Espectroscopia uv visible, validacion

Espectroscopía
UV-Visible
1
2013

Bouguer, Lambert y Beer.
 La ley fotométrica fue planteada
independientemente (y de distintas maneras)
por Bouguer en 1729, Lambert en 1760 y Beer
en 1852.
 Lambert interesado en la representación de la
profundidad en la pintura y en la transparencia
del aire, propuso en 1760 la ley fotométrica
finalmente llamada Ley de Lambert-Beer, que
relaciona la absorción de luz con las
propiedades del material atravesado.
2
Johann Heinrich
Lambert (1728 - 1777),
matemático, físico,
astrónomo y
filósofo alemán.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
T = P / P0 A = - log T = log (P0 / P)
LEY DE LAMBERT Y BEER. ABSORTIVIDAD
A = k.b.c
Absortividad (a):
Absorbancia de una solución de 1 gramo por litro, en celda de 1 cm de paso óptico.
a = A / cb Unidades: L g-1cm-1.
Coeficiente de extinción específica [E (1 %, 1 cm)]:
Absorbancia de una solución de 1 % (1g/100 mL), en celda de 1 cm paso óptico.
E (1 %, 1 cm) = A / cb = 10 a Unidades: g%-1 cm-1.
Absortividad molar (ε):
Absorbancia de una solución de 1 mol por litro, en celda de 1 cm paso óptico.
= a PM Unidades: M-1 cm-1.
3
Po
P
Los valores de a, E (1 %, 1 cm) y ε, a una longitud de onda específica y en un
solvente determinado, son característicos del analito.

CALIBRACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
1.El nivel 0 % de transmitancia con el obturador del instrumento cerrado
2. El nivel del instrumento al 100 % de transmitancia (cero de absorbancia)-BLANCO
4
Simple
haz
Doble
haz

LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER
Son las desviaciones de la linealidad entre absorbancia y concentración cuando el
paso óptico (b) es constante.
Desviaciones reales
A concentraciones 0,01 M o menores, el índice de refracción es esencialmente constante.
5
Son producidas por:
a) Concentraciones elevadas del analito (>0,01M). (Produce alteración de la
distribución de cargas entre las moléculas cercanas).
b) Concentraciones elevadas de electrolitos.
c) Los cambios en el índice de refracción del sistema analítico, pues como a depende
del índice de refracción de la muestra:
𝑎 = 𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑙
𝑛
(𝑛2+2)2

Desviaciones instrumentales
a) Radiación policromática
• La deducción de la ley de Lambert-Beer supone radiación monocromática
• Los monocromadores en realidad proporcionan una banda de longitudes de onda.
Cuando a' = a''..., esta ecuación se simplifica a A = a'bc y se cumple la ley de Beer.
6
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔
𝑃0λ´ + 𝑃0λ´´ + ⋯
𝑃0λ ´. 10−𝑎´𝑏𝑐 + 𝑃0λ´´. 10−𝑎´´𝑏𝑐 + ⋯

b) Radiación espúrea
 Son reflexiones procedentes de componentes ópticos y del monocromador.
 Llegan al detector debido a la dispersión por partículas de polvo y a las reflexiones en las
superficies interiores, pudiendo no haber atravesado la muestra.
 Posen longitudes de onda que son muy diferentes de las de la banda de luz principal
utilizada.
Ps es la potencia de la
radiación espúrea no
absorbida.
7

Desviaciones químicas
 Causadas por equilibrios en solución que involucran a la especie
absorbente y alteran su concentración.
 Originan desviaciones positivas o negativas, dan lugar a un
producto con un espectro de absorción diferente al del analito.
 Ejemplos:
 reacciones de asociación-disociación
 reacciones ácido-base
 polimerización
 formación de complejos
 reacciones con el solvente.
8

APLICACIONES
ANÁLISIS CUALITATIVO
• Se realiza barrido espectral (espectro de absorción).
• Se compara el espectro obtenido de la muestra que contiene el analito
absorbente y el espectro de un estándar de dicho analito.
• Requiere proceso de aislamiento y/o purificación de los analitos absorbentes
contenidas en la muestra.
El análisis del espectro UV-Visible no se utiliza como criterio único de identificación,
sino como análisis complementario.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
 Amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgánicos como inorgánicos
 Sensibilidades de hasta 10-7 M
 De moderada a alta selectividad
 Buena precisión
 Fácil adquisición de datos
9

Procedimientos para el Análisis Espectrofotométrico
1. Selección de la longitud de onda
2. Determinación de la relación entre absorbancia y concentración
a) Método sin la adición de estándar
b) Método con la adición de estándar:
útil para contrarrestar los efectos de matriz de la muestra.
A1 =  b Vx Cx
Vt
A2 =  b Vx Cx +  b Vs Cs
Vt Vt
Donde A1 y A2 son las absorbancias de la muestra diluída y de la muestra diluída
más estándar
10

Algunas utilidades de la espectrofotometría:
DETERMINACIÓN DE ELEMENTOS POR MEDIO DE AGENTES
COMPLEJANTES
 Los complejos de ciertos elementos presentan en muchos casos  ≥ 104 M-1cm-1 y
absorben fuertemente en el visible.
 Los altos coeficientes de absortividad molar permiten la determinación de
concentraciones del orden de mg/l ó ppm.
2, 2´ Dipiridilo 1,10 fenantrolina Difenilcarbazona
11

H In + H2O H3O+ + In-
Forma ácida Forma básica
Especie absorbente a la Especie absorbente a lb
DETERMINACIÓN DE CONSTANTES DE DISOCIACIÓN DE INDICADORES
ÁCIDO-BASE
Ka = [ In- ]eq [ H+ ]eq
[ H In ]eq
pKa = - log [ In- ]eq [ H+ ]eq . = pH – log [ In- ]eq .
[ H In ]eq [ H In ]eq
Cuya constante de equilibrio o constante de acidez, sería:
Y cuyo pKa, sería:
12

Procedimiento
(1) Determinar la longitud de onda de máxima absorción para cada una
de las dos formas (In- y InH).
lInH : 520 nm
lIn-: 430 nm
13
Se determina la λ de máxima absorción para cada una de las dos formas (In- y InH).
Se preparan dos soluciones de indicador con diferentes pH:
Una solución ácida, donde todo el indicador estará en su forma InH
y una solución básica, donde todo el indicador estará en su forma In-.

(2) Verificar la ley de Lambert y Beer para ambas formas del indicador.
InH
y = 150.50x + 0.02
R2
= 1.00
y = 10.10x + 0.02
R
2
= 0.99
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
cc (g/ L)
Abs Abs 520nm
Abs 430 nm
Absortividad de InH a 520 nm (a520 InH) 150,50 L g-1cm-1
Absortividad de InH a 430 nm (a430 InH) 10,10 L g-1cm-1
In-
y = 73.00x + 0.00
R2
= 1.00
y = 9.81x + 0.01
R
2
= 0.96
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.002 0.004 0.006 0.008
cc (g/ L)
Abs
Abs 520nm
Abs 430 nm
Absortividad de In- a 520 nm (a520 In-) 9,81 L g-1cm-1
Absortividad de In- a 430 nm (a430 In-) 73,00 L g-1cm-1
14
Se verifica Lambert y Beer para ambas formas del indicador.
Se preparan soluciones de distintas concentraciones de la forma ácida (InH) y de la forma básica
(In-) trabajando a pH extremos (asegurando la existencia de sólo una de las formas del indicador).
Luego se grafica Abs = f (concentración) y se obtiene de la curva de calibración la absortividad
de ambas formas (InH y In-), a las dos λ de onda máximas de absorción.

(3) Determinación de la concentración de ambas formas InH y In- a
distintos pH cercanos al pKa.
Solución de Rojo de
Metilo 0,01 % 10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL
AcNa 0,04 F 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL
AcH 0,02 F 50,00 mL 25,00 mL 10,00 mL 5,00 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL
pH 4,70 5,05 5,45 5,90
Abs a 520 nm 1,097 0,796 0,456 0,276
Abs a 430 nm 0,356 0,432 0,585 0,658
Abs520 nm = a520InH.b.(cc InH) + a520In-.b.(cc In-)
Abs430 nm = a430In-.b.(cc In-) + a430InH.b.(cc InH)
15
• Consiste en la determinación de la concentración de ambas formas InH y In- a distintos pH
cercanos al pKa.
• Se preparan soluciones de la misma concentración total del indicador con distintos pH,
• se mide la absorbancia a las dos λ máximas de absorción de ambas formas del indicador,
• se determina la concentración de las formas InH y In- en cada una de las soluciones preparadas.

Cc InH = . (a430In- . Abs520) – (a520In- . Abs430) .
(a520InH . a430In-) – (a520In- . a430InH)
Cc In- = . (a520InH . Abs430) – (a430InH . Abs520) .
(a520InH . a430In-) – (a520In- . a430InH)
pH Cc. InH (g/L) Cc. In- (g/L) pKa Ka
4,70 0.0070 0.0039 4.9557 1.10716 x 10-5
5,05 0.0049 0.0052 5.0256 9.42651 x 10-6
5,45 0.0025 0.0076 4.9687 1.07463 x 10-5
5,90 0.0012 0.0088 5.0531 8.84878 x 10-6
Ka media = 1,0023 x 10-5
pKa = 5,00
16

Espectroscopía de
Fluorescencia
17

Fluorescencia
 La fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia, son procesos
fotoluminiscentes, las moléculas de analito se excitan para dar una
especie, cuyo espectro de emisión brinda información para el análisis
cualitativo y cuantitativo.
 Tienen un límite de detección del orden de partes por billón y un
amplio rango lineal (permiten la determinación cuantitativa de
especies orgánicas e inorgánicas, a nivel de trazas).
 Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como método de
detección en HPLC y electroforesis capilar.
 Su utilidad está limitada, ya que pocas especies presentan
fotoluminiscencia.
18

Teoría de la fluorescencia y fosforescencia
1) Estados excitados
 El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no
puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos
iguales.
 Estado Singulete: Dos electrones en un orbital con estados de spín
opuestos (apareados). No presentan un campo magnético neto
(moléculas diamagnéticas), no son atraídas ni repelidas por un
campo magnético permanente.
 Estado Doblete: es el estado fundamental de un radical libre, tiene
electrones desapareados, el electrón impar puede tomar dos
orientaciones en un campo magnético, lo que otorga ligeras
diferencias de energía al sistema. Son moléculas paramagnéticas y
son influenciadas por campos magnéticos.
19

Teoría de la fluorescencia y fosforescencia
 Cuando uno de los electrones de una molécula es
excitado a un nivel de energía superior, se forma
un singulete o triplete.
En el estado singulete excitado, el espín del
electrón promocionado continúa apareado con el
del estado fundamental, en el estado triplete los
espines de los dos electrones están desapareados
(paralelos).
 Una molécula es paramagnética en el estado
triplete y diamagnética en el estado singulete.
Una transición singulete-triplete excitado, es
menos probable que la transición singulete-
singulete excitado.
Estado singulete
fundamental
Estado singulete
excitado
Estado triplete
excitado
20

2. Procesos de desactivación (a)
 Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental
mediante combinación de varios mecanismos:
 Por medio de la fluorescencia y la fosforescencia que conllevan la emisión
de un fotón de radiación.
 Mediante procesos no radiantes de desactivación o relajación (flechas
onduladas).
 El camino hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida del estado excitado.
 La fotoluminiscencia se limita a pocos sistemas que presentan
características estructurales y ambientales que permiten que las
velocidades de los procesos de desactivación no radiantes se
demoren hasta el punto en el que la reacción de emisión puede
competir cinéticamente con ellos.
21

Esquema de procesos de excitación y
desexcitación

Procesos de desactivación (b)
1) Relajación vibracional:
en disolución el exceso de energía vibracional se pierde mediante colisiones entre las moléculas
de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t1/2=10-12 seg).
23

en disolución el exceso de energía vibracional se pierde mediante colisiones entre las moléculas
de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t1/2=10-12 seg).
2) Conversión interna:
son procesos intermoleculares donde la molécula pasa a un estado electrónico de menor
energía sin emisión de radiación. Es más eficaz cuando dos niveles de energía electrónicos
están lo suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de energía
vibracional.

en disolución el exceso de energía vibracional se pierde mediante colisiones entre las
moléculas de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz
(t1/2=10-12 seg).
son procesos intermoleculares donde la molécula pasa a un estado electrónico de menor
energía sin emisión de radiación. Es más eficaz cuando dos niveles de energía electrónicos
están lo suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de
energía vibracional.
3) Conversión externa o amortiguación colisional:
ocurre por interacción y transferencia de energía entre la especie excitada y el disolvente
u otros solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el número de colisiones entre
partículas (bajas temperaturas y elevada viscosidad) desfavorecen este mecanismo y
tienden a aumentar la fluorescencia.
27

en disolución el exceso de energía vibracional se pierde mediante colisiones entre las moléculas de
las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t1/2=10-12 seg).
son procesos intermoleculares donde la molécula pasa a un estado electrónico de menor energía
sin emisión de radiación. Es más eficaz cuando dos niveles de energía electrónicos están lo
suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de energía vibracional.
3) Conversión externa o amortiguación colisional:
ocurre por interacción y transferencia de energía entre la especie excitada y el disolvente u otros
solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el número de colisiones entre partículas (bajas
temperaturas y elevada viscosidad)desfavorecen este mecanismo y tienden a aumentar la
fluorescencia.
4) Cruce entre sistemas:
Se invierte el espín de un electrón excitado y cambia la multiplicidad de la molécula.
La probabilidad de esta transición aumenta cuando los niveles vibracionales de los dos estados se
solapan.
Es mas frecuente en moléculas con átomos pesados (Br y I).
La presencia de especies paramagnéticas en la disolución (O2) favorecen este proceso y disminuyen
la fluorescencia.
29

Fluorescencia y Fosforescencia
“VARIACION DE STOKES”:
Debido a la alta eficiencia de la
relajación vibracional, la
desactivación ocurre desde el menor
nivel vibracional del estado excitado
hacia un estado vibracional del
estado basal, con corrimiento de la
banda de emisión hacia mayores l y
menores  con respecto a la de
absorción.
 Un triplete tiene menor energía que un singulete excitado, por lo que la fosforescencia emitida al
desactivarse desde un triplete será de mayor l que la de la desactivación fluorescente.
 La fluorescencia no involucra cambios en el espín electrónico (Tiempo de vida =10-5 segundos).
En la fosforescencia se rota el espín para generar el estado triplete, aumentando el tiempo de vida, (10-4 a
segundos).
31
La fosforescencia comprende la desactivación desde un estado triplete excitado, luego de un cruce intersistemas.

32
Estructura
Temperatura Rigidez estructural
Solvente
Viscosidad
pH
Fluorescencia
Variables que afectan a la fluorescencia y
fosforescencia

kf : fluorescencia
kces : cruce entre sistemas
kce : conversión externa
kci : conversión interna
kpd : predisociación
kd : disociación
kf, kpd y kd dependen principalmente de la estructura química del compuesto, mientras que el resto de
las constantes están fuertemente influenciadas por el entorno y en menor medida por la estructura.
Variables que afectan a la fluorescencia y
fosforescencia
1) Rendimiento cuántico o eficiencia cuántica
 Es la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número
total de moléculas excitadas.
Para moléculas altamente fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica es cercana a la unidad.
Las especies químicas que no presentan fluorescencia apreciable tienen eficacias que se acercan a cero.
 El rendimiento cuántico de fluorescencia  de un compuesto, puede calcularse a partir de las
constantes de velocidad relativas de los procesos por los cuales el estado singulete excitado
mas bajo se desactiva.
33
dpdcicecesf KKKKKK
Kf
excitadasmoléculasden
fluorescenquemoléculasden


º
º


2. Factores estructurales (a)
 La fluorescencia más intensa la presentan los compuestos que tienen grupos
funcionales aromáticos.
 Pueden presentar fluorescencia, compuestos con grupos carbonilo en estructuras
alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.
 La mayoría de los compuestos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en solución
y su eficiencia cuántica aumenta con el número de anillos y grado de condensación.
 En aromáticos, los sustituyentes dadores de electrones (OH, F, OCH3 y NH2 ),
incrementan la fluorescencia al aumentar la probabilidad del pasaje del estado excitado
al basal, al contribuir con la deslocalización de los electrones; ocurriendo lo contrario
con los grupos atractores de electrones.
 La falta de rigidez en la molécula, favorece la desactivación no radiante por conversión
interna.
 Ciertos agentes quelantes orgánicos, fluorescen mas intensamente al estar complejados
con un ión metálico no paramagnético, debido al aumento de rigidez de la estructura.
 Se puede incrementar la fluorescencia adsorbiendo la molécula a un soporte sólido.
34

3. Influencia de la temperatura
 Al aumentar la temperatura disminuye la eficacia cuántica de fluorescencia, debido
a que aumentan las colisiones entre las moléculas y por lo tanto aumenta la
probabilidad de desactivación por conversión externa.
4. Influencia del solvente
 Una disminución en la viscosidad del solvente aumenta la probabilidad de la
conversión externa y produce el mismo efecto que el aumento de temperatura.
 También disminuye la fluorescencia en solventes que tienen átomos pesados.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan a los disolventes
compuestos que contienen átomos pesados, ya que en estas condiciones aumenta
la velocidad de formación del triplete.
35

 El oxigeno suele disminuir la intensidad de fluorescencia:
 Esto puede deberse a una oxidación de la sustancia
 o a las propiedades paramagnéticas del oxigeno molecular, que favorece el cruce entre sistemas y
la conversión de las moléculas excitadas al estado triplete (produciendo fosforescencia).
 Otras especies paramagnéticas tienden a disminuir la fluorescencia.
6. Efecto del oxigeno disuelto
5. Efecto del pH
 La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos
en el anillo depende normalmente del pH.
Tanto la l de absorción como la de emisión, difieren entre la forma ionizada y la
no ionizada. Esto sugiere que los procedimientos analíticos basados en la medida
de fluorescencia requieren un control del pH.
 Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor es la estabilidad del
estado excitado y la consecuencia es fluorescencia.
36

Otros factores responsables de las desviaciones negativas a concentraciones elevadas:
Autoaniquilación o autoquenching.: Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual origina
una desactivación en forma de energía no radiante.
Autoabsorción.: la longitud de onda de emisión se solapa con la longitud de onda de absorción, produciendo una
disminución de la fluorescencia medida. La radiación emitida atraviesa la solución y es reabsorbida por otras moléculas en ella
que se relajan en forma no radiante. Este fenómeno puede ser ocasionada por las especies del analito u otras especies
presentes en solución.
7. Efecto de la concentración
 La potencia de emisión fluorescente F es proporcional
a la potencia radiante del haz de excitación absorbido
por el sistema.
 Reemplazando con Lambert-Beer se obtiene la serie de
Maclaurin.
 Si bc es pequeño solo el primer término del polinomio
es significativo y la ecuación se convierte en lineal.
 La ecuación establece una relación lineal entre la
concentración y la intensidad de fluorescencia.
 A concentraciones superiores, los términos no pueden
ser despreciados y se pierde la linealidad.
)´( 0 PPKF 




















 ...
!3
303,2
!2
303,2
.303,2´
32
0
bc
bcPKF


K.CFconstantessonbyPSi
303,2´
o
0

 bcPKF 
37

Sensibilidad y especificidad
 La alta sensibilidad se debe a que el poder de fluorescencia se puede medir
independientemente de la relación P y P0. En cambio en espectrofotometría,
la medición requiere evaluar ambos parámetros P y P0, ya que la absorbancia
es proporcional a la relación entre ambas intensidades.
Esto es fácil de comprender si visualizamos que es más fácil detectar una
“pequeña señal que una pequeña diferencia entre dos grandes señales”.
Para aumentar la sensibilidad se puede aumentar la potencia de la lámpara o
amplificar la señal fluorescente.
 Su especificidad resulta de la necesidad de conjugar dos espectros: el de
excitación y el de emisión. Es poco probable que dos compuestos tengan la
misma longitud de onda de excitación y de emisión de fluorescencia, por esto
es que el método tiene alta especificidad.
38

Fluorescencias vs Absorción
Fluorescencia Absorción
Más sensible Menos sensible
F=2,3.K´..b.c.Po T=P/Po=10-bc
Se mide F
A >Po>S
Se mide T
A > Po = S
(aumento proporcional de P)
Más selectiva Menos selectiva
41

Instrumentos de medida
(1) fluorímetro o espectrofluorímetro
1) Casi todos los instrumentos de
fluorescencia utilizan ópticas de doble haz,
para compensar las fluctuaciones en la
potencia de la fuente.
2) El haz proveniente de la fuente atraviesa un
filtro o monocromador de excitación que
transmite la radiación y excluye la de
emisión.
3) La fluorescencia es emitida en todas las
direcciones, pero la mejor manera de
observarla es en un ángulo de 90º con
respecto al haz de excitación; a otros
ángulos, la dispersión por la solución y las
paredes de la cubeta, puede causar grandes
errores en la medida de la intensidad.
4) La radiación emitida llega al detector
fotoeléctrico luego de atravesar el filtro o
monocromador de emisión.
5) El haz de referencia pasa por un atenuador,
que reduce su poder aproximadamente 100
veces.
6) Ambos rayos llegan a un amplificador
diferencial y de allí al registrador.
Figura 5. Esquema de un fluorímetro o
espectrofluorímetro.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
42

Instrumentos de medida
Espectrofluorímetros
 Tipo 1: son los que tienen un filtro para
seleccionar la λ de excitación y un monocromador
de red o prisma para la selección de la λ de
emisión.
 Tipo 2: son los “verdaderos” espectrofluorímetros,
que tienen dos monocromadores; uno de ellos
permite variar la λ de excitación y el otro permite
obtener el espectro de emisión.
Fluorímetros
 Son análogos a los fotómetros de absorción
donde se utilizan filtros para seleccionar las
longitudes de onda de excitación y emisión.
43

Aplicaciones
1. Determinación de especies inorgánicas
 Existen dos tipos de métodos:
Los directos donde se forma un quelato fluorescente y se mide
su emisión;
y los indirectos, donde se mide la disminución de emisión que se
debe a la acción atenuadora de la sustancia que se quiere
determinar. Este último método es más utilizado en la
determinación de aniones.
2. Determinación de especies orgánicas
 Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos,
productos naturales, esteroides y vitaminas. Siendo útil en el
análisis de productos alimentarios, farmacéuticos, muestras
clínicas y productos naturales.
44

Validación de Métodos
Analíticos
45

INTRODUCCIÓN (1)
 Un producto farmacéutico puede comercializarse
si cumple una serie de requisitos,
 Estos se verifican a través de ensayos químicos,
físicos y microbiológicos.
 Mediante ensayos descriptos en un Método
Analítico se comprueba que el producto cumple
con las especificaciones exigidas.
46

INTRODUCCIÓN (2)
 Un Método Analítico consta de un conjunto de
ensayos, necesarios para efectuar el análisis
completo de una sustancia.
 Existen 3 tipos fundamentales de ensayo:
 Ensayos de Identificación: se verifica la identidad del
producto analizado.
 Ensayos de Valoración: se verifica la concentración y
pureza del principio activo en la forma farmacéutica en
ensayo.
 Ensayos de disolución: se evalúa la liberación de los
principios activos contenidos en el producto
farmacéutico.
47

INTRODUCCIÓN (3)
Tipos de Métodos Analíticos:
 Métodos estándar (de refencia):
desarrollados por organizaciones de prestigio internacional.
 Métodos oficiales:
exigidos por organismos de regulación gubernamentales.
 Métodos de revistas científicas:
usados con especial atención y requieren previa validación.
 Métodos del propio laboratorio:
siempre documentados y previamente validados.
Se validan:
1. Métodos Analíticos.
2. Métodos de control de limpieza.
3. Equipos e instalaciones, Procesos, Software, Personal, etc.
48

VALIDACIÓN DE METÓDOS ANALÍTICOS
 Validar significa demostrar que un método es
adecuado para el propósito que fue diseñado.
(Según ICH).
 Mediante una validación se demuestra que los resultados
obtenidos a partir del método analítico son confiables.
 Se valida debido a que:
1. Disminuye los costos debido a que no serán necesarias las
repeticiones de ensayos, disminuyendo el gasto de materiales y
tiempo de trabajo.
2. Permite un conocimiento profundo de las características del
método analítico.
3. Constituye un requisito regulatorio.
(ICH:The International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
49

 Los métodos descriptos en Farmacopeas se
consideran validados .
Sin embargo la validez de estos métodos es
discutible, debido a diferencias en los excipientes
empleados y en la calidad de las materias primas
según su origen.
Resulta necesario validar el método analítico para
cada producto.
 Todos los Métodos Analíticos desarrollados en el
laboratorio o publicados en revistas científicas
deben ser validados.
50

Tipos de Validación:
 Validación Prospectiva:
Para métodos nuevos.
 Validación Retrospectiva:
Para métodos repetidamente utilizados, no validados
anteriormente y de los que se tiene documentación
suficiente para probar la bondad del método.
 Revalidación:
Repetición parcial o total de una validación debido a
cambios efectuados que pueden afectar la bondad del
método validado.
51

52
Los parámetros a considerar en una validación:
1) Selectividad y Especificidad (*)
2) Linealidad y rango
3) Exactitud
4) Precisión
5) Robustez
6) Sensibilidad
7) Límite de detección y cuantificación del analito (LOD/LOQ)
(*) Preferentemente se realizan durante el desarrollo del método
analítico.

53
1) Especificidad / Selectividad:
El método desarrollado debe ser capaz de resolver el analito de la
matriz de sus productos de degradación y de sustancias relacionadas.
 Este parámetro se refiere a la propiedad del método analítico de
producir una señal medible debida sólo a la presencia del analito y
que no corresponda a la interferencia de otros componentes de la
muestra.
Estos componentes pueden ser excipientes, productos de
degradación, impurezas de síntesis.

54
Para evaluar la Selectividad:
1) Se introducen determinados interferentes (impurezas,
sustancias relacionadas) y se compara la respuesta con
respecto a la solución que contiene sólo analito)
2) Se realizandegradaciones forzadas (ácidas, alcalinas, reductoras,
oxidantes fuertes ó débiles, hidrolíticas) y se evalua que la señal de
los compuestos productos de la degradación sea distinta del
analito.
3) Comparar con otros métodos o técnicas la habilidad del método
en medir el analito (preferentemente con distintos principios de
detección).

55
2) LINEALIDAD:
Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del
analito y su respuesta.
Además se determina el rango lineal, es decir el intervalo de
concentraciones de analito para el cual el método ha sido
probado, dentro de ese rango se pueden realizar
interpolaciones en una curva estándar.

56
3) EXACTITUD:
La exactitud indica la capacidad del método analítico para
proporcionar resultados lo más cerca posible del valor verdadero.
 Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequeña, la
exactitud es buena.
 No deben confundirse exactitud y precisión.
La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de mediciones,
pero no da ninguna indicación de lo cerca que están del valor verdadero.
Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo,
para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión.

57
% Recuperación =
C3
(C1 – C2)
x 100
C1: Concentración de la muestra fortificada
C2: Concentración de la muestra sin fortificar
C3: Concentración de fortificación
¿ Como se determina la Exactitud?
Existen cuatro métodos: el de mayor aplicación y utilizado en este
curso es el que consiste en agregar cantidades conocidas de analito a
la muestra (adición de estándar), cuando no se pueden preparar
blancos de muestra:
Limites:
(97-103%)

58
4) PRECISIÓN:
Está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor
de su valor medio y corresponde al grado de concordancia
entre ensayos individuales cuando el método se aplica
repetidamente a múltiples muestras.
La precisión se expresa matemáticamente como desviación
estándar relativa (RSD) o coeficiente de variación (CV).
RSD = X
s 100 


n
i i
XX
1 1
1
2











n
n
i
X
i
X
s

59
La precisión de un método analítico se estudia sobre:
 El sistema: evaluando la dispersión de al menos 10
inyecciones del estándar
 El método: evaluando la dispersión de varias
preparaciones (generalmente en un números de 6)
de la muestra preparada según se indica en el
método.

60
Dentro de la PRECISIÓN del método se pueden distinguir tres tipos de
estudios:
Repetibilidad Precisión Intermedia Reproducibilidad
Mismo método Mismo método Mismo método
Misma muestra Misma muestra Misma muestra
Mismo Laboratorio Mismo Laboratorio Distinto Laboratorio
Mismo analista que
lleva a cabo la
validación
Diferente analista Diferente analista
Mismo equipo Diferente equipo Diferente equipo
En un corto intervalo
de tiempo
Mayores intervalos de tiempo Largos intervalos de
tiempo

61
5) ROBUSTEZ:
 Capacidad de un método analítico para que los resultados no se
vean afectados por variaciones en los parámetros del
procedimiento.
 Es la resistencia de un método a cambiar los resultados cuando se
realizan desviaciones en las condiciones experimentales descriptas
en el procedimiento.
 Ejemplos (en HPLC):
Diferente columna
Cambiar la temperatura
Caudal
pH de la Fase móvil
Cambiar el % de SV orgánico en la FM, etc.

62
6) Sensibilidad
 Se define cuantitativamente como la variación de señal (ΔX) al
variar la concentración de analito (Δc)
 Es la pendiente de la curva de calibración, que es constante en la
mayoría de las determinaciones por ser lineales.

63
7) LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN:
El propósito es evaluar el método analítico a bajas
concentraciones de analito.
 LÍMITE DE DETECCIÓN:
Menor concentración de analito que puede ser detectada pero
no necesariamente cuantificada.
 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN:
Menor concentración de analito que puede ser cuantificada con
una precisión y exactitud adecuada.

64
 LÍMITE DE DETECCIÓN (LoD):
Expresado en forma de concentración
XLoD= Xbl + 3.SDbl LoD = XLoD - Xbl
S
 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LoQ):
Expresado en forma de concentración
XLoQ= Xbl + 10.SDbl LoQ = XLoQ - Xbl
S

65
Bibliografía disponible en internet:
 www.iupac.org
 www.iso.org
 www.ich.org ( Q2 (R1) Validación de métodos
analíticos).
 www.eurachem.ul.pt
 www.fda.gov
 www.usp.org (Capítulo <1225>).
La validación es un proceso tedioso pero garantiza la calidad
de los resultados analíticos.

Problemas a realizar en clase
 Problemas de espectrofotometría: 25
 Adición de estándar: 1
 Ejercicios de complejos: 1
 pk indicador: 5
 Fluorescencia: 9
 Problema 4 –validación- pág. 67-68
66

Trabajo Práctico
 Análisis cuantitativo de fluoresceína en una solución
inyectable
 Objetivos:
1) Reconocer las diferencias instrumentales y operacionales entre
espectroscopía de fluorescencia y espectroscopía UV-vis.
2) Comparar dos métodos analíticos espectroscópicos, uno oficial y otro del
propio laboratorio, en cuanto a su aptitud para el análisis cuantitativo de un
determinado compuesto. Los criterios a tener en cuenta son: precisión,
exactitud, sensibilidad, linealidad, selectividad y robustez.
3) Observar el fenómeno de quenching en una solución concentrada de
fluoresceína sódica.
67

Espectroscopia uv visible, validacion

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