Clases biotecnología 2016 chia wong

01 Introduccion a la Biotecnologia p2.pptx
02 Cultivo de Tej Veg - fundamento.pptx
03 Reguladores de Crecimiento.pptx
03 respuestas no deseadas.pptx
04 Aclimatacion new.pptx
04 Micropropagacion b.pptx
05 Cultivo de Meristemas.pptx
06 Aclimatación nuevo.ppt
06 Cultivo de anteras (2).pptx
06 germoplasma - crioconservacion (2).pptx
07 Protoplastos.pptx
08 suspension & metab 2nd.pptx
09 Marcadores moleculares 1.2a.pptx
09 Marcadores moleculares.pptx
10 Tecnologia del ADN recombinante 1.2.pptx
10 transgenicos.pptx
11 Biopharming.ppt
01 Introduccion a la Biotecnologia p1.pptx

Seguridad alimentaria
Tiene tres aspectos
fundamentales:
1. La disponibilidad
de alimentos.
2. El acceso de las
personas a ellos.
3. El aprovechamiento
biológico de los
mismos.

Productividad de los cultivos
Suelo Clima
Variedad
Manejo
poscosecha
FACTORES
1. Genotipo.
2. Control de plagas y
enfermedades.
3. Técnicas de manejo
agronómico
4. Mejoramiento del
suelo.
5. Manejo de las
condiciones
climáticas.

Características deseadas por los fitomejoradores
• Resistencia a enfermedades y plagas.
• Disminuir el costo de producción.
• Incrementar el rendimiento/ha
• Aumentar la calidad organoléptica.
• Mejora del contenido nutricional.
• Tolerancia a stress abióticos (cambio climático, heladas,
etc.)
• Precocidad.
• Incrementar la productividad (rendimiento/ingreso)
• Asegurar la inocuidad del alimento.

Diferentes rutas del fitomejoramiento moderno

Recursos Genéticos y Genómicos para la pre-
mejora y mejora de los cultivos

Estrategias para obtener variedades mejoradas
usando la biotecnologia
Mejoramiento
Diversidad del
patógeno
Diversidad del
germoplasma
Desarrollo de
marcadores
moleculares Nueva
variedad
Genes
importantes
Enfermedades
Producción
Calidad
Selección Asistida o transformación
genética
Biólogos moleculares
Fitomejoradores
Fitopatólogos
Tomado de: Uilson Lopes Coord. Biomol SEGEN/CEPEC/CEPLAC

• Cultivo de Tejidos Vegetales.
• Marcadores Moleculares.
• Ingeniería Genética.
Técnicas de la Biotecnología que contribuyen a
la mejora vegetal

Tomate silvestre
Tomate cultivado
Domesticación del tomate

Consecuencias de la domesticación
• Las plantas domesticadas se caracterizan por:
- Rasgos que confieren adaptación al ambiente
humano.
- Pérdida de capacidad reproductiva, de
dispersión de la semilla e inactividad de la
semilla.
- Pérdida de capacidad adaptativa.

Tomado de: ISNAR, 2001; REDBIO/FAO, 2002.
Técnicas más utilizadas en I+D+I
(Investigacion, Desarrollo e Innovacion:
Recursos genéticos 21 %
Mejora de productividad 23 %
Protección de plantas 25 %
Otros 19 %
Grandes temas en I+D+i:
Distribución de
actividades de la
I+D en
Biotecnologia en
América Latina y
el Caribe
Cultivo de tejidos 29%
Marcadores moleculares 27%
Diagnóstico 20%
Ingeniería genética 14%

Cadenas de
comercialización
de productos
agrícolas:
¿Cómo participa
la biotecnología
vegetal??

BIOFERTILIZANTES
Microorganismos que incrementan el
suministro y disponibilidad de nutrientes.
Ejemplo:
Efficient Microorganisms®
BIOPESTICIDAS Bacillus thuringiensis
Es compatible la Agricultura Orgánica con la
Biotecnología?

Microalgas:
producción masiva
APLICACIONES:
1. Alimento humano y
animal.
2. Polisacáridos:
alginatos.
3. Propiedades
medicinales.
4. Biomasa para
biocombustibles.
5. Biofertilizantes.

Género
Nicotiana
Catharanthus
Cinchona
Duboisia
Datura
Beta
Lippia
Artemisia
Coreopsis, Bidens
Tagetes
Digitalis
Cassia
Panax
Chaenactis
Podophyllum
Linum
Lithospermum
Solanum
Metabolito
Alcaloide
Alcaloides piridínicos
Indoles
Tropano
Otros
Betalaina
Sesquiterpenos
Poliacetilenos
Tiofenos
Glicósidos cardioactivos
Antraquinonas
Saponinas
Polyines
Lignanos
Naftoquinonas
Esteroides
Algunos
metabolitos
secundarios
producidos
por raíces
transformadas
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Tipos de plantas más utilizadas
Freatófitas
- Plantas de raíces profundas
(álamo, sauce, algodonero).
Pasturas
- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
Legumbres
- Permiten enriquecer el suelo en N2.
Acuáticas
- Permiten la degradación de contaminantes
en ciénagas artificiales.
Fitorremediación

Marcadores Moleculares
• ¿Que es un Marcador?
• Un marcador es considerado como un carácter
cuyo patrón de herencia puede determinarse
en un nivel morfológico (fenotípico),
bioquímico y/o molecular.
Tumbes LimaTrujillo Chimbote¿?

¿Son el mismo
genotipo? ¿tiene
parentesco alguno?
¿Si son diferentes
Cuanta diferencia hay
entre ellos?
Método:
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de fragmentos de ADN
3. Corrida electroforética
4. Teñido y visualización de bandas
5. Análisis de la información
Individuo A Individuo B

ICS-6ICS-1
Fuente: Ing. Luis Garcia Carrion UNAS

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0.44 0.52 0.60 0.68 0.76 0.84 0.92 1.00
C42
HTM1
C65
PA150
U1
U9
U12
U15
CAT4
U26
U54
SCA6
CCN51
C53
U68
U43
U48
SilvHu
SeñoA
H12
Pand
U60
C69
C81
H61
C85
P7
ChuC
U70
UF29
H60
H37
Seño
1
EET400
EET228
EET233
M18.16
EET62
ICS6
ICS78
ICS95
ICS1
ICS39
M1.7
I16.20
UF667
I12.12
IMC67
I14.20
ChuS
0.79
13
Análisis de
agrupamiento o
“cluster” para medir el
grado de diversidad
genetica entre los cacao
en estudio.

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
-0.37
-0.23
-0.08
0.06
0.20
0.34
EET400
EET228
EET233
EET62
ICS6 ICS78
ICS1
ICS95
ICS39
M18.16
M1.7
UF667
U1
CAT4
U9
U12
U15
U26
U43
U48
U54
U60
U68
U70
SCA6
C42
C53
C65
HTM1
CCN51
IMC67
I12.12
I14.20
I16.20
C69
C81
C85
SilvHu
H12
H61
Pand
PA150
P7
ChuC
ChuS
SeñoA
Dimensión 1
Dimensión2
PCoA
50 OTUs
Análisis de ordenamiento (coordenadas principales) para distinguir grupos
entre los cacao en estudio.

Micro-arrays can
carry 20,000
genes on a 2 cm2
plate. When
arrays are probed
with RNAs from,
say, stressed and
unstressed plants
computer
enhanced imaging
identifies genes
that are under-
expressed (in red)
and over-
expressed (in
green).
Estudio de la expresion genética con
microarreglos o “microchips de ADN”

Ingeniería Genética de Plantas
¿ Cómo combinamos ADN de diferentes organismos?
• Cortando y uniendo trozos de ADN de diferentes organismos
para producir una molécula de ADN híbrida.
• Las plantas transgénicas se han construido sobre la base de
introducir al sistema genético de la planta receptora
información genética adicional proveniente de otro organismo
donante.

Ingenieria Genética de Plantas

Potenciando al tomate
(Lycopersicon esculentum)
 Licopeno, carotenoide, antioxidante
(relacionado a vitamina A)
 Maduración retardada (etileno)
 Variedades tolerantes al alto contenido de
sales en suelo y agua de riego (acumulación
de sales en follaje)

 Deficiencia de vitamina A: efecto sobre la
capacidad visual, susceptibilidad a diarreas y fallas
cardiovasculares
 Consumo masivo en Asia
 Carece de precursores de vitamina A
 Inserción de genes asociados a la síntesis de ß-
caroteno, precursor de la vitamina A
El “arroz dorado” y la deficiencia
de vitamina A

http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/components/7055fig7.html
http://www.filmnebraska.org/gallery/crop.htm
http://www.hockinghills.com/gallery/pg_82.htm
http://www.ba.ars.usda.gov/history/photos/1970_2.html
Soya, maíz y trigo
 La soya se usa en el 40-60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, cerveza. Tolerancia a
herbicidas (Roundup Ready, liberado en 1996, glifosato).
 El maíz es un producto de consumo muy difundido. Genes bt.
 En el trigo se estudia la introducción de genes implicados en la síntesis de la glutenina del trigo,
relacionados en la elasticidad del gluten, útil para la panificación.
http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC7055.html

Vacunas comestibles de origen
vegetal
• Protección contra la hepatitis B (antígeno de
superficie HBsAg), el cólera, la diarrea (E. coli,
toxina LT-B, CT-B), HIV (gp120), herpes
• Plantas: papa, plátano, tomate, tabaco, otras frutas
• Evaluaciones en laboratorio en estado avanzado.
En papa, hasta 0.3% de ab solubles de LT-B en
papas hervidas (Tacket et al, 1998)
• Actualmente, fase de prueba en voluntarios
• Cornell Univ., Univ. of Loma Linda (California), Maryland, Pennsylvania,
Mississippi
http://home.cwru.edu/~eay3/ESR/vaccine2big.htm
http://www.sciam.com/2000/0900issue/0900langridge.html

Retos de la Biotecnología en el Mejoramiento
Genético de Plantas
• Solucionar problemas de contaminación ambiental.
• De erosión de suelos.
• Brecha Político Social Económica.
• Salinidad de los suelos.
• Disminuir la erosión genética.
• Altos costos de producción.
• Pérdida de competitividad.
• Enfrentarse al incremento de plagas y enfermedades.

Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos
vegetales

Cultivo in vitro de plantas consiste en lograr que un “explante” en
un medio nutritivo estéril regenere en una o más plantas
completas. También permite la producción de metabolitos
secundarios.
Introducción

Etapas
Laboratorio
Invernadero
Establecimiento in vitro
Plántulas enraizadas
Aclimatación
Campo
morfogénesis in vitro
Plántulas no enraizadas
Enraizamiento ex vitro
Regeneración
explantes

Cada una de las células de un
individuo vegetal, proporcionando
los estímulos adecuados, posee la
capacidad necesaria como para
permitir el crecimiento y desarrollo
de un nuevo individuo, sin que
medie ningún tipo de fusión de
células sexuales o gametos.
Haberlandt (1902)
Totipotencia

1. Organogénesis.
2. Embriogénesis.
Tipos de Morfogénesis in vitro

Morfogénesis directa e indirecta (Hicks, 1980)
Una dediferenciación celular
acompañada de crecimiento
celular desorganizado y la
formación de meristemoides
puede generar indirectamente
órganos o embriones.
Respuesta morfogenética
por la cual o se forman
directamente órganos o
embriones.

De Klerk et al. 1997:
a. Adquisición de la competencia.
Las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren
esa competencia durante una fase de desdiferenciación.
b. Inducción.
Las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación
directa entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del
crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar.
c. Realización.
La célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano
determinado.
Fases de la Morfogénesis

http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html

Son cuatro los principales:
a. Explante.
b. Genotipo.
c. Condiciones químicas.
d. Condiciones físicas.
Factores que afectan los procesos morfogénicos

Explante
a. Estado fisiológico de la planta madre.
b. Sector del cual se toma el explante.
c. Estado sanitario.
d. Tamaño.
e. Esporofito o gametofito.
f. Época del año.

Radice, Silvia. Morfogénesis in vitro. En: ECHENIQUE, V.; RUBINSTEIN, C. Y MROGINSKI, L.A. (eds.) 2004.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Ediciones Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Consejo
Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología. Buenos Aires, Argentina.

a. Factor determinante.
b. No es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo.
c. Variación intravarietal de respuestas regenerativas.
Genotipo

a. Composición salina del medio de cultivo.
b. Composición orgánica + fuente de carbono.
c. Reguladores de crecimiento.
d. Antibióticos.
e. Fenolización.
f. Agar, Gelrite® , Phytagel®
g. Atmósfera gaseosa.
h. pH: 5,4 – 5,8
Condiciones Químicas

a. Temperatura.
b. Humedad relativa.
c. Luz (Fotoperiodo).
Condiciones Físicas

• Micropropagación vegetal (embriogénesis y
organogénesis).
• Cultivo de meristemas.
• Cultivo de suspensiones de células .
• Cultivo de protoplastos.
• Cultivo de anteras, óvulos y embriones.
• Microinjertos.
• Microtuberización.
• Producción de metabolitos secundarios.
• Etc.
Técnicas
del cultivo
de células
y tejidos
vegetales

Área de Siembra o Transferencia
Cabinas de flujo laminar: área de trabajo,
mantenida estéril por el flujo continuo, no
turbulento de aire estéril.

Área de Incubación
•Asepsia.
•Temperatura: 25-27°C.
•HR: 99%.
•Fotoperiodo controlable.
•Intensidad luminica
controlable.

Reguladores de crecimiento
vegetales
o
fitohormonas

Reguladores de Crecimiento
• Son sustancias que promueven e influencian el crecimiento,
desarrollo y la diferenciación de células y tejidos.
• Determinan la formación de flores, brotes, hojas,
senescencia, el desarrollo y maduración de los frutos.

• Actúan a bajas
concentraciones (0,1 – 1,5
ppm).
• Interactúan unos con
otros (los resultados están
determinados por las
concentraciones relativas
de las diferentes
fitohormonas).
• Están involucrados en
numerosos procesos
fisiológicos.

• Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en
la planta durante todo su ciclo de vida, pero su concentración
fluctúa.
• Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico
de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.

Papel de diversas fitohormonas como
reguladores del crecimiento

Factores que influyen en Auxinas

Factores que influyen en Giberelinas

N
OH
O
Acido indol acético (AIA)
(auxina endógena)
Auxinas
Las Auxinas , descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de
bioensayos para caracterizar el mensajero responsable de la
elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptilo de
las gramíneas.
Se usan como promotores de la proliferación celular y la
inducción de la morfogénesis.

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes,
frutos y en el embrión.
• La concentración endógena en la planta
varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
• Su transporte es polar

Posibles etapas en la acción de la auxina

Funciones
• Alargamiento y división celular
• Crecimiento de secciones de hojas, tallos y
frutos
• Formación de raíces adventícias
• Dominancia apical
• Acción herbicida
• Estimulación de la producción de etileno.

(2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid
Acido 2,4,5 tricloro fenoxi acetico (2,4,5 T)
(2,4-dichlorophenoxy) acetic acid
Acido 2,4 diclorofenoxi acetico (2,4D)
Acido indol acetico (AIA)
β-indoleacetic acid
4-(1H-indol-3-yl)butyric acid
Acido indol butirico (AIB)
Acido naftalen acetico (ANA)
1-naphthylacetic acid

Descubiertas en 1955 al estudiar las
sustancias promotoras de la división celular
in vitro.
Están involucradas en variadas respuestas
fisiológicas:
•Promoción de la Division celular, regulador
de la fase G1.
•Promoción de la organogénesis (relación
auxinas/citoquininas).
•Retardo de la senescencia.
•Síntesis de clorofila y desarrollo de
cloroplastos.
Citoquininas
En combinación con las
auxinas, determinan
diferentes respuestas
morfogenéticas

Precursores de las
citoquininas
1. Se pueden obtener
como subproductos
del ADN sometido a
altas Tº
2. Conjugados de
ribosidos, riboctidos,
glucosidos, conjugados
de aminoácidos.
3. Ej: ribosido de zeatina,
riboctido de zeatina,
adenina, adenosina.
Se producen en el
embrión y en el ápice
de las raíces.
Su transporte es no
polar:
1. A través del xilema,
con transportador
especifico.
2. Por liberación como
ribósido o base
nitrogenada.

• Citoquininas endógenas:
• Zeatina (Zea)
• Isopenteniladenina (2iP)
• Citoquininas sintéticas:
• Kinetina (Kin)
• Benziladenina o Bencil amino purina (BAP)
• La concentración endógena en plantas varía entre
0,1 y 500 g/Kg.

Citoquininas - Estructura química
N
H CH2 CH C
CH3
CH2OH
Zeatina
N
H CH2 CH C
CH3
CH3
Isopenteniladenina(IP)
6-bencilaminopurina
N NH C
H
H
N
N N
N
N

• Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, en plantas de arroz
infectadas.
• Éstas presentaban marcada clorosis y entrenudos largos.
• El ácido giberélico (AG3) fue la primera giberelina identificada. En
la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.
O
H
CH3
H COOH
H
HO OH
CH3
C O
Acido giberélico (AG3)
Las Giberelinas

Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
– Favorecer el crecimiento y el alargamiento de los
entrenudos de los brotes nuevos.
– Promoción del crecimiento en plantas de
genotipos enanos.
– Crecimiento de yemas latentes.
– Germinación de semillas en dormición.
– Floración.
– Movilización de reservas en la semilla.

• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el
embrión.
• Los tejidos etiolados tienen alta conc. de
giberelinas.
• En menor proporción en ápices y en raices.
• Ruta de síntesis de la giberelina: ciclo de calvin.
• Se estudió su actividad biológica en mutantes
para las enzimas de la síntesis de AG.
• Su transporte no es polar.

Ácido absicico (ABA)
• Aislado de frutos jóvenes de algodón, que se secaban y caian
(abscisión o caída).
• Se estudio la latencia inducida por fotoperiodo.
• Sesquiterpenoide, acido débil: pH 4,75
• ABA natural y sintético.
• Regulación de la biosíntesis del ABA por desdoblamiento de las
xantófilas.
• Tiene efectos diferentes en tallo o raíz.
• Déficit hídrico moderado, ABA incrementa el elongamiento de la
raíz.
• Déficit hídrico severo, ABA inhibe el desarrollo de la raíz.

Reglas generales para la acción hormonal:
• Auxina : Citokinina = ~1 Callo
• Auxina : Citokinina < 1 Tallo
• Auxina : Citokinina > 1 Raíces

Respuestas no deseadas en
cultivo in vitro

Contaminación en el cultivo in vitro de
plantas

Principales fuentes de contaminación
• Contaminación de las plantas madres.
– El explante
• Contaminantes microbianos introducidos
en el laboratorio.
– El operario(a).
– El ambiente
– Los equipos y el instrumental.
– Los insectos.

Influencia de los microorganismos en el
cultivo in vitro
• Los principales microorganismos asociados con la
superficie de las plantas son: hongos, levaduras,
bacterias, spiroplasmas y micoplasmas.
• Las áreas donde se concentran mayor cantidad de
nutrientes en la superficie de las plantas son:
néctar, ceras, tejidos senescentes, etc.
• Las poblaciones de hongos y bacterias pueden
desarrollarse en residuos de insectos, además, las
hendiduras, pelos densos y superficies
mucilaginosas pueden albergar microorganismos.

Métodos de identificación de contaminantes
• Se emplean los métodos tradicionales auxiliados
de los manuales de clasificación
correspondientes, aunque existen modernas
técnicas como el análisis de ácidos grasos, PCR,
RFLP y AFLP que se incorporan para
microorganismos específicos de un cultivo.
• Es importante estudiar y determinar la microbiota
específica de un laboratorio, biofábrica o país
para poder diseñar los métodos de detección y
control en función de esto.

Contaminación
GRADO DE CONTAMINACIÓN DE EXPLANTES DE CAFÉ
INICIO
CONTAMINACIÓN
MEDIA
CONTAMINACIÓN
ALTA
CONTAMINACIÓNN

FENOLIZACIÓN EN EXPLANTES DE CAFÉ
INICIO
FENOLIZACIÓN
MEDIA
FENOLIZACIÓN
ALTA
FENOLIZACIÓN

Cultivo de varas de Phalaenopsis

Vitrificación
• Es el estado de hiperhidricidad (antes
conocido como vitrificación)
• Es una malformacion fisiológica que resulta de
una excesiva hidratación, baja lignificación,
disfunción estomática y una reducida fuerza
mecánica en los tejidos de las vitroplantas.
• La consecuencia es la pobre regeneración de
tales plantas.

Síntomas y cambios anatómicos
• Apariencia translúcida, debido a una
disminución de la clorofila y un alto contenido
de agua.
• Una delgada capa cuticular o su ausencia.
• Reducido número de células en palisada.
• Estomas irregulares.
• Una pared celular poco desarrollada.
• Grandes espacios intracelulares en la capa de
células del mesófilo.

Causas
• Alta concentración de sales.
• Alta humedad relativa.
• Baja intensidad lumínica.
• Acumulación de gas en el interior del recipiente.
• Duración del tiempo de intervalo entre subcultivos.
• Número de subcultivos.
• Concentración y tipo de agente gelificante.
• Tipo de explantes utilizados.
• La concentraciones de microelementos.
• Inbalances hormonales.

Causas
• La hiperhidricidad es comun en plantas
creciendo en cultivo liquido o cuando hay
una baja concentracion de agente
gelificante.
• La alta concentración de amonio también
contribuye.

Callos hiperhídricos de Nicotiana tabacum

Mecanismos por los que ocurre la
variación somaclonal
1. Alteraciones en el cariotipo.
2. Mutaciones puntuales.
3. Recombinación somática.
4. Elementos genéticos transponibles.
5. Metilaciones ADN.
6. Cambios ADN de orgánulos.
7. Prevalencia de tejidos quiméricos.

Factores relacionados con la aparición
de variación somaclonal
1. Genotipo.
2. Nivel de ploidía.
3. Explanto.
4. Vía de regeneración.
5. Condiciones de cultivo.
6. Reguladores del crecimiento.
7. Deficiencia de oxígeno.
8. Edad del cultivo.
9. Deficiencia o exceso de minerales.

Detección de la variación somaclonal
• Morfológicos
• Cariotípicos
• Bioquímicos
• Fisiológicos
• Moleculares

Variación en las hojas de yuca
regeneradas in vitro

Estrategias
para la
selección de
variantes
útiles

Somaclones comerciales
1. Caña de azúcar – Resistentes a
stress biótico y abiótico.
2. Patata – Resistencia a hongos y
virus.
3. Ornamentales – color: gerbera,
clavel y crisantemo, arquitectura
floral: geranio.
4. Camote – calidad de raíces.
5. Maíz – contenido en triptófano.
6. Tomate – contenido en materia
seca.
7. Apio – Rendimiento.
8. Arroz – resistencia a distintos
tipos de stress. Caracteres
agronómicos.
9. Mostaza – rendimiento.
10. Cebada – Tolerancia a glifosato.
11. Banana - resistente a Fusarium
oxyporum.
12. Tabaco – tolerante a Al y
resistente a herbicidas.
13. Trigo – resistente a
Helminthosporium.
14. Alfalfa – resistente a Fusarium
oxyporum.

Fase 4 de la micropropagación
La Aclimatación
Endurecimiento (hardening), Rustificación,
etc.

Aclimatación
• Plantas in vitro deben adaptarse y crecer en
condiciones in vivo (ex-vitro) más estresantes.
• La transición requiere Alta Humedad.
• Requiere una intensidad apropiada de luz.
• Requiere 20-25º C (muy variable).
• Requiere un suplemento adecuado de nutrientes.
• Requiere una correcta humedad del suelo.
• Crecimiento Nuevo = ÉXITO.

Aclimatación
• Adaptación de las plántulas de cultivos de
tejidos al ambiente externo.
• Medios ambientes extremadamente
diferentes – fuera y dentro.
• Puede requerir técnicas especiales para la
adaptación o fortalecimiento.

• La mayoría de plantas no pueden ser
transferidas directamente de cultivo al
invernadero o campo.
• Muchas de las caracteristicas de plantas
desarrolladas in vitro son muy diferentes de
las plantas que crecen in situ.
Aclimatación

Cera
epicuticular
• Clavel
A. Invernadero
B. Invernadero
C. Cultivo in vitro
D. Cultivo in vitro

Cera
epicuticular
Plantas de clavel in
vitro
A. Cultivo in vitro
B. Camara de
incubacion
C. Camara de
incubacion
D. Anormal
E. Invernadero
F. Anormal

Medios ambientes
• Cultivo de tejidos
– Poca luz
– Alta HR ~98%
– [CO2] - 300 ppm
– Sacarosa presente
– Esterilidad
• Invernadero/Campo
– Alta luz
– HR ~ 30-80%
– [CO2] - bajo
– No sacarosa
– Patógenos presentes

Cambios en las vitroplantas
• Cera epicuticular
• Funcionamiento estomatal
• Anatomia de las hojas
• Funcionamiento de las raices

Vitroplantas “Normales”
• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?
• Muchos sintomas de hiperhidricidad son poco
severos
– Cuticula desarrollada pobremente.
– Pueden tener cera epicuticular
– Espacios intracelulares grandes
– Desarrollo minimo de la palisada.

Anatomia foliar
• Cuticula muy delgada
• Grandes espacios de aire intracelular
• Capa de la células en empalizada pobremente
desarrolladas.

Fresa – crecimiento en invernadero
Capas en
empalizada
Mesófilo
esponjoso
Espacios de
aire

Fresa – cultivo in vitro
Grandes
espacios de
aire
Una capa de
células en
empalizada

Conductancia estomática en plantas cultivadas in
vitro

Deben ocurrir cambios
• Se debe formar la cera epicuticular.
• Los estomas deben responder mas
rapidamente.
• La actividad fotosintetica – incrementada.
• Obs: la cantidad de los cambios no es la
misma para todas las plantas.

Técnicas para Aclimatación
• Remoción de la sacarosa de las raices
• Aumentar HR
–nebulización
–Aspersión intermitente
• Luz reducida
–Gasa
–Malla Saran
Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz

El tipo de enraizamiento preferido es el que se realiza fuera del cultivo in vitro
(ex vitro).
Esta bandeja de brotes ha sido sacado del ambiente estéril, y son cortados y
sumergidos en una solución con hormona enraizante, (auxinas)

… luego estos brotes (aun sin raiz) son plantados en un sustrato estéril,
estableciendo algo asi como un almácigo

Son trasladados a un ambiente con nebulización y poca iluminación,
asemejando las condiciones de cultivo in vitro

En los próximos 10 a 14 dias, la nebulización es reducida y las
coberturas retiradas, hasta que las plantas no necesiten extra
protección (por eje. las plantas de la derecha)

Los brotes ya enraizados son trasladados a recipientes mas grandes, e
incrementarán su tamaño en solo algunas semanas.

Para terminar el proceso de aclimatación, se trasladan a un tinglado al
menos una semana antes de su plantacion. Y después de todo este
trabajo, las plantas están listas para el campo definitivo.

Sistemas de nebulización para
vitroplantas

México, Noviembre de 1998
• Indicios de que la industria del agave para
tequila (Agave tequilana Weber var. Azul)
tenía una gran demanda
• Por ende, se estaban realizando año con
año plantaciones cada vez mayores.
• Las estadísticas de siembra indicaban
necesidades de hasta 30 millones de
plantas al año.

1999
• Se había declarado una fuerte necesidad de
material vegetal de siembra sano para esta
industria, dado que las enfermedades propias del
cultivo estaban acabando con gran parte de las
plantaciones.

(a) Selección de las plantas donadoras por su alta productividad

(b) Inducción de la planta madre para selección de tejidos libres de enfermedades

(c) Multiplicación de plantas in vitro por gemación axilar

(d) Plantas enraizadas al salir del laboratorio listas para su aclimatación
en invernadero

(e) Plantas adaptadas al salir del invernadero

(f) Plantas micropropagadas de cuatro meses en el
campo.

(g) Plantas micropropagadas de ocho meses en el campo.

AGROMOD, una subsidiaria de Savia en México
• El primer año de funcionamiento, se produjeron
400 mil plantas.
• En el año 2002 se lograron dos millones.
• Para el 2003 se proyectó superar los 4,5 millones,
tomando en cuenta tres especies: Cordyline,
banano y agave.

• Desde el punto de vista económico, no sólo
se resolvió el desabastecimiento de
material limpio, homogéneo y de calidad,
sino que se logra un impacto altamente
significativo en los costos de producción de
materia prima para tequila.

COMPARACIÓN ENTRE LA
PROPAGACION TRADICIONAL Y CULTIVO DE
TEJIDOS DE PLÁTANO

Propagación
clonal de
Carica papaya
var. Maradol y
Tainung.

• Propagación vegetativa rápida y a gran
escala
• Uniformidad seleccionada del material
clonado.
• Multiplicación de plantas recalcitrantes
a las técnicas convencionales
• Reducción en el tiempo de multiplicación
y en el espacio requerido para tal fin.
• Mayor control sobre la sanidad del material
propagado y posibilidad de Certificación.
• Introducción rápida de nuevos cultivares
• Conservación de germoplasma
• Facilidades para el intercambio internacional
de material vegetal
Ventajas de la
Micropropagación
vegetal

• Instalaciones muy especializadas
• Trabajadores especializados.
• Contaminación.
• Diferente protocolo de micropropagación
dependiendo de la especie o cultivar.
• Tamaño de la plántula, al inicio son muy
pequeña.
• Estabilidad genética.
• Costos.
Desventajas de la
micropropagación
vegetal

• Ornamentales:
•Bromeliaceas
•Helechos
•Orquídeas
•Anthurium
• Especies leñosas:
•Araucaria
•Coffea
•Eucalyptus
•Malus
•Rosa
•Vitis
• Otras plantas (hortícolas)
•Allium
•Apium
•Arachis
•Asparagus
•Beta
•Brassica
•Glycine
Ejemplos plantas
micropropagadas
in vitro

http://www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology/art-02.html
Organogénesis
Definición amplia:
Produccion de órganos a
partir de explantes, sea
indirectamente a traves del
estadío de “callo” o
directamente del tejido.

Sistemas de
propagación
vegetativa
in vitro
Propagación vegetativa in vitro
Regeneración directa e indirecta

Material de partida
1. Meristemos caulinares
y segmentos de tallos
con yemas axilares.
2. Tejidos que formen:
tallos adventicios y/o
embriones adventicios,
directamente o
indirectamente.

Micropropagación
vegetal:
Otros Explantes
•Parte esporofitica
de estructuras
reproductivas:
estaminodios,
estambres, pétalos.
•Hojas jóvenes.

- Multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares
preexistentes.
- Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de
dichos meristemas.
- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula en base al número de
brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial,
entre un repique y el sucesivo.
- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta
técnica.
Propagación
vegetativa a partir
de yemas
preexistentes

Cortes Nodales
Las secciones nodales se cortan
y se individualizan, usandose
como explantes para producir
nuevos talluelos.
El seccionamiento de los nodos
elimina la dominancia apical .
http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/Chap3898/sld006.htm&h

La tasa de
multiplicación
(t.m.) puede variar
entre 2 y 20
brotes por mes,
dependiendo de la
especie en
cuestión, entre
otras variables.

Ejercicio:
Cuantas vitroplantas se pueden obtener después de
un año, con una tasa de multiplicación de 5 brotes por
mes, a partir de una única yema inicial.
Mes 0: 1 brote
Mes 1: 5 brotes
Mes 2: 5 x 5 brotes
Mes 3: 25 x 5 brotes
Mes 12: ………………..

Multiplicación de
brotes Vaccinium
meridionale.
Tasa de
multiplicación 15-25
brotes/explante

Callogénesis en la
naturaleza

Embriones iniciados a partir de células que no son el producto
de la fusión de gametos.
Embrión somático, asexual o adventicio
Son estructuras bipolares
con un eje radical-apical y no
poseen conexión vascular
con el tejido materno, las
estructuras bipolares deben
ser también capaces de
crecer y formar plantas
normales.

• La Embriogénesis Somática es la
producción de embriones a partir de
células somáticas o “no-germinales”.
• Pueden ser producidas por cultivos de
suspensión celular.
• Puede involucrar un estadio intermediario
de callo (E. indirecta), lo cual resultaría en
mayor probabilidad de variación
somaclonal entre las plántulas generadas.
Embriogénesis Somática

• Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:
– Masas proembriogénicas
– Estadío globular
– Torpedo
– Embrión.

• Procedimiento para la regeneración vía
embriogénesis somática:
1. Iniciación: callos embriogénicos
2. Proliferación: callos embriogénicos, masas
proembriogénicas (PEM)
3. Desarrollo y maduración de embriones :
embriones
4. Germinación de embriones (Regeneración)

Carrot: Cell suspension-derived Grapevine: Callus-derived

Semilla artificial - antecedentes
• Muchas especies son estériles y no producen semillas.
• Otras especies, en particular algunas tropicales, producen
semillas recalcitrantes que no pueden ser secadas.
• Poca efectividad en la conservación del germoplasma y
con grandes gastos (actualmente son con plantas vivas en
el campo).
• Altos costes para la obtención de pequeñas cantidades de
semillas híbridas.

Semillas artificiales
• Llamadas también semillas sintéticas
• Producción en masa de semillas genéticamente
mejoradas.
• Es la encapsulación de embriones somáticos, con
la finalidad de protección y nutrición, con un
material permeable al agua y biodegradable.

Explante
(disco de hoja)
Explanto
(células vegetales)
REGENERACIÓN
Suspensión celular
Embriones somáticos
ENCAPSULACIÓN
GERMINACIÓN
GERMINACIÓN Semilla
artificial
Callo
Esquema general de producción de semilla artificial

Procedimiento:
1. Encapsular en
cápsulas de gel,
recubrir con una
cubierta adecuada,
almacenar.
2. Polímeros: gel de
alginato, gelatina,
agar, goma, etc.
Semillas artificiales

Semillas sintéticas de
orquídea obtenidas por
encapsulación en
alginato

Producción sincronizada y en gran escala de
los embriones somáticos
• Es fundamental contar con
embriones:
– Simples
– Que no se fusionen entre sí
– Que no se generen embriones
secundarios
• Se han desarrollado diferentes
procedimientos basados en filtros y
equipos clasificadores automáticos
• Son biorreactores que permiten el
control simultáneo de pH, la
concentración de oxígeno,
temperatura y mezclado entre otras
cosas.

Se han obtenido embriones somáticos
en especies como:
• Alfalfa (Medicago sativa).
• Soja (Glycine max).
• Apio (Apium graveolens).
• Pasto ovillo (Dactylis glomerata) .

Etapas de la Micropropagación vegetal

A) Iniciación O Establecimiento
- Elección y acondicionamiento de la
planta madre.
- Elección del explante inicial y de la
formulación del medio de cultivo.
- Desinfección superficial de los
explantes.
- Establecimiento per se del cultivo in
vitro.
B) Multiplicación
- Multiplicación del material stock

C) Enraizamiento
Enraizamiento de los brotes
obtenidos in vitro
D) Aclimatación, Rusticación o
Endurecimiento (Hardening)
Pasaje de las plantas crecidas in vitro
a las condiciones de maceta o a
campo

Planta Madura
Hoja Joven
Antioxidante, retarda
el oscurecimiento
Del tejido
Desinfección con
Hipoclorito de
sodio Sumergido en etanol
Cortar en segmento (descartar
porciones externas)
Placa petri estéril
Insertar segmentos
dentro de medio de
multiplicación
4 a 6 semanas
Primordios
Plantas pequeñas
Crecimiento
Continuo
Dividir en subcultivos
y colocar en medio de
multiplicación fresco
Separar las plántulas
individualmente
Medio de Pre trasplante
Planta joven
en su maceta
Las 4 etapas del cultivo de tejidos de plantas
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Formación de la raíz

Principales métodos de Micropropagación

Meristemas
Los meristemas son grupos de células indiferenciadas que
retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de
vida de una planta.

Los meristemas determinan el crecimiento de
la planta y dan origen a sus diferentes órganos

Aplicaciones
• Posibilitan la micropropagación de diferentes
especies vegetales. Sin embargo, toma más
tiempo la producción de brotes.
• Constituyen el explante ideal para liberar de
patógenos in vitro a plantas infectadas por
virus, hongos y/o bacterias.
• Son ampliamente utilizados como explantes
para la criopreservación y conservación de
germoplasma.

Domo Meristemático + primer juego de hojas
Meristema apical
Primordios foliares

El cultivo de meristemas no incluye los
meristemas laterales. Solo el meristema apical.
Yemas laterales
Tejido para el cultivo de
meristemas

- El domo meristemático no está vascularizado
(muchos patógenos se translocan por los tejidos
de conducción).
- El número de partículas virales es menor en los
meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de división celular a nivel del
meristema es mayor que la velocidad de
replicación de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del
cultivo de meristemas fueron obtenidas por
Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de
cultivos de papa y Dahlia.
El cultivo de
meristemas
facilita la
eliminación de
patógenos

Existen varias alternativas complementarias al cultivo
de meristemas, para obtener plantas libres de virus:
Limpieza de virus
Termoterapia Quimioterapia

Talluelos in vitro son colocados en una camara de crecimiento
por 3-6 semanas a una temperatura de 34-38 oC.
Después de la termoterapia, los meristemas se extraen para
el cultivo.
Termoterapia

Esta práctica no es efectiva para todos los virus por igual,
depende del virus y del hospedante.
Se ha observado que un mismo virus en distintas especies
se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta práctica
ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y
menos eficiente para virus poliédricos.
En algunos casos las bajas temperaturas (5°C) seguidas del
cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la
eliminación de virus.
Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de
viroides, los cuales se desarrollan bien con altas
temperaturas.
Termoterapia

El uso de antivirales sería la solución definitiva para las
enfermedades virales; sin embargo, hasta ahora no se ha
encontrado un producto que por sí solo cumpla esta
función.
Algunas sustancias químicas ocasionan una disminución
en la concentración de virus existentes en la planta y
atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los virus,
pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la
concentración original.
Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la más
utilizada es el Ribavirin o Virazole.
Quimioterapia

Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad,
que a su vez depende de la dosis empleada y de la
especie de planta utilizada.
El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios
meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral
constituye una dificultad.
También se han obtenido plantas libres de virus a partir de
callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque
esta práctica no ha sido eficiente en todos los casos.
Quimioterapia

Un modo adecuado de emplear los antivirales es
combinándolos con el cultivo de meristemas.
También han sido aplicados directamente a los
meristemas in vitro.
En este caso, el antiviral es colocado en medio del
cultivo en concentraciones variables, que van desde 10
a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las
plantas son mantenidas bajo la acción del antiviral por
largos períodos que incluyen varios subcultivos.
Quimioterapia

Piña
 Tamaño del meristemo: 2 mm
 Intensidad luminosa: 3000 lux
 Fotoperiodo: 12 horas de luz
 Temperatura: 28 +/-4°C
 Medio de iniciación y establecimiento:
(MS)
• BAP : 2.0 mg/l + ANA: 1 mg/l
 Medio de enraizamiento: (MS)
• ANA : 2 mg/l
Resultado: Plantas asépticas de piña

Plátano
 Tamaño del meristemo: 0.5-0.7 mm
 Intensidad luminosa: 2000 lux
 Fotoperiodo: 16 horas de luz
 Temperatura: 26-28°C
 Medio de iniciación: Murashige & Skoog (MS)
• BAP :1.0 mg/l
 Medio de multiplicación: (MS)
• BAP :3.0 mg/l
 Medio de enraizamiento: (MS), sin hormonas
Resultado: Plantas de plátano asépticas.

Manzano
Tratamiento con calor: 37°C x 2 semanas
Tamaño del meristemo: 0.8-1.0 mm
Intensidad luminosa: 3000 lux
Fotoperiodo: 16 horas de luz
Temperatura: 26°C
Ribavirin: 25 ug. x 2 subcultivos (40 días)
Medio de iniciación: Murashige & Skoog
• BAP :1.0 mg/l
Resultado: Plantas de manzano libres de virus.

Cuadro 4. Eficacia de Virazole para
eliminación de virus en papa.

• Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los
virus son los responsables de las mayores pérdidas
(entre un 20 y 80% de disminución en el peso de los
bulbos).
• Las infecciones son causadas por un complejo viral que
incluye:
– Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe
virus, LYSV);
– Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantent
virus, SLV),
– Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X, GarV -A -B -C- D- E
-X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV).
Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)
libre de virus

 Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas
con una mezcla de tierra/mantillo/arena (1/1/1) y
mantenidos en una cámara a 36ºC.
 Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60
días a 36°C y luego se hizo el cultivo de meristema, se
regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron
resultaron «libres de virus».
Producción de plantas de ajo (Allium sativum L.)
libre de virus

A: planta en medio de iniciación.
B: micropropagación.
C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos).

D: planta transferida a tierra y mantenida en cámara húmeda.
E: planta adaptada a las condiciones ex vitro.
F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos.

G: multiplicación a gran escala bajo jaula antiáfidos.
H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).

Esquema de
producción
Plantas de ajo
libres de virus
IFFIVE-INTA,
Argentina.

Métodos para detección de
fitopatógenos

Métodos Serológicos
ELISA: Enzyme-linked Inmunosorbent Assay
Ensayo de inmuno absorción ligada a enzima (tipo sandwich)

Ralstonia solanacearum Bv2A (Raza 3)
• Bacilo gram negativo
• 0.5 x 1.5 um
•Presenta flagelo polar ( atípico)
• Aerobia estricta
• Temperatura óptima: 28-30ºC

Marchitez Bacteriana o pudrición parda
de la papa
• Segundo factor más importante que limita la producción de papa
• Gran variabilidad del patógeno
• Amplio rango de hospedantes
Amplia distribución geográfica

Peru: Marchitez bacteriana, Seca seca,
bacteriosis, borrachera
Nombres:

Mucilago típico en el tubérculo
Advanced rotting involving secondary infections
Probredumbre parda
Pudrición parda, moco, mokera, papa llorona

Rss
Bact / ml
108
107
106
105
(+E)
Control
(-E)
Muestra
negativa
Muestra
positiva
+E = Extracto de suelo sano con enriquecimiento
- E = Extracto de suelo sano sin enriquecimiento

Aclimatación
• La mayoria de plantas no pueden ser
transferidas directamente de cultivo al
invernadero o campo.
• Muchas de las caracteristicas de plantas
desarrolladas in vitro son muy diferentes de
las plantas que crecen in situ.

Medios ambientes
• Cultivo de tejidos
– Poca luz
– Alta HR ~98%
– [CO2] - 300 ppm
– Sacarosa presente
– Esterilidad
• Invernadero/Campo
– Alta luz
– HR ~ 30-80%
– [CO2] - bajo
– No sacarosa
– Patogenos presentes

Plantas Hiperhídricas
• Los más extremos – una maladaptación al medio
ambiente externo.
• Vidriosas, apariencia estar llenas de agua.
• Capa de la palisada pobremente desarrollada.
• Reducida lignificación.
• Paredes celulares delgadas.
• Espacios intracelulares grandes.
• Falta de la cera epicuticular.

Causas de la Hiperhidricidad
• Estado fisico del medio
– Liquido
– Agar
– Gelrite
• Citokininas

Vitroplantas “Normales”
• ¿Pueden ser las vitroplantas “normales”?
• Muchos sintomas de hiperhidricidad son
poco severos
– Cuticula desarrollada pobremente.
– Pueden tener cera epicuticular
– Espacios intracelulares grandes
– Desarrollo minimo de la palisada.

Deben ocurrir cambios
• Se debe formar la cera epicuticular.
• Los estomas deben responder mas
rapidamente.
• La actividad fotosíntetica – incrementada.
• Obs: la cantidad de los cambios no es la
misma para todas las plantas.

Epicuticular
Wax
• Carnation tc plants
A. Tissue culture
B. Growth chamber
C. Growth chamber
D. Abnormal
E. Greenhouse
F. Abnormal

Epicuticular
Wax
• Carnation
A. Greenhouse
B. Greenhouse
C. Tissue culture
D. Tissue culture

Anatomia foliar
• Cuticula delgada.
• Grandes espacios intracelulares con aire.
• Capa de celulas en empalisada pobremente
desarrollada.

Strawberry - Greenhouse grown
palisade
layers
spongy
mesophyll
air spaces

Strawberry - Tissue culture
large
air
spaces
one layer
of
palisade
cells

Técnicas para Aclimatación
• Remoción de la sacarosa de las raíces
• Aumentar HR
– nebulización
– Aspersión intermitente
• Luz reducida
– Gasa
– Malla Saran
• Gradualmente reducir la HR e incrementar la luz

At C&W, as with many commercial labs, rooting in culture (in vitro) is skipped in favor of rooting out of
culture (ex vitro). This tray of unrooted microshoots has now been taken out of the sterile environment.
The microcuttings, as they are called, are trimmed up and soaked in a rooting hormone (auxin) solution...

...then planted in flats much like young bedding plants. At this point they still have
no roots.

Flats of unrooted microcuttings are transferred to a fog chamber within a
greenhouse. Directly out of culture, the plantlets need high humidity levels and
reduced light (similar to the in vitro environment).

Over the next 10-14 days, fogging is diminished and the tent opened up, until the
plants do not need extra protection (ie. the plantlets on the right). This process is
known as acclimatization or hardening off.

The microcuttings have rooted, transplanted into larger cells, and increased
greatly in size in only a few weeks.

After all that work, the plants are ready for the field. They are moved to a shade
house at least one week before planting to finish the hardening-off process

 Cultivo de los gametos de la planta:
microsporas u óvulos (células germinales).
 Estas son haploides (1 juego de
cromosomas).
 Las plantas regeneradas son haploides.
 Las plantas regeneradas esteriles.
 No pueden llevar a cabo la meiosis.

 El número de cromosomas necesitan ser
duplicado y obtener plantas dihaploides (las
plantas recuperadas son diploides y 100%
homocigotas, AABBCCDDEE, AABBCCDDee,
aabbccddee, AAbbCCddEE).
 Se usan inhibidores de la mitosis: colchicina,
fluoralina.
 “Fija” los rasgos, disminuyendo el tiempo de
mejoramiento.
 La mayoría de variedades de Canola son
dobles haploides.

 P: AABBCCDDEE x AABBCCDDee
 F1: AABBCCDDEe x AABBCCDDEe
 F2: ¼ AABBCCDDEE, ½ AABBCCDDEe, ¼ AABBCCDDee
 F3:
 HAPLOIDES: ABCDE, ABCDe
 DIHAPLOIDES: AABBCCDDEE, AABBCCDDee

Técnica de micropropagación in vitro, que cultiva
anteras de cultivares elite para regenerar plantas
haploides y diploides (líneas homocigotas), sin
pasar por la endogamia artificial.
 Desarrollada por Guha y Maheshwari (1964), en
petunia, hoy se ha extendido a más de 150
especies: arroz, trigo, cebada, maiz, oleginosas,
tabaco, etc.

 Las células gametofiticas (microsporas o megasporas) originan
esporofitos haploides por androgenesis y ginogenesis,
respectivamente.
 Las anteras inmaduras, son cultivadas en un medio donde se
dividen para formar callo y posteriormente regenerar plantas
haploides.
 Los haploides duplicados producen progenie homogénea y
estable .
 Lineas completamente homocigotas son producidas en la mitad
del tiempo requerido por el proceso convencional (v.g. arroz)
 Recombinant Inbred Lines (RILs)

 Fácil de evaluar en cualquier etapa del proceso
 Lento desarrollo del mejoramiento genético por
los bajos porcentajes de regeneración.
Limitaciones técnicas:
- Renuencia a la regeneración de plántulas.
- Bajos porcentajes de plantas haploides.

A. Genotipo de las plantas donantes
 Variabilidad en la respuesta al cultivo de anteras,
entre especies y dentro de ellas; y su
heredabilidad.
 Muy evidente en cultivares de ARROZ
 La capacidad genotípica de la cebada y trigo, son
rasgos heredados respecto a la formacion de
callos y regeneracion de plantulas

B. Ecofisiologia de las plantas donantes
El fotoperiodo
Intensidad luminosa
Temperatura
Nutrición mineral
En tabaco, trigo, cebada y arroz, los granos de
polen son morfológica y funcionalmente
diferenciados.

.
C. Desarrollo del polen
• Mejor respuesta se tiene cuando se cultiva el
polen entre la fase de microspora tardía y de
polen temprano
D. Pretratamiento de las anteras
• Temperaturas bajas o altas, con choque
osmótico o con otros estimulos – AUMENTA LA
PRODUCCION DE PLANTAS A PARTIR DE POLEN

• Anteras o paniculas de arroz a 35oC/10 - 15 min. seguido de 8 dias a
10oC - AUMENTA LA RESPUESTA AL CULTIVO DE ANTERAS
• El tratamiento de frío se relaciona con una disminución del albinismo
de cereales y la estimulación de la mitosis ecuacional de las
microsporas androgenéticas

E. Medio de Cultivo
• Medio liquido: aumenta enormemente el porcentaje de plantas
androgenéticas
• Hay correlación entre el medio de inducción de callos y la tasa de
regeneración de plántulas de ARROZ
• Mayor porcentaje de regeneración/numero de anteras plaquedas,
hubo en callos inducidos en medio liquido y menos en medio
semisólido

• La adición de extracto de papa al medio de
inducción, aumenta la producción de plantas.
• Niveles altos de sacarosa para inducción de callos y
bajos niveles para la regeneración.
• Mayor concentración de auxinas para la inducción de
embriones y callos.

Protocolo
• Separación y siembra de anteras en medio de cultivo (ejm. medio
líquido N6 de Chu, 1978)
• Formación de callo y posteriormente embrioides (25°C en luz u
oscuridad)
• Plántulas haploides regeneradas se someten a luz continua (3000 lux)
• Vitroplántulas de 0.3 cm, se extraen y transfieren a un medio de
enraizamiento (12 h. de luz y 6000 lux)

RESUMEN
 Se estudió el efecto de la exposición a 4 °C (durante 7, 14 y 21 días) y
diferentes concentraciones de fitohormonas sobre la regeneración de
plantas a partir de anteras de arroz (Oryza sativa L.), cv. Japónica
H2005
 Los resultados mostraron que el tratamiento a 4 °C por 7días estimuló
la inducción de callos. Las fitohormonas fueron esenciales para esta
inducción, lográndose el mayor efecto con una combinación de 2,4-D
(1.5 mg L-1) y KIN (1 mg L-1). Se obtuvo también mayor formación de
brotes y raíces con la misma auxina y BAP (0.5 mg L-1)
 La transferencia a un medio de cultivo sin 2,4-D, permitió obtener
37.5% de conversión a plantas haploides

Figura 2. Regeneración in vitro de plantas de arroz cv
H2005 por cultivo de anteras.
A: Anteras

Figura 2. Regeneración in vitro de plantas a partir de anteras
de arroz cv Japónica H2005
B: Inducción de callos

C: Formación de brotes

D: Formación de raíces

E: Regeneración de vitroplántulas

E: Plántula haploide de arroz

 Util para aquellas especies de ciclo de crecimiento largo
o para aquellos cultivos de ciclo corto, que se
desarrollan a una tasa de un ciclo por año.
Ejm. La homocigosis del arroz se consigue en 1.5 a 2
años, lo que normalmente se hace en 3 o 6 años
 El cultivo de anteras en tabaco es el sistema mas
avanzado para obtener haploides diploidizados
 Progreso considerable con algunos cereales: trigo,
cebada y arroz.

 El potencial de las anteras depende de la genotipo de las
células madre del polen
 Permite seleccionar eficazmente los recombinantes
deseables; asi como, obtener lineas homocigotas
 Las lineas homocigotas regeneradas fijan su genotipo y no
sufren segregación adicional
 En los haploides duplicados no hay codominancia; i.e.,el
fenotipo = genotipo y aumenta la eficiencia de la selección
 AaBbCcDDEeFF -> AABBCCDDEEFF y aabbccddeeff
 El tiempo, el espacio y los costos son muy reducidos.

 Seguirá siendo el método potencialmente mas eficaz para
obtener plantas haploides
 Debe de tenerse en cuenta dos serias limitaciones:
 Fuerte dependencia genotipica
 Escaso número de plantas regeneradas
 Técnicas moleculares dan valiosa información sobre la genética
de caracteres relacionados con el cultivo de anteras
 Deberá ser accesible a otras especies cultivadas como: yuca y
maiz

A partir de Microsporas
Re-programación del desarrollo de la microspora para lograr la
formacion directa de un embrion.
Embriogenesis de Microsporas

Finalidad
 Genera un gran numero de plantulas esporofiticas
dihaploides que son equivalentes a las lineas
homocigoticas derivadas de retrocruza.
 Acorta el ciclo de mejoramiento por 20-40% (un
doble haploida  F6 de retrocruza)
 Expone los rasgos recesivos.
 Permite un facil tamizado de grandes poblaciones.c

¿Como?
Seleccionar yemas florales con anteras conteniendo
predominantemente microsporas en un estadio temprano de
desarrollo.
Colapsar las anteras e aislar asepticamente las microsporas.
Realizar un Cultivo en suspension de microsporas a una alta
densidad poblacional bajo condiciones determinadas, y
usualmente con un tratamiento de ‘shock termico´.

Caso: Canola (Brassica napus).
Se regeneraron Plantas Dihaploides con un alto contenido acidos oleico y linoleico
reducido y acidos α-linolenico en el aceite de la semilla. Se probaron en el campo por la
estabilidad del perfil de acidos grasos y rasgos de rendimiento.

Microsporas uninucleadas en suspension
(Brassica napus)

Embriones en estadio temprano}
(7-10 dias)

Embriones estadio Medio
(10-14 dias)

Embriones estadio tardio
(21 days)

Embriones cotiledonarios en estadio tardio

“Germinacion”
Embriones
Cotiledonarios
transferidos a
condiciones de
crecimiento con luz
y AG3.

Crecimiento de plantulas haploides en cultivo
de medio semi-solido

Plantula bien-desarrollada haploide lista para
transferencia a suelo, o para duplicacion
cromosomica

1. Recolección de germoplasma (accesos o accesiones).
2. Evaluación y caracterización.
3. Conservación.
4. Programa de mejoramiento:
a. Cruzas
b. Selección
c. Estabilización
d. Evaluación regional (ambientes)
e. Validación
5. Registro comercial.
6. Programa de reproducción de semilla.
7. Mercadeo.
Proceso de investigación y desarrollo de una
nueva variedad

Qué son los recursos genéticos
• Según la Convención de Diversidad Biológica
(1992), los Recursos genéticos son material
genético de valor real o potencial, o también
son consideradas las variaciones acumuladas
por un cultivo durante su proceso evolutivo.
• Pueden definirse como materiales biológicos
con valor actual o potencial, que contengan
unidades funcionales de herencia o “un
acervo de información evolutivamente
relevante” .

Valor de los recursos genéticos
• En la naturaleza podemos encontrar que ya se
tienen las soluciones a muchos de los
problemas que queremos resolver.
• El ser humano las ha aprovechado por mucho
tiempo, imitando, seleccionando y mezclando
los atributos de los organismos, modificando
organismos directamente:
– “idea”… por ejemplo: El velcro.
– “selección”… variedades de maíz
– “técnicas biotecnológicas”… organismos
genéticamente modificados

• Los procesos evolutivos han seleccionado una
gran diversidad de organismos.
• La sobrevivencia de estos organismos esta
basada en un paquete de estrategias de
defensa, ataque, alimentación, etc.
• Estas características están codificadas en su
información genética.

• Han contribuido y contribuye a la estabilidad
presente y futura de:
– Agricultura y ganadería
– Medicina (etnobotánica)
– Procesos industriales
• Aprovechamos los recursos genéticos
físicamente:
– como material biológico (ej. Barbasco).
– como material para mejora genética con
mercados más o menos operantes.

• El avance tecnológico multiplica el valor de los
recursos genéticos
– Bioensayos farmacéuticos.
– Ingeniería genética.
lo cual también hace uso de los recursos
genéticos como INFORMACIÓN.
• Estamos en una era basada, no en lo que
podemos extraer de la naturaleza, sino en lo
que podemos aprender de ella.

Contribución de los RRGG a la economía del pais: desafios y amenazas

Convención de la Diversidad Biológica
1. La conservación de la biodiversidad.
2. El uso sostenible de sus componentes.
3. El disfrute justo y equitativo de los
beneficios obtenidos de la utilización de
los recursos genéticos.
• Importancia:
• Seguridad alimentaria.
• Salud.
• Valor espiritual y religioso.
• Agua fresca, combustibles, materiales de
construcción, ropa.

Pérdida de la biodiversidad
(influencia antropogenica)
• Urbanización (agua, vivienda, salud,
educación, etc.)
• Mayor presión sobre los recursos (erosión
suelos, deforestación, sobrepastoreo,
salinidad, > uso de energía no renovable, etc.
• Cambio climático (climas extremos, aparición
de nuevas plagas y enfermedades), etc.
• Domesticación y selección.

Consecuencias de la domesticación
Las plantas domesticadas se caracterizan por:
- Rasgos que confieren adaptación al ambiente
humano.
- Pérdida de capacidad reproductiva, de
dispersión de la semilla e inactividad de la
semilla.
- Pérdida de capacidad adaptativa.

Erosión genética
1. Disminución de la
frecuencia de un alelo
en una población, hasta
su extinción
2. Disminución de la
diversidad de la raza
dentro de la región
3. Extinción o
desaparición de la raza
en la región

Principales amenazas de la
biodiversidad
• Especies foráneas invasivas.
• Cambio climático.
• Incremento de nutrientes y contaminación.
• Cambio de habitat.
• Sobreexplotación.
Los conductores indirectos que interactuan en formas complejas para
causar cambios en la biodiversidad inducidos por la humanidad. Son
los factores demografico, economico, socio-politico, cultural, religioso,
cientificp y tecnologico

Desafíos
• Población 27 000 000 (doblará en
30-40 años), 40% rural.
• 4,2 millones de Has (3,3 % del
territorio peruano).
• 0,16 Has per cápita (uno de los más
bajos de los países en desarrollo).
• Cerca de 25 000 sp. de plantas:
– 180 sp. domesticadas
– 1044 sp. de uso medicinal

Conservación in situ
• Se lleva a cabo en los “laboratorios de la evolución”(campo de
agricultores, parques nacionales, reservas naturales).
• Puede tener un componente participativo de las comunidades
o agricultores.
• Tiene en cuenta el potencial evolutivo del material ya que los
recursos genéticos tiene que hacer frente a factores bióticos y
abióticos, así como al flujo de genes.
• Cultivos están sujetos a presión de selección, control del flujo
de genes con parientes silvestres, y entre cultivares.
• Material de bancos pueden ser introducidos (repatriados),
probados, incrementados y llegar a adaptarse.
• En el tiempo y espacio: selección, migración, deriva y
recombinación.

Casos de conservación in-situ
• IPGRI (ahora Bioversity): Fortalecimiento de las bases
científicas de la conservación in-situ
• IIAP/INIA/ONGs: Conservación in-situ de los cultivos
nativos y sus parientes silvestres
• CONDESAN: Raíces y tuberosas andinas
• EE Andenes, INIA: Rescate de variedades
• Conservación de especies amazónicas
• Selección participativa y producción descentralizada
de semilla

Casos de conservación in-situ

Conservación «ex situ»
• Bancos de semillas (Cámaras de conservación
de semillas)
• Colecciones en campo: plantas perennes,
agámicas con semillas recalcitrantes.
• In vitro.
• Jardines botánicos.
• Crio-conservación.
• Conservación de polen.
• Conservación directa de ADN.

Accesión
• También llamada: entrada o acceso
• Unidad de conservación ex situ.
• La semilla se accesa a un banco de
germoplasma cuando se conoce su
origen, su representatividad y cuando
tiene información sobre su origen e
identificación.

• Banco de germoplasma: son campos, invernaderos,
laboratorios, cámaras frías donde se conservan
recursos genéticos.
• Bancos germoplasma en el Mundo: 1460
• N° aproximado de muestras conservadas: 5 400 000
• Limitante: escasos recursos financieros para
– Mantener cámaras frías y conservar viabilidad semillas.
– Regenerar semillas para asegurar su viabilidad
– Caracterización y evaluación
– Documentación para dinamizar su utilización
Bancos de Germoplasma

Germoplasma en los centros del CGIAR
(Consultative Group I Agriculture Research)
Centro Especie Número de accesiones
CIAT Frijol común 36,000
Frijol (especies relacionadas) 5,100
Yuca cultivada 4,600
Yuca silvestre 30
Leguminosas forrajeras 18,000
Gramíneas forrajeras 2,500
CIMMYT Maíz 10,500
Trigo 60,000

CIP Papa cultivada 5,000
Papa silvestre 1,500
Camote 5,200
ICARDA Gramíneas (Cebada, trigo) 50,000
Leguminosas (Lenteja, haba, garbanzo) 17,000
Especies forrajeras 20,000
ICRISAT Sorgo 22,500
Mijo 16,000
Garbanzo 24,000
Maní 14,300
Cajanus 11,000

IITA Camote 1,000
Plátano 450
Yuca 2,000
Dioscorea 1,000
Caupí 15,000
Arroz 12,000
Bambara 2,000
Soya 1,500
Vigna 800
ILCA Gramíneas 1,500
Leguminosas 6,500
Forrajeras arbustivas 1,400
IRRI Arroz (Oriza sativa) 80,000
Arroz (especies relacionadas) 4,521

Conservación in vitro
Bajas
temperaturas
y/o alta
concentración
osmótica en el
medio de
cultivo

Infraestructura para incubación de los
cultivos in vitro
• Cultivo in vitro de bajo nivel de
crecimiento:
– Almacenamiento frio: 0 – 15° C. considerar un
deshumidificador.
– Almacenamiento templado: 15 – 35°C.
• Cultivo in vitro sin crecimiento
– Almacenamiento criogénico

Número de réplicas en una accesión
• En bancos de germoplasma en todo el
mundo, el número de replicas en campo
varía, por ejemplo:
– 22 a 100 para pastos y forrajes.
– 5 a 10 para Cassava.
– 10 a 12 para el camote.
– 2 a 3 para ajo, arboles o arbustos
– 6 a 10 para plantas herbaceas
– 3 a 20 para plátano/banano

• El mantenimiento de tales replicas
requieren espacio y mano de obra, los
cuales son factores limitantes.
• Si se realiza una caracterización botánica
o morfológica, se requerirán pocas
plantas, sin embargo, la caracterización
agronómica si requiere una considerable
cantidad.

• Para las colecciones in vitro, el numero de
replicas varia de 3 a 20, dependiendo del
cultivo o especie en particular.

Mantenimiento de la estabilidad
genética
Variación genética debe ser reducida al mínimo
1. Plantas propagadas por semilla
Colección base:
-18°C, asume regeneración después de 50 años.
-196 °C, podría ser bueno para semillas recalcitrantes.
Apropiado para pequeñas poblaciones.
Colección activa/trabajo:
4° C, regeneración c/20 años aprox.

Estabilidad
2. Plantas propagadas clonalmente/semillas
recalcitrantes
• Campo
• In vitro: colección base (6 – 8 °C), col activa
(16°C). Reacción diferente de genotipos a los
protocolos
• Criopreservación (-196 °C): en investigación.
Exitoso para embriones.

Ejemplo de
Crioconservación:
Banano

Justificación
• El “International Network for the Improvement of
Banana and Plantain” (INIBAP), es responsable por
la colección mundial del germoplasma de Musa.
• La colección cuenta con más de 1100 accesiones,
tanto de especies silvestres, como de variedades
cultivadas.

Justificación
• Actualmente, la colección se mantiene in vitro, en
condiciones de crecimiento lento (baja intensidad
de luz y temperatura baja) con el fin de reducir las
tasas de crecimiento de los cultivos.
• A pesar de estas condiciones, aún es necesario
hacer nuevos cultivos de todas las accesiones una
vez al año con riesgos de contaminación por
bacterias endófitas.
• Asimismo, las accesiones que se mantienen in vitro,
aún bajo condiciones de crecimiento lento, están
expuestas a la variación somaclonal.

Técnica que asegura un
almacenamiento a largo
plazo y a costo reducido de
los recursos genéticos de
especies que tienen semillas
recalcitrantes o se propagan
vegetativamente.
Aplicable a cualquier tipo de
tejido vegetal con potencial
de regeneración y se realiza
a temperatura ultra baja,
como la del nitrógeno
líquido (-196 °C).
Qué es la Crioconservación o Criopreservación?

Antes, los protocolos de crioconservación para tejidos
vegetales involucraban un congelamiento lento en
presencia de mezclas crioprotectoras que contenían
DMSO (sulfóxido de dimetilo), azúcares, glicerol y/o
prolina.
Implicancia:
deshidratación
inducida por la
congelación que
dejaba menos agua
en las células para
que formen
cristales de hielo
durante la
exposición a las
ultra bajas
temperaturas.

• Podemos mencionar dos protocolos:
A) Congelamiento rápido de los cultivos de
meristemas altamente proliferantes
precultivados durante dos semanas en 0,4 M
de sacarosa.
B) La Vitrificación de los cultivos de
meristemas altamente proliferantes
precultivados en sacarosa (el más exitoso).
Crioconservación en Banano

Crioconservación en Banano
• La “Vitrificación” es usada en la actualidad.
• Involucra un tratamiento con soluciones
crioprotectoras seguido por la
deshidratación con soluciones de
vitrificación de alta concentración.
• Las tasas de regeneración después de la
descongelación, dependen del cultivar y del
método utilizado.

AISLAMIENTO,
PURIFICACIÓN Y CULTIVO
DE PROTOPLASTOS

Desinfeccion Inmersion en
agua
Preplasmolisis
Eliminar la
epidermis
Enzimas Pared Celular
Protoplasto
Tratamiento Enzimatico
Protoplastos
Aislados
Proceso de lavado para eliminar desechos
Cultivo en
medio
semisolido
AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTOPLASTOS

Usos
• Estudio del
comportamiento de la
membrana plasmática,
incluyendo el ingreso de
macromoléculas y virus.
• También se usan
ampliamente en la
transformación genética
de bacterias y de células
vegetales.

• Al estar desprovistos de
pared, es más fácil
introducir ADN exógeno en
los protoplastos, que en las
bacterias o células
vegetales íntegras.
• Son ampliamente usados en
Ingeniería Genética de
Bacterias y en el estudio de
la expresión temporal de
genes en plantas.
• Se puede regenerar una
planta completa usando
micropropagación, una
técnica moderna usada en
cultivo de tejidos vegetales.

Usos
• Se usan protoplastos en el mejoramiento
genético vegetal. Para ello se usa una técnica
conocida como fusión de protoplastos, en la que
protoplastos de diferentes plantas se fuerzan a
fusionarse para generar tejidos híbridos. De esta
forma se puede generar:
– Plantas poliploides, fusionando dos plantas de la misma especie,
lo que lleva a una duplicación del número de cromosomas que
poseen respecto a las plantas originales.
– Plantas que posean cromosomas de distintas especies o
variedades en una misma planta, a partir de la fusión de dos
plantas diferentes.

a. El tejido debe ser joven y contener alta proporcion de celulas
meristematicas.
b. El tejido consiste en celulas sin un excesivo engrosamiento secundario
de las paredes celulares.
c. Tejido inicial en dicotiledoneas es proporcionado por hojas jovenes en
expansion los cuales deben ser desinfectadas sin daño a los tejidos.
d. Un “semillero” continuo de tejido fuente ya desinfectado o aseptico
puede ser dado por el subcultivo de meristemas de dicotiledoneas.
e. Es dificil regenerar plantas de tejido foliar de monocotiledoneas.
f. Los embriones inmaduros escindidos de flores fertilizadas produce
callos embriogenicos, que suministra tejido inicial para el aislamiento
de protoplastos.
Fuente de tejido del explante

Medio de cultivo para cultivo de protoplastos
a. El medio usado para el mantenimiento de cultivo de
tejidos de las especies o genotipos que están siendo
estudiados sirve de base para formular la composición de
un medio de cultivo de protoplastos.
b. Los iones amonio son a menudo tóxicos para los
protoplastos los cuales deben ser reducidos u omitidos.
c. La presión osmótica de la solución externa debe ser
ajustada por la adición de azucares no metabolizables y
azucares alcoholes, tales como manitol o sorbitol

Composición de un medio inorgánico usado
para el aislamiento de protoplastos
Concentracion (mg l-1)
27.2
101.0
1480.0
246.0
0.16
0.025
5.8
Constituyentes
KH2PO4
KNO3
CaCl2 2H2O
MgSO4 7H2O
KI
CuSO4 7H2O
pH
Sales CPW

Preplasmolisis y disolución de la pared celular de los
explantes
a. Tejidos como hojas, tallos, o raices deben cortarse en tiritas y
mantenidas 1 hora en una solucion osmotica que contiene una
mezcla de sales inorganicas tales como las sales CPW y 13% w/v
de manitol como un osmoprotector para prevenir que la celula
pierda o gane agua despues de la remocion de la pared celular.
b. Si el tejido inicial proviene de in vitro, se puede hacer un
desagregado de las celulas y luego mantenerlos en el medio
osmotico a 25°C.
c. Los tejidos son luego expuestos a una mezcla de enzimas liticas en
la solucion osmotica. La digestion con diferentes enzimas puede
hacerse de manera secuencial o simultaneamente.

d. El periodo de exposicion depende de la fuente del tejido y de la fuerza
de las enzimas, por ejemplo las hojas cortadas de la mayoria de
especies pueden ser incubadas en 1% celulisina, 0.1% macerozyme
R10 y medio CPW13M at pH 5.6 de un dia para otro en oscuridad.
e. Para los cereales, donde se le ha eliminado la epidermis a las hojas, la
mezcla consiste en 2% celulisina, 0.2% macerozyme R10, 0.5%
hemicelulasa, 1% sulfato de dextran potasio, 11% manitol a pH 5.8
usando un buffer Tris-malato e incubado en la oscuridad por 1-2 h y
para la mayoria de cultivos de tejidos la mezcla de incubacion consiste
en 2% rhozyme HP150, 2% meicelase, 0.03% macerozyme R10 y
medio CPW13M a pH 5.8 e incubado de un dia a otro en oscuridad.
explantes

f. Las celulas son luego separadas de tal mezcla enzimatica por
filtracion a traves de un filtro de tamiz muy fino (tamaño poro 64 mM)
y centrifugando a baja velocidad (100g por 10 min).
g. Los protoplastos son resuspendidos en 5 ml del medio osmotico sin
enzimas y luego se realiza otra centrifugacion.
h. El precipitado es separado de los desechos transfiriendolo con
pipeta a una solucion densa (19-20% sacarosa o 30% Percoll) luego
se repite la centrifugacion pero esta vez los desechos van al fondo y
los protoplastos van a la superficie.
i. La banda flotante formada de protoplastos es posteriomente
transferida cuidadosamente con pipeta y luego cultivada en un
medio MS, 2.0 mgl-1ANA, 0.5 mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol)
explantes

Influencia de la densidad de cultivo de protoplastos en la frequencia de division de
protoplastos y la eficiencia de plaqueo. Los datos son la media de 5 repeticiones
Influencia de la composicion de mezclas enzimaticas en el rendimiento de protoplastos. Los dados
son la media de 6 repeticiones.
Ma et al., 2003, Plant Cell Rep, 22, 320–327
Protoplastos de Sorgo derivados de suspension celular (Secale cereale L.)

Durante la prueba del efecto del la concentracion del 2,4-D la BAP fue mantenida a 1.8uM.
Cuando se probo la respuesta al BAP, la concentracion de 2,4-D fue mantenida a 6.3 uM. El
medio de cultivo fue tambien sumplementado con 1% de sacarosa, 0.5% glucosa y 0.5 M
sorbitol. Los datos se presentan como el numero de celulas que sufren division,
expresados como porcentaje.
El efecto de diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D en la
eficiencia de la eficiencia de plaqueo de los protoplastos de
hoja de C. melo `Green Delica'
Sutiojonos et al., 1998, Annals of Botany, 81, 775-777

Protoplastos purificados
Las hojas son cortadas en finas tiritas y
digeridas en una solucion de enzima y manitol
Purificación de protoplastos de los
desechos en un gradiente de sacarosa.

Cultivo de protoplastos aislados
a. Un medio tipico seria el MS suplementado con 2.0 mgl-1 ANA, 0.5
mgl-1 BAP, 3% sacarosa y 9% manitol.
b. La prueba experimental para establecer los niveles correctos de
auxina y citokinina requeridos para estimular el crecimiento de
protoplastos se basa en un arreglo de Cuadrado Latino.
c. Un metodo para estimular la division celular y la regeneracion (facil
tecnicamente) es el transferir el protoplasto directamente a un medio
liquido o semi-liquido en el cual los niveles de auxina y citokinina se
varien.
d. El agar normal es toxico para los protoplastos, y deben reemplazarse
por agentes gelificantes como agarosa, que solidifican a menor
temperatura.

e. Una suspension de protoplastos en la solución osmótica se mezcla
en un volumen similar de agar al 1.2% a 40oC luego de solidificar
es transferido como capas de 5 mm de diametro a placas petri.
f. Despues de dos semanas los bloques de agarosa que contienen
las colonias tanto en su superficie o incrustados al medio son
transferidos a medio fresco con una concentration de manitol
reducida al 6%.
g. Las colonias son sucesivamente transferidad a medio fresco cada
dos semanas con una reduccion progresiva del 3% de la
concentracion de manitol.
Cultivo de protoplastos aislados

Regeneración de protoplastos
Etapas

Desarrollo de Microcolonias
(a) 1ra division, 10
dias despues del
aislamiento de
protoplastos
(b,c)
microcolonias.
(d,e) microcallos
(f) microcallos
justo antes de ser
transferidos en
medio B5h
c
d
b
e f
a

ihg
Recuperacion de plántulas a traves de
Embriogénesis somática
g: Transferir microcallos en medio B5H e inducir embriogenesis somatica.
h: Transferir los embriones globulares medio Boi2y para la maduracion de embriones
somaticos.
i: Transferir embriones de fase cotiledonar en medio MS para su paso hacia plantulas.

Dovzhenko et al., 2003 , Protoplasma, 222, 107–
111
Regeneración de brotes fértiles de protoplastos de cotiledones de A.
thaliana
(a) Divisiones de protoplastos despues de 4 dias de cultivo (b) Formacion de microcolonias
(flechas) despues de 3 dias mas (c) dentro del area identica: las colonias despues de dos
semanas de cultivo (d) Formacion de brotes Shoot de una colonia 19 dias despues del
aislamiento (e) Regeneracion de los brotes (flechas) despues de 5 semanas (f).
Los Regenerantes formaron raices despues de 7 semanas (g) y semillas despues de 9semans (h)

Cultivo de
Protoplastos y
regeneracion de
plantas verdes y
fertiles de sorgo.

Fuente de Tejido (hojas jovenes, callos
embriogenicos)
Protoplasto A Protoplasto B
Hibridizacion estandar –
Mejoramiento de plantas
Fusion AB
Formacion Callo
Regeneracion
Brotes, Raices, Embriones
Plantas
Fusion
Seleccion
Disolucion de la Pared
Celular
Seleccion
Seleccion
Seleccion
FUSION DE PROTOPLASTOS 1

Obtención de
protoplastos
Cocultivo Inducción
/Fusión
somática
Separación del
Heterocarión
Regeneración de
plantas
1
2 3
45

Protoplastos de dos especies de tabaco son fusionados para producir una célula que
adquiera algunas de las características de ambas parentales, y pueda ser regenerado en
una planta con esas características heredadas.
A

[Miwa et al 1992]

Productos de la Fusion
• Protoplastos parentales: +
Cibrido
NN
Hibrido

Fusion de protoplastos
(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )
a. La funcion de la PEG es el alterar las caaracteristicas de la membrana por
los que los protoplastos que se entran en contacto unos a otros se
adhirieren y los contenidos se mezclan.
b. Unos 4 ml de suspension de los protoplastos aislados de cada parental,
con una densidad celular de aproximadamente 2 x 105 medio CPW con
13% manitol son mezclados y centrifugados a 100g por 10 min y luego
resuspender los protoplastos in aproximadamente 0.5 ml de medio.
c. Las membranas exteriores son desestabilizadas añadiendo 2 ml de una
solucion PEG esteril (30% PEG 6000, 4% sacarosa, 0.01M CaCl2.6H2O) para
que actue por 10 min.

e. Los protoplastos se fusionan diluyendo el PEG cada 5 min añadiendo un
medio de cultivo de protoplastos (medio MS, 2.0 mgl-1 ANA, 0.5 mgl-1 BAP,
3% sacarosa y 9% manitol) con volumenes en incremento (0.5, 1.0, 2.0, 3.0,
4.0 ml por tubo)
f. Los protoplastos se resuspenden despues de cada dilucion por agitacion
suave y la mezcla se centrifuga a 100g (gravedades) por 10 min y luego los
protoplastos son lavados con medio de cultivo sin PEG, centrifugados y
resuspendidos en el mismo medio.
g. La suspension de protoplastos es luego “incrustada” o mezclada en medio
de agarosa, lo cual permite la estimulacion de formacion de pared celular,
division celular y separacion de microcolonias de cloroplastos.
Fusion de protoplastos
(Polyethyleneglycol (PEG) 6000 )

Híbridos somáticos
obtenidos por fusión
de protoplastos entre
Solanum tuberosum L.
subsp. tuberosum y la
especie silvestre
Solanum circaeifolium
Bitter .
Rosa Espejo, Giselle
Cipriani, Genoveva
Rosel, Alí
Golmirzaie and
William Roca

El numero cromosomico de S. tuberosum es 2n=4X=48 y el de S.
circaeifolium es de: 2X=2X=24.
Cual sera el numero de cromosomas del Hibrido somatico = ¿?

a. La suspension de protoplastos que se van a fusionar se colocan
entre dos electrodos
b. Se pasa una corriente continua (AC) debil de A (400,000 Hz, 1.5V) a
traves de los electrodos lo cual causa que los protoplastos adquieran
carga positiva en un polo y carga negativa en el lado opuesto.
c. Como resultado de esta carga, los protoplastos se alinean en grupos
a lo largo de la linea de la corriente, tocandose uno con otro y
formando una cadena de perlas.
d. Las unidades que forman cada cadena pueden estar modificados
segun la densidad celular de protoplastos, la frecuencia del campo
AC y del voltaje pico-a- pico.
Electrofusion

e. Después de un periodo de aproximadamente 90s, el campo
AC es reemplazado por una descarga de 1000 V cm-1 unica
de pulso en un solo instante.
f. Donde los protoplastos estan en contacto, las membranas
plasmaticas se rompen y se fusionan formando una
membrana continua alrededor de la cadena de perlas.
g. Este evento es luego seguida de la fusion citoplasmatica.
Electrofusion

Esquema de la electrofusion
• Se realiza usando una corriente electrica.
• Se causa un menor daño que los metodos quimicos.
1. Camara de fusion
Generador sinusoidal
Generador de pulso DC
Electrodos
2. Corriente AC de bajo voltaje
altamente oscilante
3. Pulso DC de alto voltaje
4. Rotura de membranas y fusion

1) Alineamiento:
Las celulas son
alineadas en
cercano contacto
por medio de
dielectroforesis.
2) Pulso fusion :
Un pulso de solo 15
microsegundos se
aplica con el fin de
permeabilizar las
membranas. Luego
estas se fusionan.
3) Fase de
Heterocarionte :
Las membranas
celulares se fusionan
completamente y los
citoplasmas se ha
unido. Solo los
nucleos quedan
separados.
4) Producto de
Fusion completa:
Cuando los
nucleos se
fusionan, los
cromosomas se
van perdiendo y
se reduce su
numero.
Etapas de la electrofusion

Fases de Fusion de protoplasts de Avena sativa

Seleccion de heterocariontes
a. La técnica mas simple es permitir que los protoplastos regeneren y
luego identificar el heterocarionte en el estadio de plántula joven o
inmadura por diferencias morfológicas (la eficiencia es buena).
b. Una técnica directa pero laboriosa es cuando los heterocariontes
son identificados visualmente luego removidos manualmente
usando un microscopio o un micromanipulador (la eficiencia no es
buena si no se visualiza la fusión de protoplastos parentales con
marcadores fácilmente visibles)
c. El método mas popular pero mas costoso es el uso de un citómetro
de flujo automatizado.
d. Utilizando una característica diferencial de uno de los parentales,
por ejemplo, la nula regeneración de los protoplastos individuales.

Citómetro de Flujo
Las células son transportadas a través
de un flujo del delgadísimo ancho de
una célula.
Esta columna de fluido es
interceptada por un rayo laser que
enfoca su haz a unas pocas células
después de la salida de la columna de
células.
Cada célula que atraviesa el rayo laser
emite una luz dispersa en todas
direcciones.
La luz dispersa, medida a 90º de
incidencia corresponde a la cantidad y
la calidad de luz difractiva de
estructuras granulares al interior de la
célula.
http://flowcytometry.uchc.edu/CYTO
METERSWORK/cytometerswork.html

Analisis de un
Citometro de Flujo
del contenido de
ADN en el nucleo.
(Secale cereale L. cv.
Auvinen)
a. Control externo
de celulas rojas
sanguineas de
pollo (CRBC,
2C=2.33 pg DNA)
b. Planta (2C=6.47
pg DNA)
c. Diploide normal
(2C=6.51 pg DNA)
d. Cromosomas del
regenerante
(2n=14)

Fusion de células de Citrus sp.
Células en
suspension
de Citrus x
sinensis var.
Hamlin
Protoplastos
blancos
Naranjo espinoso
Poncirus trifoliata
protoplastos
verdes
Los protoplastos de
Citrus Hamlin no
regeneran y actuan
como una capa de
propagacion
Los protoplastos
del naranjo
espinoso no
forman pared
celular ni se
dividen
Solo los productos de la fusion se
regeneraran

Contribución de la fusión de protoplastos
al mejoramiento de Cultivos
a. Originalmente la hibridizacion celular fue considerada
como un medio para la unión de dos diferentes
genotipos que eran incapaces de hibridizar por medio
sexual normal.
b. La producción de la semilla hibrida tiene el potencial
de la induccion de la esterilidad citoplasmatica
masculina.
c. Transformación.

Fig. 2A–M Flower morphology of parental plants
used for somatic hybridization and their somatic
hybrids. A Oriental hybrid lily (Lilium L.) cv.
Acapulco. B Lilium·formolongi cv. Hakucho. C
Oriental hybrid lily cv. Shirotae. D, E Flowering
regenerants derived from somatic hybrids in the
fusion combinations of Acapulco+Hakucho (D)
and Shirotae+Hakucho (E). F–L Morphological
features of flower organs of the intact parents
and regenerants. Regenerants from
Acapulco+Hakucho (G) and Shirotae+Hakucho (I)
showed anther colours different from those of
their parents, Acapulco (F), Hakucho (H) and
Shirotae (J). The regenerant from
Shirotae+Hakucho (E) also showed a shorter
prominence at the top of petals (K) compared to
that of its parent, Shirotae (L). M Propagated
plants obtained by in vitro culture derived from
a somatic hybrid plant of Acapulco+Hakucho
Production of fertile somatic hybrid plants between Oriental hybrid lily
and Lilium formolongi
Mitsugu Horita Æ Hitomi Morohashi Æ Fuminori Komai .Planta (2003) 217: 597–601

Visualisacion de la expresion transitoria en protoplastos transformados con GFP
(Green Fluorescent Protein
Expresion estable de GFP en hojas de plantas transgenicas obtenidas despues de
una transformacion de protoplastos y regeneracion de la planta completa.

- Insecticidas
- Saborizantes
- Colorantes
Las plantas
como fuente
de metabolitos
secundarios de
interés comercial
Potencial
 75 % de las nuevas estructuras químicas
descubiertas provienen de las plantas.
 Sólo se tiene buen conocimiento de 5 000 de las
250 000 a 300 000 especies vegetales que se
creen existentes en el planeta.
 25 % de los medicamentos de las industrias
farmacéuticas son de origen vegetal.
 75 % de la población mundial utiliza la medicina
tradicional que consiste principalmente en el
uso de extractos provenientes de plantas.
- Medicinas
- Herbicidas
- Proteasas
- Fragancias
- Antimicrobianos
- Enzimas

Producción
de metabolitos
secundarios
por cultivo
in vitro
de células
y órganos
vegetales:
¿por qué?
- Independizarse de factores externos tales
como: cambios de temperatura, sequías, plagas,
variabilidad de la producción, factores políticos
y sociales, etc.
- Evitar la extinción de especies vegetales.
- Disponer de condiciones controladas en el
proceso de producción y extracción.
- Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos
mas cortos.
- Hacer viable la producción de compuestos
complejos con uno o más C quirales en forma
más económica respecto de la síntesis química.
- Posibilitar la obtención de nuevos compuestos
no presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformación sólo
realizables por enzimas provenientes de
plantas.

Estructura del
Limoneno (A) y el
Mentol.
Son los
monoterpenos
mas conocidos
que sirven como
defensa ante
insectos y otros
organismos que
se alimentan de
estas plantas
Fuentes Naturales

Fuentes Naturales
Vincristina y Vinblastina,
alcaloides antitumorales extraidos de las
hojas de Catharanthus roseus “Isabelita”
COOCH3
CH3
H
OH
N
N
N
OCOCH3
R
H3CO
H COOCH3
CH3
OH
N

Taxol, extracto anti
tumoral, de la Corteza de
Taxus brevifolia
O
C
H
CH3- C - O
O - C -CH3
O
O
O
O
OH
OH
OH
O O
O
CH3
3HC
C - NH - CH - CH - C - O
Fuentes Naturales

Los metabolitos secundarios
• Los metabolitos secundarios están siempre
presentes en las plantas y pueden tener un relación
estructural y evolutiva con los metabolitos
primarios.
• Usualmente ocurren en diferentes rutas
bioquímicas y procesos al mismo tiempo.
• El costo para producir un metabolito secundario es
alto y consume energía que podría utilizarse para el
crecimiento y la reproducción.

HIPOTESIS: los metabolitos secundarios evolucionaron de
una derivación de una ruta biosintetica básica
Molecula
Precursora
Triptofano
Amino acido,
Un compuesto primario
Enzima A
B
C
E
F
D
DIMBOA
pesticida,
metabolito secundario
2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-
benzoxazin-3-one

N
H
Molecula
Precursora
TSA
TSB
N
H
CO2H
NH2N
H
Triptofano
BX1
BX2
BX3
BX4
BX5
N
H
O
N
H
OH
OH
O
N
H
OH
O
O OH
ON
OH
O OH
ON
OH
CH3O
DIMBOA
Comparación entre la síntesis de triptófano y DIMBOA

• Los metabolitos secundarios en los vegetales son
economicamente importantes, en los diferentes
campos, en aplicaciones como los farmacos,
fragancias, pigmentos, aditivos alimenticios y
pesticidas.
• Una alternativa para su extraccion de las plantas,
es su sintesis a partir de cultivos in vitro.

Cultivos en suspensión
células, tejidos u órganos

Material de partida
• Cultivos en suspensión:
derivan de células
indiferenciadas o callos,
en medio líquido de
composición adecuada,
crecimiento más rápido y
homogéneo.
• Hair root culture (cultivo
de raices pilosas): son
tejidos infectados por
Agrobacterium
rhizogenes.

Callos
• Tejidos no diferenciados en división activa.
• Se pueden desarrollar a partir de heridas.

Microscopio Invertido
Seguimiento del cultivo: viabilidad,
multiplicación, contaminación.
Control sobre cambios morfológicos
(efectos de hormonas, de tratamientos
con medicamentos, de iones,
interacciones, etc.

Aplicaciones de las
suspensiones Celulares
• Estudios sobre el ciclo celular.
• Estudios fisiológicos y bioquímicos.
• Producción de metabolitos secundarios.
• Aislamiento de Mutantes.
• Embriogénesis Somática.

Embriogénesis somática y
micropropagación

Introducción a suspensión
+
Plaqueo
Filtrar las células
1 2
Elección de
los mas
altos
productores
Alta densidad
inicial
Subcultivo y
filtrado

Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacéuticos
Pigmentos
Fragancias
Saborizantes
Depigmentadores
Producto
Shikonina
Berberina
Sanguinarina
Gingsenósidos
Taxol
Cartamina
Geraniol
Citronerol
Vanillina
Arbutina
Compañía
Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.
Nitto Denko Co.
Phyton USA
Kibun Kyoto University
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Kanedo Co.

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