Clase 02 Ácidos Nucleicos como Agentes Terapéuticos

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc
ÁCIDOS NUCLEICOS
COMO AGENTES
TERAPÉUTICOS
Fernando Salcedo
Biólogo, M.Sc.
e-mail: fsalcedo@unilibrebaq.edu.co

Conceptos Previos
CÉLULA
MACROMOLECULA
NUCLEO

Biología Molecular:
Es la disciplina científica
que tiene como objetivo
e l e s t u d i o d e l o s
p r o c e s o s q u e s e
desarrollan en los seres
vivos desde un punto de
vista molecular.
En el Proyecto Genoma
Humano se le definió
como: El estudio de la
estructura, función y
composición de las
m o l é c u l a s
b i o l ó g i c a m e n t e
importantes .
Terapia Genética:
Es un área de la medicina
genómica que utiliza los
conocimientos, técnicas y
tecnología de que dispone la
biología molecular, para
introducir de manera dirigida
copias sanas de genes
defectuosos en células
especificas del organismo y
modificar el curso de la
enfermedad.
Para lograr esto se hace uso
de otras moléculas llamadas
portadoras y que son
usualmente procedentes de
virus.

Como trabaja la terapia genética:
Insertar ADN complementario: Una cadena sencilla de
ADN que se sintetiza a partir de una hebra simple de ARNm
maduro y se utiliza para la clonación de genes propios de
células eucariotas en células procariotas.
Mutación Selectiva Inversa: La mutación inversa es un
proceso que permite revertir un gen mutado a su forma no
mutada, mutación selectiva inversa se refiere a la
realización de este proceso por medios artificiales.
Recombinación Homologa: Es un proceso por el cual las
secuencias de nucleótidos son intercambiadas entre dos
cadenas similares o idénticas de ADN.
Inhibición de genes: Consiste en el encendido o apagado
de la expresión de un gen.

ENFERMEDADES GENÉTICAS
• ► Enfermedades debidas a alteraciones de la dotación de
genes
- Genoma nuclear: cromosómico
Dotación normal de cromosomas nucleares: 22 x 2
autosómicos + 2 sexuales (XX o XY).
Contienen ~ 20.000 - 25.000 genes funcionales.
- Genoma mitocondrial: DNA circular
Existen 8-10 copias por mitocondria y cientos de mitocondria
por célula (~ 5000 copias en total).
Contiene 37 genes: 13 proteicos, 22 ARNt y 2 ARNr
(mitocondriales).

ENFERMEDADES GENÉTICAS
► Clasificación según el número de genes alterados y
origen del gen
Nucleares:
- Enfermedades cromosómicas: afectan a múltiples genes.
- - Enfermedades monogénicas (~ 8.000 descritas): un
único gen alterado.
- Enfermedades poligénicas: varios genes.
Mitocondriales:
Uno o varios genes alterados.

TERAPIA GÉNICA
► Transferencia de ácidos nucleicos (DNA o RNA) a la
célula con finalidad terapéutica:
■ Incrementar la expresión de un gen endógeno con efecto
terapéutico.
■ Restaurar la expresión de un gen funcional cuando el
gen endógeno es disfuncional.
■ Inhibir la expresión de un gen endógeno con efectos
patológicos.

TERAPIA GÉNICA
► Se fundamenta en el conocimiento de la enfermedad a
nivel celular y molecular:
■ Identificación de las células/tejido de funcionamiento
anómalo: Patología Celular
■ Identificación de los genes/proteínas celulares
responsables: Genética/Patología Molecular

PATOLOGÍA MOLECULAR

ENFERMEDADES BLANCO
• Enfermedades y tipos de genes ensayados en ensayos
clínicos en humanos.

• ► Individuo Receptor:
• Adultos: experimental y aplicado en clínica humana
• Células madre pluripotenciales in vitro: experimental
• Embrión intrauterino: experimental en modelos
animales.
• Se distingue entre la terapia génica somática
(transferencia de DNA a tejidos normales) y terapia
génica de la línea germinal (transferencia de DNA a
células que producen ovocitos o esperma), ya que la
primera se restringe al paciente tratado y no se
transmite a la descendencia.

TIPOS DE INTERVENCION EN TERAPIA GÉNICA
• 1) Transferencia de secuencias de DNA codificantes
• FÁRMACO
DNA de doble cadena que contiene una unidad transcripcional de un RNA con sentido o codificante.
• APLICABILIDAD
• Puede reemplazar la inyección de proteínas extracelulares (ej. Insulina).
• Aplicación inédita para la producción de proteínas intracelulares (ej. Deficiencias monogénicas).
• Puede reemplazar la modulación de la actividad de proteínas endógenas con otros fármacos.

• 2) Transferencia de secuencias inhibidoras de la expresión.
FÁRMACO: secuencias de DNA/RNA complementarias a un mRNA endógeno que dirigen su
destrucción o impiden su traducción.
■DNA de doble cadena con unidad transcripcional de un RNA
■DNA de cadena sencilla: oligonucleótido antisentido.
■RNA de doble cadena (pequeño RNA de interferencia siRNA)
APLICABILIDAD
Alternativa a la inhibición con otros fármacos de proteínas endógenas.

3) Transferencia de secuencias de ácidos nucleicos (aptámeros) que
interaccionan con una proteína.
FARMACO
DNA/RNA de cadena simple o doble que interacciona con una proteína y altera su
funcionalidad.
APLICABILIDAD
Alternativa a otros tipos de fármacos.

1) mRNA codificante, antisentido o ribozima

mRNA codificante

Oligonucleótido

RNAs de interferencia (siRNA y shRNA)

iRNA Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

EL USO DE VECTORES
Un vec tor es
generalmente un
virus que ha sido
a l t e r a d o
genéticamente
con el propósito
d e q u e s e a
inofensivo al
organismo pero
se aprovecha su
habilidad para
generar copias
de ADN.

Retrovirus
Son virus con envoltura que
presentan un genoma de ARN
mono catenario de cara y se
replican de manera inusual a
través de una forma intermedia
de ADN bicatenario. Este
proceso se lleva a cabo mediante
una enzima: la retrotranscriptasa
o transcriptasa inversa, que
dirige la síntesis de ADN a través
de ARN y posee una importancia
extraordinaria en la manipulación
genética. Una vez se ha pasado
de ARN mono catenario a ADN
se inserta dentro del ADN propio
de la célula infectada donde se
comporta como un gen más .

Son una familia de virus que
infectan tanto humanos como
animales. Los adenovirus
f u e r o n a i s l a d o s e n l a s
adenoides (amígdalas) de los
humanos, de donde deriva el
nombre.
La Capacidad para infectar las
c é l u l a s e n d i v i s i ó n o
quiescentes, los hace útiles en
la terapia genética ya que
podrían integrar el gen en
diversas zonas del organismo.
El problema principal es la alta
inmunogenicidad, y que su
expresión sólo se realiza a
corto plazo.
Los Adenovirus

VIRUS ADENO ASOCIADO
Se encuentran en combinación con otros virus. Sin
embargo, por sí mismo son inofensivos.
Ventajas en Terapia Genética:
1. No estimulan la inflamación en la célula huésped;
2. Pueden entrar en células que no estén en división.
3. Se integran en un único sitio del genoma, en el
cromosoma 19 en humanos.
4. No causa enfermedades en humanos y no es
inmunogénico.
Limitaciones:
1. son difíciles de desarrollar en grandes cantidades,
2. son difíciles de manipular y
3. Necesitan otros virus durante la confección.

Casos clínicos
en los que se ha
utilizado terapia
genética
Un ejemplo es la denominada inmunodeficiencia combinada
severa o <<enfermedad de los niños burbuja>>, que
ocasiona la muerte a los afectados, (pues estos niños no
disponen de un sistema inmune sano). Con terapia somática
ex vivo se han logrado salvar nueve de cada diez niños
tratados, aunque dos de ellos desarrollaron leucemia que,
afortunadamente, en niños suele ser tratable.

Fibrosis y cirrosis hepática
Vía
Estructura
Posición
ATRACTIVOS DEL
HÍGADO PARA LA
TERAPIA GÉNICA

Base biológica
legítima
Objetivo
Terapéutico
para la
Fibrosis
Hepática
Agente
terapéutico debe
permanecer en el
micromedio del
tejido blanco por
largo tiempo.
Producir pocos
efectos extra
hepáticos
Concentracio
nes altas del
compuesto
activo en el
hígado.

Transferencia de
genes entre
hígados normales
y enfermos.
PROCEDIMIENTOS
EN EL ÓRGANO
BLANCO
Inyección
directa de DNA
plasmídicos
desnudos
unidos con
diferentes
ligandos.
Inyectando
vectores virales
recombinantes
complejos que se
liberan en los
lóbulos hepáticos.

Casos clínicos en los que se ha utilizado terapia genética
Fibrosis y Cirrosis Hepática
. El gen de la telomerasa inhibe y protege en contra de la
fibrosis hepática inducida por CCL4 en ratones.
. La transferencia de la sintasa del óxido nítrico neuronal en
ratas cirroticas mejora la hipertención portal.
. La inibición del NF- kB mediante el envió de su represor el
IkB reduce la lesión temprana en ratas inducidas por alcohol.
. Vectores adenovirales pueden ser transducidos en
hepatocitos de hígado cirroticos y se demostró que estos no
se alojan en otros órganos , a pesar de ser introducidos por
vía general ( vena iliaca de la rata).

Fibrosis y Cirrosis Hepática
Se puede revertir la cirrosis hepática?
Los estudios en vivo se llevaron a cabo en el modelo de CCL4 y el de
ligadura de conducto biliar.
Se probó:
La eficacia de transducción con 3x1011 partículas víricas/kg del vector
adenoviral portando el gen de la metaloproteasa de matriz 8 (MMP8). El
razonamiento de utilizar MMP8 fue el de la promoción de la degradación
in situ de las proteínas de la matriz extracelular, liberando e factor de
crecimiento hepático (HGF) y dejando espacio libre para la proliferación de
células hepáticas.
Resultados:
Modelo: Ligadura biliar , disminución de la fibrosis de 45%.
Modelo: CCL4, disminución 56%.
Otro gen terapéutico fue el plasminógeno urocinasa humano (HUPA); con
este gen se logró una reducción de 85% de la fibrosis hepática al día 10
posterior a la inyección del adenovirus.

Terapia antisentido
Se trata de otra estrategia metodológica, en donde las
enfermedades caracterizadas por una proteína anormal
o la producción en exceso de una proteína anormal
pueden potencialmente tratarse mediante un bloqueo
selectivo del gen o los genes que causan esta
enfermedad. Cuando un gen se expresa, la secuencia
de bases de DNA se transcribe a una sola cadena de
RNA y luego se traduce a una proteína. La idea principal
de la terapia antisentido es evitar la expresión del gen
RNA de la proteína; esto es interrumpir el flujo de la
información genética usando oligonucleótidos que tienen
como blanco secuencias específicas de RNAm.

TERAPIA GENETICA LA MEDICINA DEL SIGLO XXI
2002 y anteriores
La terapia génica apareció a partir de los años 70 y se
dieron las primeras pruebas con virus, las cuales
fracasaron. En 1990, se utiliza células de médula ósea
tratadas con un vector retroviral que porta una copia
correcta del gen que codifica para la enzima adenosina
desaminasa, la cual se encuentra mutada, es una
enfermedad que forma parte del grupo de las
inmunodeficiencias severas combinadas (SCID). Cinco
años más tarde, publicaron los resultados de la terapia,
que contribuyó a que la comunidad científica y la
sociedad consideraran las posibilidades de ésta técnica.
No obstante, el apoyo a la terapia fue cuestionado
cuando algunos niños tratados para SCID desarrollaron
leucemia. Las pruebas clínicas se interrumpieron
temporalmente en el 2002, a causa del impacto que
supuso el caso de Jesse Gelsinger, la primera persona
reconocida públicamente como fallecida a causa de la
terapia génica.

2003
Un equipo de investigadores de la
universidad de California, en Los
Ángeles, insertó genes en un cerebro
utilizando liposomas recubiertos de un
polímero llamado polietilen glicol
(PEG). La transferencia de genes en
este órgano es un logro significativo
porque los vectores virales son
demasiado grandes para cruzar la
“barrera hematoencefálica”. Este
método tiene el potencial para el
tratamiento de la enfermedad del
Parkinson.
También la interferencia por ARN se
planteó en éste año para tratar la
enfermedad de Huntington.

2006
Científicos tratan exitosamente un melanoma
metastásico en dos pacientes, utilizando células T
para atacar a las células cancerosas.
En Marzo del 2006, un grupo internacional de
científicos anunció el uso exitoso de la terapia
génica para el tratamiento de dos pacientes adultos
contagiados por una enfermedad que afecta a las
células mieloides.
En Mayo del 2006, un equipo de científicos
informaron del desarrollo de una forma de prevenir
que el sistema inmune pueda rechazar la entrada
de genes.
En Noviembre del mismo año, se informó sobre
VRX496, una inmunoterapia para el tratamiento del
HIV que utiliza un vector lentiviral para transportar
un DNA antisentido contra la envuelta del HIV. Fue
la primera terapia con un vector lentiviral aprobada
por la FDA para ensayos clínicos. Los datos de la
fase I/II ya están disponibles.

TERAPIA GENETICA LA MEDICINA DEL SIGLO XXI Edgar Fernando Salcedo, M.Sc
2007
El 1 de mayo del 2007 anunciaron el primer ensayo de
terapia génica para la enfermedad hereditaria de retina.
La Amaurosis congénita de Leber es una enfermedad
hereditaria que causa la ceguera por mutaciones en el
gen RPE65. Se investigó la transfección su retiniana por
el virus recombinante adeno-asociado llevando el gen
RPE65, y se encontraron resultados positivos. Los
pacientes mostraron cierto incremento de la visión, y no
se presentaron efectos secundarios aparentes. Los
ensayos clínicos de esta terapia se encuentran en fase I.

TERAPIA GENETICA LA MEDICINA DEL SIGLO XXI Edgar Fernando Salcedo, M.Sc
2008
Investigadores de la Universidad de Míchigan en Ann
Arbor (Estados Unidos) desarrollaron una terapia
genética que ralentiza y recupera las encías ante el
avance de la enfermedad periodontal, la principal causa
de pérdida de dientes en adultos. Investigadores
descubrieron una forma de ayudar a ciertas células
utilizando un virus inactivado para producir más cantidad
de una proteína denominada receptor TNF. Este factor se
encuentra en bajas cantidades en los pacientes con
periodontitis. La proteína administrada permite disminuir
los niveles excesivos de TNF, un compuesto que
empeora la destrucción ósea inflamatoria en pacientes
que sufren de artritis, deterioro articular y periodontitis.
Los resultados del trabajo mostraron que entre el 60 y el
80 por ciento de los tejidos periodontales se libraban de
la destrucción al utilizar la terapia génica.

2009
En Septiembre de 2009, se publicó en Nature
que unos investigadores de la Universidad de
Washington y la Universidad de Florida fueron
capaces de proporcionar visión tricromática a
monos ardilla usando terapia génica.
En noviembre de ese mismo año, la revista
Science publicó resultados alentadores sobre el
uso de terapia génica en una enfermedad muy
grave del cerebro, la adrenoleucodistrofia,
usando un vector retroviral para el tratamiento.

2010
Se anuncian resultados exitosos en el tratamiento de
pacientes de VIH con el uso de terapia genética, Sin
embargo, los científicos admitieron que todavía existen
obstáculos y que el próximo paso será asegurar que las
células sanguíneas que reciban los genes de protección
contra el sida no sean destruidas por el sistema
inmunológico del paciente.
2011
En la actualidad se trabaja en la elaboración de nuevas
estrategias genéticas contra el VIH que implican el uso
del propio virus como vector, a un se esta a la espera de
anuncios oficiales de los resultados.

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