La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) permite la separación rápida de mezclas complejas en minutos. Se puede utilizar para separar sustancias termolábiles con un peso molecular entre 54 y 450.000. El instrumento HPLC consta de una bomba de alta presión, un inyector automático, una columna cromatográfica, un termostato y detectores. Se utiliza principalmente para analizar compuestos hidrosolubles como vitaminas, alcaloides, colorantes y metabolitos de drogas.

1. Dr. DANTE FLORES

2. HPLC
 HIGH –PRESSURE LIQUID-SOLID
CHROMATOGRAPHY
 CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
DE ALTA RESOLUCION
 CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
DE ALTA EFICACIA

3. VENTAJAS
 El proceso cromatográfico es rápido
pudiéndose resolver mezclas muy
complejas en minutos.
 Permite la separación de sustancias
termolábiles.
 Se puede lograr resolución de sustancias
con peso molecular de 54 a 450.000

4. Diagrama de los componentes
del HPLC

7. Instrumentación
 Reservorio de solventes
 Desgasificador
 Bomba
 Inyectorautomático
 Termostato de columna
 Detectores

8. Instrumentación

9. BOMBAS
Los instrumentos de HPLC deben tener un sistema que
suministre la presión adecuada, para que se alcance un
caudal suficiente a su salida.
•Bombas reciprocas
•Bombas de jeringas o
desplazamiento
•Bombas neumáticas o de presión
constante

10. Requisitos para un sistema de bombeo
•Generación de presión por encima de 6000 psi
•Flujo libre de pulsaciones
•Intervalo de caudal de 0.1 ml a 10 ml
•Componentes resistentes a la corrosión

11. Funciones de la bomba
 LA BOMBA TIENE TRES FUNCIONES
BASICAS
 Proveer al sistema un flujo exacto y constante
 Proveer una fase móvil de composición exacta
 Proveer la fuerza necesaria para impulsar la
fase móvil a través de la columna

14. Gradiente:
Isocrático

15. Gradiente de caudal:
Es la variación del caudal
durante el proceso
cromatográfico.
Muestras de características
hidrosolubles
VITAMINAS

16. INYECTORES Volumen de
muestra de 5 a
Actualmente se disponen de inyectores
500 ul.
automáticos.
7000 psi
Los manuales son:
* Sistema de bucle
* Resistencia hidrodinámico

17. Jeringas Hamilton

18. COLUMNAS PARA HPLC
 Se construyen de acero inoxidable.
 Presentan una longitud de 10 y 30 cm. El
mas frecuente es de 25 cm.
 El diámetro es 4 a 10 mm.
 El tamaño de la partícula de la fase
estacionaria es de 3.5 y 10um

20. Precolumna
 Aumenta la vida de la columna analítica
 Satura la fase móvil con la fase
estacionaria.
 La composición de la fase estacionaria
debe ser semejante a la columna analítica
 El tamaño de partícula es mayor

21. Precolumna

22. Clasificación de la columna
según su relleno
 En función de su consistencia
 Según la porosidad de las partículas
 En función de la forma de la partícula
 En función del diámetro medio de la
partícula.

23. Partículas del soporte fijo tomadas
con un microscopio electrónico

24. Columnas
 La parte interna de
las columnas
presentan surcos
concéntricos
revestidos con una
capa de glicerina
para dar
uniformidad a la fase
estacionaria
empacada.

25. Cromatografía de fase
normal
 Retardo por
interacción de la
superficie polar de la
fase estacionaria con
partes polares de las
moléculas.
 SIO2, Al2 O3,
AMINO,-CN, -NO2

26. Cromatografia de fase normal
 Heptano, hexano,
ciclohexano,
cloroformo
diclorometano,
dioxano, metanol
 Separación de
sustancias no iónicas
apolares hasta
semipolares
(hidrocarburos ---
Ac. Carbónicos)

27. Cromatografía fase inversa
 Retardo por
interacción de la
cadena apolar
hidrocarbonada de la
fase estacionaria con
partes apolares de las
moléculas de la
prueba

28. Cromatografía fase inversa
 n – octadecilo (RP-18) n-octilo , etilo
fenilo polímeros hidrófobos.
 Metanol o Acetonitrilo/agua o tampón
 Separación de sustancias no iónicas
apolares hasta semipolares. Mayor
resolución de separación.

29. Condiciones que debe reunir
el detector
 Respuesta universal con todos los solutos
 Sensibilidad alta (10-12 – 10-11g/ml
 Ruido de fondo muy bajo
 Celda del detecto de menor volumen
 No debe destruir la muestra
 Debe ser capaz de funcionar durante mucho
tiempo.

30. Clasificación de los detectores
 Absorbancia
 Fluorescencia
 Electroquímico
 Índicede refracción
 Conductividad
 Espectrometría de masas

31. Detector de absorbancia
 Definida por la ley de Lambert-Beer
 Utiliza lámparas de vapor de mercurio
 Celda de flujo para 10 ul
 Son de doble haz
 Deberá tener regiones electromagnéticas de
la luz ultravioleta y visible.

33. Detectores de diodos en serie
photodiode array
 Detectan dos tipos de compuestos que
absorben a distintas longitudes de onda
 Los datos espectrales se registran en la
memoria del computador en fracciones de
segundo.
 Proporciona gráficos tridimensionales
 Sistema de diodos

34. diodos

36. Campos de aplicacion
 Acidos biliares, colorantes biliares
 Alcaloides
 Anestésicos locales
 Anticarcinógenos
 Anticuagulantes
 Antimicrobianos
 Azucares
 hormonas

37.  Lípidos
 Nucleósidos /nucleotidos
 Sustancias cardioactivas
 Vitaminas
 Extractos de orina
 Metabolitos de drogas
 Venenos
 Plaguicidas

38. CREATININA

39. Benzodiacepi
nas en suero
Clorodiacepó
xido

40. Benzodiacepinas
en suero
Nitracepan
Oxacepan
Diacepan