Este documento describe un protocolo experimental para evaluar variables cinéticas en una fermentación alcohólica utilizando Saccharomyces cerevisiae. El procedimiento incluye la activación de la levadura, preparación del sustrato, fermentación y destilación. Se monitorearán variables como crecimiento celular, grados Brix, pH y temperatura durante 45 horas para determinar la cinética de la fermentación.

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Biotecnología Nancy M Córdoba-Castro, M.Sc. 2014
INGENIERIA DE PROCESOS
Docente: Nancy M Córdoba-Castro, M.Sc.
Practica No 1.
EVALUACION DE VARIABLES DE LA CINETICA EN UNA FERMENTACION
ALCOHOLICA
Introducción.
La fermentación alcohólica es uno de los proceso biológicos más antiguos y estudiados desde
ramas de la ciencia como la microbiológica, bioquímica y biotecnología. La reacción
bioquímica se expresa de la siguiente forma siguiendo la ruta metabólica propuesta por
Embden-Meyerhoff.
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Calor (energía)
Hexosa Bioetanol
Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un
recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados
sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en
metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el
transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman
productos nuevos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos
fenómenos crecimiento y formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del
proceso simultáneamente o no según sea el caso.
Materiales.
 Erlenmeyer 1000 ml
 Erlenmeyer de 500 ml
 Asas
 Pipetas de 10 ml
 Cajas Petri
 Agar saboraud
 Levadura
Procedimiento
Etapa I: Activación de la levadura y pre-inoculo de fermentación

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Activación de Saccharomyces cerevisiae
 Tomar una alícuota de levadura inocular en caldo saboraud
 Incubar por 24 h a 30ºC
Pre-inoculo
 Se toma una alícuota del jugo pasterizado.
 Ajustar el jugo a los º Brix experimentales
 Agregar levadura Saccharomyces cerevisiae previamente activada
 Agitar en zaranda por 8 horas a 110 rpm
 Medir concentración celular hasta alcanzar 108
Cel/ml.
Etapa II: Preparación del sustrato de fermentación
Pasteurización
 Calentar 80ºC durante 10 minutos y disminuir inmediatamente la temperatura a 5
ºC en un baño de hielo.
Etapa III: Fermentación del sustrato de fermentación para la obtención de bioetanol
 Se calienta el jugo hidrolizado y pasterizado a 30ºC.
 Ajustar pH a 5
 Agregar el inoculo preparado anteriormente, 10% del volumen total a fermentar.
 Tomar muestra inicial para empezar el monitoreo de la concentración celular durante
la fermentación. El monitoreo se realiza cada 2 horas durante 8 horas, cada 4 horas las
siguientes 8 horas y cada 6 hora las últimas 24 horas.
Etapa IV: Destilación
 En el equipo de destilación
 Calentar el jugo a 83ºC para someterlo a destilación.
Mediciones
 Se tomaran las mediciones de acuerdo a lo estipulado en el procedimiento para el
inoculo y la fermentación de:
 Crecimiento microbiano en agar ( recuento celular)
 Medición de grados Brix
 Recuento en cámara de Neubauer

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DIAGRAMA METODOLOGICO
Se realizaran 6 montajes experimentales a 3 escalas de laboratorio para evaluar la
cinética de la fermentación, donde se monitorearan las variables de crecimiento,
reducción de grados Brix, pH y temperatura.
1. Procedimiento a 8 grados Brix, escala de 500 ml y 1000 ml
Vol: 450 ml medio 50 ml pre inóculo Vol: 900 ml medio 100 ml pre inóculo
2. Procedimiento a 12 grados Brix, escala de 500 ml y 2000 ml
Vol: 450 ml medio 50 ml pre inoculó Vol: 1800 ml medio 200 ml pre inóculo
3. Procedimiento a 16 grados Brix, escala de 500 ml y 1000 ml
Vol: 450 ml medio 50 ml pre inóculo Vol: 900 ml medio 100 ml pre inóculo

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VARIABLES A MONITOREAR EN 45 horas
En la siguiente tabla se estableces las horas en la que se realizara el monitoreo o
seguimiento de la fermentación
Hora Jueves Viernes Sábado
8:00 am Recuento 1 (17h) Recuento 6 (41h)
10:00 am Recuento 2 (19h) Recuento 7 (43h)
12:00 pm Recuento 3 (21h) Recuento 8 (45h)
2:00 pm Recuento 4 (23h)
3:00 pm Recuento inicial (0h) No se realiza
4:00 pm Recuento 5 (25h)
EN CADA HORA DE MONITOREO SE DEBERÁ REALIZAR EL SIGUIENTE
PROCEDIMIENTO.
1. Recuento inicial hora 0
 Tomar una muestra de 3 ml con la jeringa estéril, antes de la toma asegurarse que
la fermentación esta homogénea.
 Medir pH (debe mantenerse en 4.0 y 5.0)
 Medir grados Brix (deben disminuir)
 Recuento en cámara de neubauer
 Siembra en agar saboraud ( 1 ml o 1000 µL), extender bien la muestra con el
rastrillo o asa
2. Recuento 1 hora 17
 Tomar una muestra de 3 ml con la jeringa estéril, antes de la toma asegurarse que
la fermentación esta homogénea.
 Medir pH (debe mantenerse en 4.0 y 5.0)
PROCEDIMIENTO
De la Fermentación
Tomar muestra de 3 ml
Realizar pruebas, sembrar
y llevar a incubar a 35°C

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 Medir grados Brix (deben disminuir)
 Recuento en cámara de neubauer
 Siembra en agar saboraud ( 1 ml o 1000 µL), extender bien la muestra con el
rastrillo o asa
NOTA: es importante tener en cuenta que antes de sembrar en el medio de cultivo deben
realizar el recuento en cámara. Si el recuento es alto deben hacer dilución.
PROCEDIMIETNO DE DILUCIONES:
Cada grupo tiene 3 erlenmeyer con agua destilada estéril, con cuidado de no contaminar
al momento de realizar la dilución deben preparar:
1. Llenar los tubos eppendorf con 900 µL de agua destilada estéril con micropipeta
2. Tomar una muestra de la fermentación de la jeringa de 100 µL
3. Mezclarla vigorosamente con el agua del tubo eppendorf (a este momento tendrán una
dilución de 10-1, repetir el proceso para realizar el número de diluciones necesarios)
PROCEDIMIENTO
De la Fermentación
Tomar muestra de 3 ml
900 µL de agua destilada
estéril con micropipeta
Mezclarla
vigorosamente con el agua
del tubo eppendorf
Realizar pruebas, sembrar y
llevar a incubar a 35°C

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FUENTE:https://www.google.com.co/search?q=erlenmeyer&hl=es&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ei=l99BUovGGYT89gSu1ICIBQ&sqi=2&ved=0CD8QsAQ&biw=1280&bih
=923&dpr=1#hl=es&q=diluciones&tbm=isch&facrc=_&imgdii=_&imgrc=8xNynkBFnKpcYM%3A%3BtwopZMigiHV8M%3Bhttp%253A%252F%252Fdc118.4shared.com%252Fdoc%252FIMvm
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INFORME DE LABORATORIO
 El informe se entregara tipo articulo con: Titulo, autores, introducción,
metodología, resultados y discusiones (comparando los resultados con
reportados por otros autores), conclusiones.
 Los resultados serán analizados mediante graficas de las horas monitoreadas Vs el
crecimiento de la levadura, se deben calcular: el tiempo de generación y la constante de
velocidad de crecimiento.
 Así mismo se realizaran para los grados ºBrix y el recuento de células viables
 En la destilación del alcohol producido se debe cuantificar el rendimiento y determinar
su concentración
Bibliografía
- Matiz Adriana, Quevedo Balquis, Pesrosa Aura Marina. Manual de Procesos Biotecnologicos.
Bogota Javered.
- Mubeccel Ergun *, S. Ferda Mutlu. Application of a statistical technique to the production of
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73 (2000) P 251-255
- Muenduen Phisalaphong ∗, Nuttapan Srirattana, Wiwut Tanthapanichakoon. Mathematical
modeling to investigate temperature effect on kinetic parameters of ethanol fermentation.
Biochemical Engineering Journal 28 (2006) 36–43
- Ronghou Liu , Fei Shen. Impacts of main factors on bioethanol fermentation from stalk juice
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