ADN: Estructura y Fuerzas Estabilizantes. 1

1. ADN: Estructura y Fuerzas Estabilizantes Curso EGBM 2008 Dr. Daniel Corach Elementos de genética y Biología Molecular 4 de Agosto de 2008

3. En la especie Humana el ADN se encuentra en los 23 pares de cromosomas nucleares (22 autosómicos y uno sexual XX o XY) asi como en las mitocondrias

6. Repaso ADN ADN a cido d eoxiribo n ucléico 4 bases A = T = C = G = Nucleosido base + azucar(deoxiribosa) Pirimidina (C 4 N 2 H 4 ) Purina (C 5 N 4 H 4 ) Nucleotido base +azucar + fosfato Pirimidina (C 4 N 2 H 4 ) Timina Citosina Numeración de los Carbonos? A denina T hymine Ci tosina G uanina

9. ADN es el Principio Transformante A. Griffith, 1928:

10. Experimento de Griffith demostrando la transformación bacteriana

11. Avery, McLeod y McCarty identificaron ADN como la susbstancia qu’imica responsable de cambiar la celulas de colonias rugosas (R) no virulentas a celulas de colonias lisas (S) *S)virulentas de S pne i umoniae

12. B. Avery, McCarty and Macleod, 1944: Extracto de bacterias vivas lisas virulentas Agregado a bacterias rugosas Existe transformacion? carbohidrato proteina ADN No No Si ADN es el Principio Transformante

15. 1952 Experimento de Hershey y Chase

16. Patrón de Difracción de Rayos-X de una Fibra de ADN-B

17. Linus Pauling y su Moedlo de ADN

19. No escapó a nuestra atención (It has not escaped our notice …) It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated suggests a possible copying mechanism for the genetic material.

21. Fig. 6.22

24. What next? Puentes de Hidrógeno N - H------N N-H------O Adenina Guanina Timina Citosina Unión de Nucleótidos: El 3’-OH libre de un nucleótido se une al fosfato 5’- del siguiente nucleótido

25. Apareamiento de Bases G C T A T A G C T A Apareamiento de Bases (Watson-Crick): A/T (2 puentes de Hidrógeno) G/C (3 Puentes de Hidrógeno) Siempre se aparean una Purina con una Pirimidina determinando un ancho constante Composición en Bases del ADN: A + G = T + C (Regla de Chargaff’)

26. Representaciónes del ADN 5´AGCCTCGCAT3´ 3´TCGGAGCGTA5´

27. 5’ 3’ Convenciones Sobre el ADN -ATCGCAATCAGCTAGGTT- sentido(forward) antisentido (reverse) -TAGCGTTAGTCGATCCAA- 3’ 5’ 5’ -ATCGCAATCAGCTAGGTT- 3’ 3’ -TAGCGTTAGTCGATCCAA- 5’

28. Escalas de Longitud en Biología Unión química 1 Å (10 -10 m) Amino ácido 10 Å (10 -9 m) Proteina Globular 100 Å (10 -8 m) Virus 1000 Å (10 -7 m) Núcleo celular 1  m (10 -6 m) Célula bacteriana 5  m (10 -5 m) DNA cromosómico 10 cm (10 -1 m)

29. Estructura doble hélice de ADN Hélice dextrógira Cadenas antiparalelas Hay aprox. 10 bases por vuelta Un giro de hálice es de 34 Å . Los azúcar-fosfato quedan hacia afuera y las bases hacia adentro. Major groove

30. Enrollamiento Plectonémico , no asociación paranémica. En el enrollamiento plectonémico , las dos cadenas se retuercen una alrededor de la otra. En la asociación paranémica las dos cadenas se alinean lado a lado. 5’ 3’ 3’ 5’

31. Vista Lateral de una Cadena de ADN

32. Vista lateral de una Molécula de ADN

33. Pares de Bases Esqueleto Fosfato Azúcar Vista Axial de una Molécula de ADN

35. Algunas de las Estructuras del ADN

36. Tipos de ADN Doble Cadena Tipo A: Conformación prepondernate para el ARN, minoritaria para ADN. Tipo B: Conformación preponderante del ADN Tipo Z: Conformación minoritaria para el ADN

37. Los Pares de Bases están rotados en el ADN-Z

39. Comparación de las Propiedades Estructurales del ADN A, B y Z

43. RNA has a Rich and Varied Structure Fig. 8-26 Watson-Crick base pairs (helical seg-ments; usually A-form). Helix is secondary structure. Note A-U pairs in RNA DNA can also form structures like this.

44. Secuencias Repetidas Invertidas

45. Formación de Tallo-Rulo (Stem-loops)

48. Distinguiendo entre duplex y monocadenas ADN duplex ADN monocadena o ADN Duplex con una cola monocadenaa nucleasa S1 o mung bean nucleasa Digiere cadena simple + + + + Pasar a traves de columna de hidroxiapatita (HAP) a temperatura ambiente + + Se une a HAP, se eluye aumentando la T para desnaturalizar No se une a la HAP Mezcla de:

50. Sedimentación Al Equilibrio mide Densidad de Flotación Se emplean gradientes de sales de Cesio, las moléculas migrarán hasta la posición en la que su densidad se iguale a la del gradiente [CsCl] . La densidad es independiente del tamaño Fuerza centrífuga Fuerza de flotación [CsCl] ARN ADN Rico en G+C Rico en A+T más denso menos denso

51. El Contenido en G-C tambien Determina la Densidad de Flotación del ADN Separación de ADN nuclear y Mitocondrial en un gradiente De ClCs-Bromuro de Ethidio Visualizado con luz UV

57. Rspectroscopía del AND El ADN absorbe radiación UV con un máximo en 260 nm Densidad Optica Longitud de Ondah 260 El análisis de absorción permite detectar diferencias en el estado estructural tanto del AND como del ARN el coeficiente de extinción molar depende de la estructura ADNdc Bajo coeficiente de extinción ADNmc Mayor coeficiente de extinción

58. Corrimiento Hipercrómico al Desnaturalizar el ADN. ADN Duplex Nativo Desnaturalizado, las cadenas se separan + Desnaturalización por calor o incremento de pH Reasociación por enfriamiento o disminución del pH Hipercrómico Hipocrómico 1.0 1.2 1.4 = Temperatura de fusión, punto medio de la transición Temperatura Menor A 260 Mayorr A 260 T m A 260

61. Desnaturalización de ADN T m Tm depende de: -Contenido de GC -Fuerza iónica

62. Composición de Bases (contenido en G-C) determina la temperatura de fusión : varia entre los organismos Tm C°

64. Fuerzas Estabilizantes. Correlación entre CG% y Tm SSC 1 X %GC=(Tm-69,3) x 2,44 SSC0,1 X %GC=(Tm-53,9) x 2,44

65. Efecto de la Alteración Irreversible de los Puentes de Hidrógeno Tiempo en horas 24 D.O Formaldehído

66. Efecto de ClNa 0,1M 1M 4M Temperatura D.O.

67. Efecto del TFACNa Temperatura 4M 0,1M 1M D.O.

70. Fin