtración
que es conducida por la presión.
 Se usa para eliminar NH3 y lactato
MWCO
Se refiere al menor PM que es retenido por la membrana
¿Cómo se mejora el flujo de filtración? En UF
Aumentar la PTM o aumentar el área del filtro
Parámetros importantes en filtración con membranas

9. Página 9
La PRESIÓN OSMÓTICA depende del MW y de la concentración del componente.
TEST DEL PUNTO BURBUJA: se usa para caracterizar una membrana y monitorear la consistencia y calidad, se basa en la determinación
de la presión mínima en el cual el líquido es eliminado por presión formando una burbuja.
TAPONAMIENTO: deposición de sustancias sólidas sobre la superfice de la membrana lo que produce la disminución del filtrado y su
calidad.
THROUGHPUT: evalúa la capacidad de filtración durante la vida de un filtro.
El flujo es proporcional a la presión transmembránica e inversamente proporcional a las resistencias al pasaje del líquido
 RM = resistencia de la membrana
 RPB = resistencia de la bloqueo del poro (importante en MF)

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 RAds = resistencia por adsorción (importante en UF)
 RKP = resistencia de un gradiente de concentración (importante en MF)
 Rgel = resistencia de la formación de gel (importante en UF)
Nuevos sistemas reducir el taponamiento
 Sistema de fibras huecas helicoidales
 Membranasvibrantes
Nuevas técnicas para mejorar la separación
HPTFF (High Performance Tangencial FlowFiltration)Agrega la interacción electrostática al efecto estérico:
 Modificando el pH y la fuerza iónica de la solución se modifica el tamaño real de las proteínas.
 Membranas de UF con carga electrostática
Diferencias con la centrifugación
 Evita la formación de aerosoles por ser sistema cerrado
 La mayor limitación es el taponamiento que puede ocurrir por ciertas proteínas que se absorben en la membrana o desechos
celulares que forman una capa fina sobre la membrana o compuestos químicos usados como antiespumantes que bloquean
los poros
Tamaño de partícula a separar
 A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el costo de separación por centrifugación cae, mientras que
para la filtración no se ven afectados.
 La UF no tiene competencia con la centrifugación ya que esta última no permite separar componentes solubles.

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Ruptura celular
Objetivos de esta etapa:
 Maximizar la liberación del producto
 Evitar la desnaturalización y/o inactivación, la degradación térmica, alteraciones secundarias como oxidación,
proteólisis
 Maximizar la velocidad de liberación
Métodos Físicos
Mecánicos
 Agitación con abrasivos
 Homogenización a alta presión
 Extrusión por presión
No mecánicos
 Shock osmótico
 Congelamiento- descongelamiento
 Sonicado
 Secado
Métodos químicos
 Tratamiento con álcali
 Tratamiento con solventes
 Tratamiento con detergentes
 Tratamiento con ácidos
 Tratamiento con sustancias caotrópicas
Métodos biológicos
 Lisis enzimática
 Inhibición de la síntesis de pared celular
 Fagos
 Virus
Factores a tener en cuenta al seleccionar una técnica de disrupción celular
Microorganismo
Medio de cultivo en el que
creció
El medio complejo muestra
una mayor resistencia a la
disrupción
Tipo de microoganismo
Las Gram + son mas
resistentes a la disrupcion
que las gram -
Estado fisiológico
las células en fase
estacionaria tienden a ser
mas dificiles de desintegrar
Tamaño
las células mas grandes son
más fáciles de romper
Forma
los microorganismos
esféricos son más
resistentes a la ruptura

12. Página 12
Métodos Físicos
Molino de bolillas
Una suspensión celular es agitada a alta velocidad dentro de una cámara en presencia de una alta proporción de bolillas. La
eficiencia de ruptura se ve afectada por la concentración de células.se usan especialmente para microorganismos filamentosos.
BOLILLAS PARA LEVADURAS: >0,5 MM
BOLILLAS PARA BACTERIAS: < 0,5 MM
 Rm: ruptura máxima
 R: ruptura
Producto
sensibilidad al calor
El calor causa degradación térmica o
desnaturalización de proteínas
Sensibilidad al shear
Localización dentro de la célula
las proteínas periplasmáticas pueden ser
liberadas por un tratamiento moderado
mientras que las citoplasmáticas
requeiren un tratamiento mas vigoroso
Factores
velocidad a la que ha crecido
las altas velocidades específicas
de crecimiento permiten una
más facil ruptura de las células.

13. Página 13
Si Rm es 100% (quiero romper todo)
El tiempo de residencia es: a mayor k, menor tr para logar el mismo % de liberación. (línea verde abajo)
K representa la eficiencia de la ruptura y es función de:
 Velocidad de agitación
 Concentración de células (30-60% de sólidos)
 Concentración de bolillas de vidrio (70-90 % respecto al volumen de la cámara)
 Diámetro de las bolillas (>0,5 levaduras, <0,5 bacterias)
 temperatura
 diseño del molino de bolillas
Homogeneizador a alta presión
El efecto de la presión de operación sobre la liberación de proteína es exponencial y se ha demostrado que el exponente de presión a
para levaduras es 3 y para bacterias entre 1,5 y 3
 No recomendada para organismos filamentosos
 Mas usada a gran escala
 El calor es por descompresión adiabática
 Presión de trabajo: 300 – 600 atm
 Rm: cantidad máxima de proteína soluble que puede
ser liberada
 R: cantidad de proteínas liberada
 K: constante de velocidad temperatura dependiente
 N: numero de pasajes de la suspensión celular por el
homogeneizador
 P: presión de operación del homogenizador
 A: exponente de presión que depende del
microoganismo y del estado metabólico
Si Rm es 100% 
Número de pasajes:

14. Página 14
Microfluidizadores
Funcionan por el choque de un chorro de líquido (caldo) de alta velocidad de una suspensión (jet) sobre una placa.
 De choque: un chorro de 80 µm de diámetro contra una placa metálica enfriada
 Microfluidizador: dos corrientes de líquido de 2x100µm se encuentran en una cruz
 De choque contra corritente: dos chorros de líquido de 180µm se chocan entre sí de frente.
Ventajas
 Dejan residuos de mayor tamaño (facilitan la separación solido-líquido)
 Son eficientes a bajo contenido de biomasa
 Major enfriamiento
 Permiten trabajar a bajos flujos
 Se pueden usar volúmentes pequeños
 Son compactos
Ultrasonido
Mecanismo de ruptura: cavitación: generación de microburbujas que al colapsar generan una onda expansiva que se propaga por el
medio variando la presión. No se usa a escala industrial porque la energía se transforma en calor.
Métodos Químicos
Tratamiento con álcali
Ventajas
 Económico
 Fácil escalado
 No quedan microorganismo viables
 Inactivación de proteasas
 Reduce contaminación con piretógenos
Desventajas
 Posible desnaturalización
 Posible degradación
Tratamiento con solventes
Ventajas
 Económico
 Fácil escalado
 No quedan microorganismo viables
 Estabiliza proteínas
 Inhibe el crecimiento de microorganismos
contaminantes
Desventajas
 Desnturalizacion
 Solventes inflamables
 Liberación de proteasas
Mecanismo
 Extracción del componente liídico de las membranas
 autólisis
Autólisis y extracción química
Ventajas
 Económico
 Fácil escalado
Desventajas (autolisis)
 Tiempos largos de reacción
 Bajos rendimientos
Las condiciones óptimas deben ser determinadas
empíricamente
 Temperatura
 pH
 tiempo de incubación
 molaridad del buffer
 estado metabólico de las células

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Permeabilización con detergentes
Desorganizan la membrana plasmática solubilizando las proteínas haciendo la membrana permeable al pasaje de ciertas proteínas
mediante el uso de agentes caotrópicos.
Ventajas
 Evita la extensiva fragmentación de la pared celular
 hay pocos residuos de pared celular
 Evita la liberación de DNA
 Fácil escalado
Desventajas
 No es económico
 Es un contaminante en la posterior purificación
 Inactivan proteínas con estructura cuaternaria
 La regulación de la temperatura y el pH son críticas
Mecanismo
 Solubilización de membranas
 Permeabilización celular
Métodos biológicos
Métodos enzimáticos
Los sustratos para la disrupción enzimática son las paredes celulares:
Gram +
 Peptidoglicano
 Membrana citoplasmática
Gram –
 Pared externa
 Peptidoglicano
 Membrana citoplasmática
Levaduras
 Mananos parcialmente entrecruzadas por puentes
fosfodiester
 Glucanos y proteínas
 Membrana citoplasmática
Hongos filamentosos
 Α y β glucanos
 Capa de glicoproteínas
 Microfibras de quitina
Tipos de enzimas bacteriolíticas
 GLICOSIDASAS: cortan cadenas de polisacáridos
 ACETILMURANIL-L-ALANINAAMIDASAS:clivan la unión
entre proteínas y polisacáridos
 ENDOPEPTIDASES:clivan cadenas polipeptidicas
Lisis de levaduras
 Β(1-3) GLUCANASA: degrada la capa interna de glucano
 PROTEASA: especifica para la pared celular, degrada la capa externa de proteína-manano
 Β(1-6) glucanasa
 Mananasa
 Kitinasa
Ellas actúan sinérgicamente en la lisis de la pared celular pero solo 2 son esenciales para la ruptura de la célula
Método para la liberación de proteínas por lisis selectiva
 PASO 1: Eliminación de la pared celular, enzimas líticas en medio osmótico (1,2M sorbitol) y un estabilizador de membrana
(15mM sulfato de zinc)
 PASO 2: ruptura del protplasto con DEAD-Dextram y glucosa
 PASO 3: ruptura de organelas con Triston X-100 a 0°C

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Precipitación
La precipitación es una operación que convierte a un producto solubilizado en un producto solido por acción de algún precipitante.
Los agentes precipitantes no deberían producir desnaturalización del producto y deben proveer una mayor estabilidad del
precipitado.
 Operación fácilmente escalable
 Requiere poco equipamiento
 Los precipitantes son económicos
Desnaturalización selectiva
Se desean producir cambios en la conformación de las proteínas contaminantes (desnaturalizacion) y mantener la proteína de interés
soluble.
Precipitación por afinidad
Se forman complejos proteína-ligando donde uno o ambos componentes deben tener mas de un sitio de interaccion para poder
formar una red macromolecular que se insolubilice. (inmunoprecipitacion)
Saltingout
Adicion de sales a la solución que contiene la proteína de interés, estas afectan el balance entre las fuerzas electroestáticas (que
mantienen la proteína en solución) y las fuerzas hidrofóbicas (que precipitan la proteína en un medio acuoso). La cada de hidratación
recubre la superficie de la proteína y previene las interacciones proteína-porteína, las altas concentraciones de iones salinos eliminan
esta agua porque la usan para hidratarse y permiten las interacciones proteína-proteína llevando a la precipitación.
 S= solubilidad de la proteína
 S0= solubilidad extrapolada de la proteína a concetracion cero de sal. Depende de la temperatura y el pH.
 K= disminución de la solubilidad de la proteína por unidad de sal agregada. Depende de la proteína y la sal usada
 C= concentración de sal.
Curva típica del saltingout:

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Las sales con mayor carácter precipitante son las que mas estructuran el agua (poco carácter caótropo) y las de menor poder
precipitante son las que interfieren con la estructura del agua (interfieren en los puente de H como el SCN) la concentración salina
también puede expresarse como fuerza ionica.
El sulfato de amonio
Es usado a baja escala por su alta solubilidad a bajas temperaturas. Aunque es barato, su uso a gran escala esta restringido por
problemas de eliminación de residuos. La mayor parte de la sal queda en el sobrenadante pero una cantidad residual siempre
contamina el precipitado, pudiendo ser eliminada resolviendo el precipitado y realizando una UF o cromatografía de exclusión
molecular.
Ventajas:
 Alta solubilidad 4M entre 0 y 30°C
 Barato
 Conserva la integridad de proteínas termolábiles
 Previene proteólisis y contaminaciones bacterianas
 Densidad de solución saturada: 1,235 g/l
Desventajas
 Contamina el precipitado
 Corroe el metal y el cemento
 Problemas de eliminación
 No se puede usar por encima de pH 8
El sulfato de sodio
Debe ser usado a 35 – 40 °C para asegurar la solubilidad adecuada. La sal puede recuperarse del sobrenadante de la precipitación
disminuyendo la temperatura
Ventajas
 Recuperable
Desventajas
 Caro
 Equipamiento termostatizado
 Problemas de degradación enzimática
Precipitación con solventes orgánicos
El solvente orgánico debe ser totalmente miscible con agua y de carácter hidrofilico para evitar desnaturalización de la proteína de
interés. La adicion de un solvente orgánico reduce la constante dieléctrica de la solución lo que aumenta las interacciones proteína-
proteína con lo que se llega a la agregación y ulterior precipitación
 S: solubilidad de la proteína en la mezcla solvente orgánico- agua
 D: constante dieléctrica de la mezcla
 K: constante que depende del solvente usando, de la proteína, del pH y la temperatura
 S0: solubilidad de la proteína en la solución acuosa original
Un problema es la tendencia general de los solventes orgánicos a desnaturalizar irreversiblemente las proteínas. Cuando se reduce la
constante dieléctrica del solvente, la proteína puede responder plegándose a una forma inactiva en la que lso residuos hidrofóbicos
estén expuestos en el exterior. Por eso se debe realizar a bajar temperaturas (<10°C) para tener una buena recuperación.
Solventes orgánicos:
 Metanol
 Etanol posee el mejor efectro entre la solubilidad de las proteínas y el carácter hidrofilico adecuado que minimiza la
desnaturalización. Dificultades: sustancia controlada
 Isopropanol es mashidrofóbico y puede llegar a desnaturalizar las proteínas en mayor grado.
 Acetona

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DESVENTAJAS: hay que diseñar todo el proceso a prueba de incendios debido a la inflamabilidad de los solventes usados. Requiere un
control estricto ya que hay que mantenerlo a bajas temperaturas y hay que contrarrestar el calor generado cuando se mezclan
solventes orgánicos con agua.
VENTAJAS: su efecto bactericida y su fácil rescuperacion (destilación)
Precipitación isoeléctrica
Las proteínas exhiben menor solubilidad en su punto isoeléctrico pI es el valor de pH en que la molécula tiene carga neta cero. En este
punto, el grado de hidratación de la molécula es mínimo. Esto aumenta las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y causa la
precipitación. Además disminuyen los fenómenos de repulsión. La primera dificultad es su rango limitado de pH en que las proteínas
son estables. Se requiere un control estricto y un buen mezclado para no sobrepasar el pH crítico y no causar con esto serias pérdidas
del producto.
Precipitación con polímeros no ionicos (PEG)
Las operaciones se efectúan a temperatura ambiente ya que el PEG no interactúa significativamente con la proteína como lo hacían
los solventes orgánicos y tiene bajo calor de disolución. PEG es un polímero tóxico con viscosidad moderada. A gran escala aparecen
dificultades para reciclar el polímero que es caro. PEG es difícil de eliminar de la fracción protéica: si junto con las proteínas
precipitadas se arrastra una cantidad significativa de PEG pueden producirse serios problemas en etapas posteriores de purificación
del producto. El pH mas cercano al pI requerirá menor concentración de PEG.
Precipitación por polielectrolitos
Con carga negativa
 Acidopolacrílico
 Polisacáridos acídicos
 polifosfatos
Con carga positiva
 Polietilenimina
 Quitosano
El mecanismo de precipitación está relacionado a la cancelación de cargas ya que en general un determinado polielectrolitopreciíta
proteínas de cargas contrarias. Se requieren bajas concentraciones de polielectrolitos para producir la precipitación de proteínas,
normalmente 0,05 a 0,1 %. Los precipitados se forman bien y sedimentan rápido. Las operaciones a gran escala son económicas ya
que la recupración del polielectrolito puede llegar a 90%. La mayor desventaja es el costo inicial del polielectrolito y al igual que el
PEG se deberá evaluar posibles dificultades posteriores por contaminación de la muestra.
Crioprecipitacion
Las proteínas precipitan solo por el hecho de disminuir la temperatura. Ej. Factor VIII de coagulación del plasma humano.
Precipitación por desnaturalización selectiva
Aumento de la temperatura
La combinación con otros agentes precipitantes hace que estos tratamientos se realicen a menor temperatura mejorando la calidad
de las proteínas precipitadas. Con el agregado de citrato se puede disminuir de manera importante la tempratura para logra un 70%
de precipitación y además lograr una precipitación diferencial con BSA. El aumento del poder precipitante en este caso esta asociado
al poder quelante del calcio del citrato que extrae dicho metal desestabilizando la proteína.
Cinética de precipitación

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El tamaño de las partículas es uno de los determinantes de la eficiencia de las separaciones solido-liquido.
Nucleación
Para concentraciones de proteína por encima de 2mg/ml toda la proteína desaparece de la fase soluble en un segudo formándose
partículas submicrónicas que se mueven muy rápido y colisionan entre sí.
Crecimiento limitado por difusión
Estas partículas se van uniendo formando otras mas grandes. La eficiencia de la colisón para formar agregados disminuye con el
tamaño de las partículas. El crecimiento puede verse entonces como la adición de pequeñas unidades a los agregados en crecimiento.
La falla en las colisiones entre los agregados mas grandes para formar aglomerados finales, reduce el proceso de crecimiento donde
sólo las partículas primarias y lo pequeños agregados pueden servir como unidades de crecimiento, actuando éstos últimos como
colectores.
Crecimiento influenciado por el flujo
El mezclado favorece el crecimiento del agregado formándose particuals del rango 1 – 100 µm
Floculación
Los agregados se juntan formando los grandes flóculos.
Escalado
El escalado puede realizarse en:
 Batch intermitente
 Tubular continuo
 Tanque agitado continuo CTRS
Puede suponerse que las proteínas precipitan rápidamente, entonces la velocidad de agitación afectará el tamaño inicial de las
partículas y las características del crecimiento posterior.
Problemas:
Problemas de escalado en Batch
 Tiempos largos de mezclado
 Coprecipitación (precipitan proteínas con contaminantes)
 Desnaturalización térmica del producto.

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Partición en dos fases acuosas
Sistemas de dos fases acuosas
Tipo polímero-polímero
 PEG-Dextran
 PEG- hidroxipropil almidón (El dextran es caro y a nivel industrial se usa este polímero)
Tipo polímero-sal
 PEG-fosfato
 PEG-sulfato
 PEG-citrato
Composición global del sistema
Todos sistemas de dos fases acuosas cuya composición de cada fase sean iguales pertenecen a la misma tie-line. Entonces para dos
sistemas de “FA de diferente composición global pertenecientes a la misma tie-line es necesario que la relación de volúmenes
de los dos sistemas sea la misma. El punto crítico (teórico) es donde la composición de las fases es igual y el volumen también. Para
dos sistemas en 2FA pertenecientes a la misma tie-line, el volumen de las fases respecto del volumen total del sistema esta dado por
la longitud relativa de la tie-line. Entonces se puede calcular el volumen relativo de cada fase de un sistema X con la siguiente
ecuación:
Y la composición de cada una de las fases será la misma para todos los sistemas pertenecientes a la tie-line definida por A B.

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Comportamiento de una proteína en un sistema de 2FA
Cuando se introducen proteínas en este sistema, éstas se repartirán en forma diferente en ambas fases según sus características
moleculares. Entonces el coeficiente de partición para una proteína P:
Las características moleculares que hacen que las proteínas se repartan distinto en las dos fases son:
 Peso molecular
 Cargas electroestáticas superficiales
 Hidrofobicidad superficial
De esta manera puede extraerse selectivamente algunas proteínas buscando condiciones que hagan que se dirijan hacia la fase
superior K>1 mientras que las otras proteínas y restos celulares van a la fase inferior K<1. Que los contaminantes queden en la fase
inferior es una ventaja para la economía del proceso.
La ruptura de los microorganismos genera problemas:
 Los restos celulares poseen un tamaño pequeño del orden de los 0,5µm
 Junto con las proteínas se liberan ácidos nucleicos que aumentan la viscosidad del medio.
Para la purificación de una proteína de interés por métodos convencionales, es necesaria una clarificación previa por lo que hay que
recurrir a la centrifugación o ultrafiltración. En la centrifugación como los restos celulares son del orden de 0,5 µm habría que aplicar
mucha energía y tiempo y en cuanto a la UF, como con la lisis se aumenta la viscosidad del medio, este método se hace menos
efectivo. En el sistema de 2FA no se necesita clarificación previa.
¿Cómo cambiar la KP?
 Tipos de polímeros
 Concentración de polímeros
 Peso molecular de los polímeros (+PM  la proteína sale de esta fase)
 pH es efectivo slo en sistemas polímero/polímero
 Temperatura. Es efectivo solamente con algunos polímeros termosensibles especiales donde la separación ocurre a
determinada temperatura.
 Tipo de sales en cuya presencia se realiza la extracción (modifican K)
 Fuerza ionica
 Unión de ligandos de afinidad a los polímeros
¿Cómo comparar dos sistemas de2FA para la purificación de una proteína?
Una manera es determinando la K de la proteínas de interés y compararla con la K de las contaminantes. En un sistema ideal KP<KC.
Las comparaciones deben hacerse para sistemas con tie-lines equivalentes. La manera más fácil de tener estas es trabajar con
sistemas de 2FA con composición global muy cercanas a la curva binodial.
Ventajas
 Económico, solo si los polímeros se pueden reciclar
 Condiciones de extracción muy suaves, por lo que puede usarse para proteínas poco estables como las enzimas
 El scale-up es simple
 Rendimientos altos

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 Capacidad concentradora, solo cuando K es muy grande o muy chico de manera que la reducción del volumen de fase en
donde se encuentra es posible sin afectar la recuperación
 La mayoría de los polímeros usados poseen propiedades estabilizantes de las proteínas
Calcular el porcentaje de proteína extraído:
Si la proteína de interés tiene propiedades que se acercan al promedio de las proteínas contaminantes, su constante de partición no
será muy distinta al del resto de las proteínas de la mezcla y no se logrará una purificación muy importante. En estos cados quedan
dos cosas por hacer: usar la partición en 2FA como primer paso de un proceso de purificación (como extracción) y luego aplicar otros
métodos de alta resolución o usar la partición en 2FA por afinidad para tratar de mejorar la K usando polímeros con ligandos de
afinidad.
Eliminación de los polímeros
El agregado de sal al PEG genera otro sistema de dos fases que extraiga la enzima. Las sales luego se sacan por diálisis o UF. Si el PEG
es de bajo PM y la proteína de alto PM se puede diafiltrar (previamente diluir la muestra para disminuir la viscosidad). También se
puede precipitar la muestra con solventes o sales pero los precipitados siempre van a tener polímero contaminante. Otra alternativa
es hacer una extracción con intercambiadores iónicos previo ajuste del pH y fuerza iónica.
Precipitación vs sistema 2FA
El PEG además de ser usado para formar sistemas de 2FA también se usa para precipitar proteínas. Entonces ¿CÓMO SABER QUE
FENÓMENO ESTÁ OCURRIENDO?
Para diferenciarlos aplicamos concentraciones distintas de extracto a una solución de PEG. Si la concentración de la proteína se
interés se encuentra en el sobrenadante, se mantiene la constante entonces hay equilibrio entre la precipitación y la solubilidad. Si la
actividad enzimática responde linealmente con la concentración del extracto entonces se está formando un sistema de 2FA

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¿Cómo mido ruptura?
 DO(turbidez)
 Recuento en microscopio
 Actividad  Bradford
 Abs 280
Métodos cuantitativos para determinar proteínas
 Folinphenol
 Bradford
 Lowry
Métodos para estimar proteínas
 Absorbancia a 280 pero puede detectar otras cosas q abs a esta longitud de onda.