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UNIDAD TRABAJO 7
DETERMINACIÓN DE MÉTODOS DE CLONACIÓN Y
SECUENCIACIÓN DEL ADN.
REV.04/05/19 V.1
MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR.
CLONACIÓN MOLECULAR = PROCESO DE AMPLIFICACIÓN IN VIVO DE
SECUENCIAS DE ADN GENÓMICO O DE ADNc BASADA EN LA TECNOLOGÍA DE
ADN RECOMBINANTE.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE = UNA APLICACIÓN DE LAS
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR.
PARA CREAR MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE QUE SERÁN INTRODUCIDAS
EN UNA CÉLULA HUÉSPED => POR MULTIPLICACIÓN DE ESTAS CÉLULAS.
MULTITUD DE COPIAS DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DE INTERÉS.
MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR.
MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR.
1.INSERCIÓN EN UNA MOLÉCULA
PORTADORA O VECTOR.
2.INTRODUCCIÓN DEL VECTOR
RECOMBINANTE.
3.SELECCIÓN Y MULTIPLICACIÓN EN
CULTIVO DE LAS CÉLULAS
PORTADORAS DEL ADN
RECOMBINANTE.
4.RECUPERACIÓN DEL FRAGMENTO
AMPLIFICADO.
MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR.
VENTAJAS:
•CLONAR EL GENOMA ENTERO DE UN ORGANISMO, CREANDO LIBRERÍAS
GENÓMICAS Y CLONAR TODOS LOS ARNm DE UNA POBLACIÓN CELULAR
CREANDO LIBRERÍAS DE ADNc.
•EXPRESAR GENES O DE SECUENCIAS DE INTERÉS CON APLICACIONES EN
INDUSTRIA (PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS, HORMONAS, ETC.), EN INVESTIGACIÓN,
EN INDUSTRIA AGRARIA O EN MEDICINA.
COMPONENTES DE LA CLONACIÓN.
VECTORES DE CLONACIÓN = MOLÉCULAS DE ADN QUE PUEDEN REPLICARSE
AUTÓNOMAMENTE EN UNA CÉLULA HUÉSPED Y QUE PERMITEN LA INSERCIÓN DE UN
FRAGMENTO DE ADN EXÓGENO DE INTERÉS (INSERTO), SIN PERDER LA CAPACIDAD
DE REPLICACIÓN AUTÓNOMA.
CÉLULAS HOSPEDADORAS = AQUELLAS EN LAS QUE SE INTRODUCE EL VECTOR
DE CLONACIÓN PARA SU AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REPLICACIÓN.
CÉLULA HOSPEDADORA => PROGENIE DE CÉLULAS CON LA MISMA CARGA
GENÉTICA (=CLON).
* BACTERIAS.
* CÉLULAS EUCARIOTAS.
CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES.
ORIGEN DE REPLICACIÓN QUE LE PERMITA REPLICARSE EN LA CÉLULA HUÉSPED JUNTO CON EL
INSERTO.
MÍNIMO, UN SITIO DE INSERCIÓN DE ADN EXTRAÑO = SECUENCIAS DIANA DE ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN, PRESENTES UNA ÚNICA VEZ EN TODA LA MOLÉCULA.
Ǝ VECTORES CON MÚLTIPLES DIANAS DE RESTRICCIÓN DIFERENTES Y ÚNICAS (INSERCIÓN DE
CUALQUIER ADN EXTRAÑO).
SI TODAS LAS DIANAS DE RESTRICCIÓN SE CONCENTRAN EN UN SEGMENTO CORTO DEL VECTOR =
SITIO MÚLTIPLE DE RESTRICCIÓN O SITIO MÚLTIPLE DE CLONACIÓN (POLYLINKER).
CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES.
CONTENER ALGÚN MARCADOR DE SELECCIÓN (GENES DE RESISTENCIA O QUE CODIFICAN
ENZIMAS EXÓGENAS A LA CÉLULA HUÉSPED) => DISTINGUIR LAS CÉLULAS QUE PORTAN EL
VECTOR DE LAS QUE NO LO PORTAN.
CONTENER UN MARCADOR DE IDENTIFICACIÓN (DISTINGUIR LAS CÉLULAS QUE PORTAN UN
VECTOR RECOMBINANTE CON ADN EXTRAÑO, DE LAS QUE PORTAN UN VECTOR SIN ADN
EXTRAÑO) O PUEDEN CONTENER UN PROMOTOR (TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO Y SU
TRADUCCIÓN) (VECTORES DE EXPRESIÓN).
CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES.
ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO
INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR.
PLÁSMIDOS.
MOLÉCULAS CIRCULARES DE ADN BICATENARIO EXTRACROMOSÓMICO CON CAPACIDAD
AUTÓNOMA DE REPLICACIÓN.
PLÁSMIDOS NATURALES => DISEÑAN VECTORES PLASMÍDICOS MODIFICÁNDOLOS MEDIANTE
INGENIERÍA GENÉTICA COMO VECTORES DE CLONACIÓN.
CADA CASO DE CLONACIÓN TIENE UN PLÁSMIDO IDÓNEO => DOS PARÁMETROS:
•TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDE TRANSPORTAR.
•NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO/CÉLULA QUE PUEDE ALCANZAR TRAS SU REPLICACIÓN EN
LA CÉLULA HOSPEDADORA (TASA DE REPLICACIÓN).
pBR322 INSERTOS PEQUEÑOS ENTRE 3,5 Y 5 KB Y ~ 20 COPIAS/CÉLULA O pUC18 INSERTOS
HASTA 10 KB Y ~ 500 COPIAS/CÉLULA.
TIPOS DE VECTORES.
ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO
INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR.
BACTERIÓFAGOS (FAGOS).
FAGO INTRODUCE SU MATERIAL GENÉTICO EN EL INTERIOR DE LA BACTERIA.
CICLO LISOGÉNICO = FAGO LAMBDA (FAGO λ),
ACEPTA INSERTOS DE HASTA 20 KB.
TIPOS DE VECTORES.
ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO
INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR.
CÓSMIDOS.
VECTORES HÍBRIDOS.
PARTE DEL CROMOSOMA DEL FAGO λ (SECUENCIAS COS) + ORIGEN DE REPLICACIÓN, UN GEN
DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS Y UN POLYLINKER DE UN PLÁSMIDO.
SECUENCIAS COS PERMITEN EMPAQUETAR DENTRO DE CÁPSIDES DE FAGO λ.
ADMITE INSERTOS DE HASTA 50 KB.
FAGÉMIDOS.
VECTORES HÍBRIDOS.
PLÁSMIDO (CON SU ORIGEN DE REPLICACIÓN BACTERIANO) + ORIGEN DE REPLICACIÓN (FAGO
M13).
SE INFECTA LA CÉLULA HOSPEDADORA QUE CONTIENE EL PLÁSMIDO CON M13, DE MANERA QUE
LAS PROTEÍNAS DEL VIRUS RECONOCEN EL ORIGEN DE REPLICACIÓN DEL FAGÉMIDO E INICIAN LA
REPLICACIÓN DE ADN MONOCATENARIO QUE SALE AL MEDIO EXTERNO.
PARA EXPERIMENTOS DE SECUENCIACIÓN Y PARA PRODUCIR SONDAS MONOCATENARIAS.
TIPOS DE VECTORES.
ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO
INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES.
VECTORES DE ALTA CAPACIDAD. ADMITEN FRAGMENTOS DE GRAN TAMAÑO.
CONSTRUIR GENOTECAS GENÓMICAS => PERMITEN CLONAR CON GRAN ESTABILIDAD.
MÁS UTILIZADOS:
CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS (BAC): INSERTOS DE HASTA 300 KB.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS (YAC): INSERTOS > 1 MB.
VECTORES LANZADERA (VECTORES TRANSBORDADORES).
VECTORES HÍBRIDOS, CON ORÍGENES DE REPLICACIÓN DE DOS HOSPEDADORES DIFERENTES.
(UNO DE UN PLÁSMIDO BACTERIANO Y OTRO DE LEVADURA O DE VIRUS ANIMAL -SV40-).
USO TRANSPORTAR INSERTOS ENTRE DOS HOSPEDADORES DISTINTOS, PARA ESTUDIOS DE
EXPRESIÓN GÉNICA:
EN EL PRIMERO (Escherichia coli) SE AMPLIFICA EL INSERTO.
EN EL SEGUNDO SE EXPRESA EL GEN AMPLIFICADO.
TIPOS DE VECTORES.
ELECCIÓN DE LA CÉLULA HOSPEDADORA DEPENDE DEL VECTOR DE CLONACIÓN Y DE LA
FINALIDAD PERSEGUIDA => SISTEMA VECTOR/HOSPEDADOR.
BACTERIAS.
PRESENTAN ESCASA COMPLICACIÓN TÉCNICA EN SU MANIPULACIÓN, SON MUY VERSÁTILES Y
CRECEN CON RAPIDEZ.
CÉLULAS MÁS UTILIZADAS COMO HOSPEDADORAS PARA CLONAR PLÁSMIDOS, FAGOS Y
CÓSMIDOS.
USAN CEPAS CARENTES DE ALGUNAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS PARA FAVORECER LA
ESTABILIDAD DE LOS VECTORES (EJ. CARECER DE EXONUCLEASAS PARA EVITAR LA
DEGRADACIÓN DE VECTORES DE CLONACIÓN).
MÁS UTILIZADAS: Escherichia coli (CEPA K12), Bacillus subtilis O ESPECIES DEL GÉNERO
Streptomyces.
TIPOS DE CÉLULAS HOSPEDADORAS.
ELECCIÓN DE LA CÉLULA HOSPEDADORA DEPENDE DEL VECTOR DE CLONACIÓN Y DE LA
FINALIDAD PERSEGUIDA => SISTEMA VECTOR/HOSPEDADOR.
CÉLULAS HOSPEDADORAS EUCARIOTAS.
LEVADURAS.
ORGANISMOS EUCARIÓTICOS UNICELULARES CON CRECIMIENTO SIMILAR A LAS BACTERIAS EN
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS Y LÍQUIDOS.
PARA CLONAR YAC Y PLÁSMIDOS DE LEVADURAS (PLÁSMIDO 2 µ).
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.
CÉLULAS VEGETALES Y ANIMALES.
EXPERIMENTOS DE CLONACIÓN ENFOCADOS EN INSERTAR GENES EXTRAÑOS EN EL GENOMA
DE LA CÉLULA HOSPEDADORA Y SU POSTERIOR EXPRESIÓN PARA OBTENER ORGANISMOS
TRANSGÉNICOS.
CÉLULAS VEGETALES SE UTILIZAN VECTORES BASADOS EN EL PLÁSMIDO Ti (Agrobacterium
tumefaciens).
CÉLULAS ANIMALES SE UTILIZAN VECTORES VÍRICOS (DERIVADOS DEL GENOMA DE
BACULOVIRUS -INFECTAN CÉLULAS DE INSECTOS- O RETROVIRUS -INFECTAN CÉLULAS DE
MAMÍFEROS).
TIPOS DE CÉLULAS HOSPEDADORAS.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE (CONTIENE UN INSERTO DE ADN EXTRAÑO).
PREPARAR EL ADN QUE SE VA CLONAR.
VECTOR DE CLONACIÓN.
PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR.
EXTREMOS COHESIVOS => ENZIMA DE RESTRICCIÓN QUE GENERAN ESTE TIPO DE EXTREMOS.
OBTENER EXTREMOS COHESIVOS:
ADN GENÓMICO COMPLETO PURIFICADO => DIGERIRLO CON UNA ENZIMA DE
RESTRICCIÓN COMPATIBLE CON EL VECTOR A UTILIZAR (TIENE UNA DIANA DE RESTRICCIÓN
PARA DICHA ENZIMA) Y SIN DIANA DE RESTRICCIÓN EN EL INTERIOR DE LA SECUENCIA A
CLONAR.
DIGESTIÓN = MÚLTIPLES FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS (ALGUNO CONTENDRÁ
LA SECUENCIA DIANA).
AMBOS SE UNE MEDIANTE UNA LIGASA.
NECESARIO CREAR EXTREMOS COHESIVOS Y
COMPLEMENTARIOS EN AMBAS MOLÉCULAS.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE.
PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR.
EXPERIMENTOS DE CLONACIÓN CON DIFERENTES ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, ASEGURAMOS
QUE ALGÚN FRAGMENTO DEL TAMAÑO ADECUADO CONTENGA LA SECUENCIA DIANA =>
LIBRERÍAS GENÓMICAS (= COLECCIONES DE VECTORES RECOMBINANTES CLONADOS QUE
INCLUYEN EL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO).
CLONAR SÓLO UN GEN => AMPLIFICAMOS PREVIAMENTE EL ADN A CLONAR (DIGERIR SE VAN A
GENERAR TANTOS VECTORES RECOMBINANTES COMO FRAGMENTOS DEL TAMAÑO ADECUADO
=> SUPONE MÁS TIEMPO Y MÁS GASTO DE RECURSOS AL IDENTIFICAR EL CLON ESPECÍFICO.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE.
PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN.
DIGERIR EL VECTOR CON LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN UTILIZADA PARA EL ADN .
SITUACIONES POSIBLES:
VECTOR CIRCULAR, CON DIANA DE RESTRICCIÓN ÚNICA. (MAYORÍA DE LOS PLÁSMIDOS).
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA = UNA MOLÉCULA LINEAL CON EXTREMOS COHESIVOS.
VECTOR CIRCULAR CON DOS DIANAS DE RESTRICCIÓN. DOS MOLÉCULAS LINEALES CON
EXTREMOS COHESIVOS Y TAMAÑOS DIFERENTES:
-UNO GRANDE. MARCADORES GENÉTICOS DE SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN Y ES LA BASE PARA
EL VECTOR RECOMBINANTE.
- OTRO PEQUEÑO. SIN INTERÉS PARA LA CLONACIÓN Y ES SUSTITUIDO POR EL ADN EXTRAÑO.
VECTOR LINEAL CON DIANA DE RESTRICCIÓN ÚNICA. DOS FRAGMENTOS (BRAZOS), IZQUIERDO
Y DERECHO. CON UN EXTREMO ROMO Y UN EXTREMO COHESIVO/BRAZO.
VECTOR LINEAL CON DOS DIANAS DE RESTRICCIÓN (COMO EL FAGO λ). DOS BRAZOS
(IZQUIERDO Y DERECHO), CON UN EXTREMO ROMO Y OTRO COHESIVO. PORTAN LOS
MARCADORES DE SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN.
REGIÓN CENTRAL (NO SE REQUIERE PARA LA CLONACIÓN Y ES SUSTITUIDA POR EL ADN
EXTRAÑO) CON EXTREMOS COHESIVOS.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE.
INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR.
MEZCLA DEL [ADN EXTRAÑO + VECTOR DE CLONACIÓN]
INCUBACIÓN EN CONDICIONES ÓPTIMAS.
UNIÓN A TRAVÉS DE LOS EXTREMOS COHESIVOS MEDIANTE COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
=> ADN LIGASA.
LIGASA SELLA LAS MELLAS EN LA DOBLE HÉLICE DE ADN = VECTOR RECOMBINANTE.
REACCIÓN DE LIGACIÓN = MEZCLA COMPLEJA DE MOLÉCULAS:
VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO.
PRODUCTOS NO DESEADOS (VECTORES RECIRCULARIZADOS SIN ADN EXTRAÑO,
MOLÉCULAS DE ADN EXTRAÑO UNIDAS ENTRE SÍ, VECTORES UNIDOS ENTRE SÍ,
COMBINACIONES DE VECTOR Y ADN EXTRAÑO CON DISTINTOS GRADOS DE COMPLEJIDAD,
ETC) => ESTOS PRODUCTOS SON INTRODUCIDOS EN CÉLULAS HOSPEDADORAS Y HABRÁ
QUE IR ELIMINANDOS EN FASES POSTERIORES DEL PROCESO.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA.
MÉTODOS:
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.
TRANSFECCIÓN.
TRANSDUCCIÓN.
ELECTROPORACIÓN.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.
CAPTAR E INTERNALIZAR POR PARTE DE UNA BACTERIA, MOLÉCULAS DE ADN DESNUDAS
PRESENTES EN EL MEDIO EXTERNO. ESTE PROCESO = BACTERIAS COMPETENTES.
ESPECIE BACTERIANA MÁS UTILIZADA COMO HOSPEDADORA = E. coli (NO ES COMPETENTE DE
FORMA NATURAL => HAY QUE CONVERTIRLA EN COMPETENTE).
CONVERSIÓN CONSISTE EN UN TRATAMIENTO CON CaCl + CHOQUE TÉRMICO => AUMENTA LA
PERMEABILIDAD DE LA PARED Y LA MEMBRANA CELULARES => BACTERIAS SE SIEMBRAN EN
MEDIO SÓLIDO.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA.
TRANSFECCIÓN.
INTRODUCCIÓN DE VECTORES RECOMBINANTES EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS NO MEDIADA
POR VIRUS (ANIMALES).
MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE AGENTES QUÍMICOS.
AÑADE EL VECTOR RECOMBINANTE EN UNA SOLUCIÓN TAMPONADA DE Ca3 (PO4)2 SOBRE
UN CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES EN MONOCAPA.
EL VECTOR COPRECIPITA + Ca3 (PO4)2 SOBRE LAS MEMBRANAS CELULARES Y ES
INTRODUCIDO EN EL INTERIOR DE LA CÉLULA POR ENDOCITOSIS.
MÉTODO MAS EFICIENTE. INCLUIYE EL VECTOR EN EL INTERIOR DE LIPOSOMAS Y ESTOS SE
FUSIONAN CON LAS MEMBRANAS CELULARES, LIBERANDO EL CONTENIDO AL INTERIOR DE LA
CÉLULA.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA.
TRANSDUCCIÓN.
INTRODUCCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO EXTRAÑO EN UNA CÉLULA POR LA ACCIÓN DE UN
VIRUS. EL VECTOR RECOMBINANTE SE EMPAQUETA DENTRO DE LA CÁPSIDE DE UN VIRUS.
INFECCIÓN DE CULTIVOS BACTERIANOS CON FAGOS RECOMBINANTES O CÓSMIDOS
EMPAQUETADOS EN FAGOS.
FAGOS λ RECOMBINANTES Y CÓSMIDOS => SECUENCIAS “COS” EN LOS EXTREMOS,
(EMPAQUETAMIENTO) MEZCLA DEL VECTOR RECOMBINANTE + PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDE
VÍRICA => PARTÍCULAS VÍRICAS CON VECTORES DEL TAMAÑO ADECUADO = VIRIONES QUE
INTRODUCEN EL MATERIAL GENÉTICO EN EL INTERIOR DE LA BACTERIA.
SI EL VECTOR ES UN FAGO RECOMBINANTE = CICLO LÍTICO => TIENE TODOS LOS GENES
NECESARIOS PARA EJECUTARLO.
SI EL VECTOR ES UN CÓSMIDO = CIRCULARIZA EN EL INTERIOR (EXTREMOS COHESIVOS DE
LAS SECUENCIAS “COS” ). COMPORTA COMO UN PLÁSMIDO.
BACULOVIRUS, ADENOVIRUS Y RETROVIRUS => INTRODUCIR VECTORES EN CÉLULAS
EUCARIOTAS (VEGETALES Y ANIMALES).
ELECTROPORACIÓN.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
MEZCLA DE CÉLULAS:
CÉLULAS NO TRANSFORMADAS SIN MOLÉCULA DE ADN EXTRAÑO.
CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO.
CÉLULAS TRANSFORMADAS QUE PORTAN UN VECTOR NO RECOMBINANTE O MOLÉCULAS
ADN NO DESEADA PRODUCIDA DURANTE LA LIGACIÓN.
PROCESO DE SELECCIÓN (ELIMINACIÓN DE CÉLULAS NO TRASFORMADAS) E IDENTIFICACIÓN
DE LOS CLONES RECOMBINANTES (VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO).
ESTA FASE ESTÁ CONDICIONADA POR LOS MARCADORES GENÉTICOS QUE PORTA EL VECTOR:
GENES DE RESISTENCIA, ENZIMAS QUE PRODUCEN REACCIONES COLOREADAS,
PROTEÍNAS FLUORESCENTES, GENES LETALES, ETC.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.
PRIMER SISTEMA DE DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN.
SE EMPLEAN VECTORES CON DOS GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS (AMPICILINA Y
TETRACICLINA).
PUNTO DE INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO ESTÁ EN EL INTERIOR DE LA SECUENCIA DE UNO DE
LOS GENES DE RESISTENCIA (TETRA) => VECTORES RECOMBINANTES NO SON RESISTENTES A
TETRA (INACTIVACIÓN POR INSERCIÓN).
INTRODUCE ESTE VECTOR EN BACTERIAS SENSIBLES A LA AMPICILINA Y LA TETRACICLINA SE
OBTIENEN TRES TIPOS DE CÉLULAS:
CÉLULAS NO TRANSFORMADAS (AMPICILINA Y TETRACICLINA SENSIBLES).
CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE (AMPI RESISTENTES Y TETRA
SENSIBLES).
CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR NO RECOMBINANTE (RESISTENTES ANTIB).
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.
SELECCIÓN => CULTIVANDO CÉLULAS EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO CON AMPICILINA => SOLO
CRECEN BACTERIAS TRANSFORMADAS.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
ESTRATEGIA CROMOGÉNICA.
UTIL CUANDO SE COMBINAN:
BACTERIAS HOSPEDADORAS DEFECTIVAS LACTOSA NEGATIVAS (LAC -) Y ES
SENSIBLE AL ANTIBIÓTICO PARA EL QUE PORTA RESISTENCIA EL VECTOR.
VECTORES, CON UN GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO Y EL GEN LacZα
(VECTORES RECOMBINANTES, ESTE GEN ES INACTIVO POR INSERCIÓN).
INTRODUCE EL VECTOR EN BACTERIAS SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO SE OBTIENEN
TRES TIPOS DE CÉLULAS:
CÉLULAS NO TRANSFORMADAS (SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO Y LAC -).
CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE(RESISTENTES AL
ANTIBIÓTICO Y LAC -).
CÉLULAS TRANSFORMADAS (VECTOR NO RECOMBINANTE, RESISTENTES AL
ANTIBIÓTICO Y LAC +.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES
RECOMBINANTES.
ESTRATEGIA CROMOGÉNICA.
SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SE REALIZAN SIMULTÁNEAMENTE:
CULTIVAN LAS BACTERIAS EN MEDIO SÓLIDO CON EL ANTIBIÓTICO
+ INDUCTOR DEL OPERÓN LAC (IPTG) + SUSTRATO CROMOGÉNICO
X-GAL.
CRECEN LAS BACTERIAS TRANSFORMADAS.
BACTERIAS CON VECTOR RECOMBINANTE (LAC -) = COLONIAS
BLANCAS.
BACTERIAS CON VECTOR NO RECOMBINANTE (LAC +) =
COLONIAS AZULES.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
PROTEÍNAS FLUORESCENTES.
UTILIZA VECTORES CON UN GEN DE RESISTENCIA (SELECCIÓN) Y UN GEN (REGIÓN
POLYLINKER) QUE CODIFICA LA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE (GFP) – MEDUSA-
(IDENTIFICACIÓN).
SELECCIÓN DE BACTERIAS TRANSFORMADAS. POR CRECIMIENTO EN MEDIOS SÓLIDOS
CON ANTIBIÓTICO.
IDENTIFICACIÓN. ILUMINANDO LAS PLACAS DE CULTIVO CON LUZ ULTRAVIOLETA.
COLONIAS DE BACTERIAS TRANSFORMADAS CON PLÁSMIDOS NO RECOMBINANTES =
FLUORESCENCIA VERDE.
COLONIAS TRANSFORMADAS CON PLÁSMIDOS RECOMBINANTES = NO
FLUORESCENCIA.
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES.
GENES LETALES.
UTILIZA VECTORES CON UN GEN DE RESISTENCIA A UN ANTIBIÓTICO (MARCADOR DE
SELECCIÓN) Y UN GEN (REGIÓN POLYLINKER) QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA LETAL PARA LAS
BACTERIAS (MARCADOR DE IDENTIFICACIÓN).
EN VECTORES RECOMBINANTES LA PROTEÍNA LETAL NO ES FUNCIONAL POR INACTIVACIÓN
POR INSERCIÓN.
SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN. SIMPLEMENTE CULTIVANDO LAS BACTERIAS EN UN MEDIO
CON EL ANTIBIÓTICO EN CUESTIÓN.
DESARROLLO DE BACTERIAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE.
BACTERIAS NO TRANSFORMADAS NO CRECEN (SON SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO).
BACTERIAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR NO RECOMBINANTE (MUEREN POR LA
PROTEÍNA LETAL).
BIBLIOTECAS DE ADN.
BIBLIOTECAS GENÓMICAS.
COLECCIONES DE VECTORES RECOMBINANTES CLONADOS QUE INCLUYEN EL GENOMA
COMPLETO DE UN ORGANISMO.
ORGANISMOS SUPERIORES. SE USAN VECTORES DE ALTA CAPACIDAD = CONTENER EL
GENOMA COMPLETO EN EL MENOR NÚMERO POSIBLE DE CLONES.
FAGOS, CÓSMIDOS, BAC O YAC.
CONTIENE AL MENOS UNA COPIA DE CUALQUIER SECUENCIA PRESENTE EN EL GENOMA DE UN
ORGANISMO.
UNA BIBLIOTECA GENÓMICA HUMANA EN FAGO λ DEBERÍA CONTENER VARIOS CIENTOS DE
MILES (APROXIMADAMENTE 8 105) DE CLONES.
BIBLIOTECAS DE ADN.
BIBLIOTECAS CROMOSÓMICAS.
CONSTRUIDAS A PARTIR DE UN ÚNICO CROMOSOMA O FRACCIÓN CROMOSÓMICA.
PARTEN DE UN ÚNICO CROMOSOMA PREVIAMENTE AISLADO DE CÉLULAS MITÓTICAS EN
METAFASE, POR MICRODISECCIÓN, CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD O
CITOMETRÍA DE FLUJO.
BIBLIOTECAS DE ADNc.
A PARTIR DEL ARNm DE UN TEJIDO O UNA POBLACIÓN CELULAR DETERMINADA.
REPRESENTAN SOLO EL SUBCONJUNTO DE GENES DE UN ORGANISMO QUE SE ESTÁN
EXPRESANDO EN UN TIPO CELULAR Y UN ESTADO METABÓLICO CONCRETOS.
CADA CLON PORTA UN GEN COMPLETO, PERO SU SECUENCIA DIFIERE DE LA SECUENCIA
GENÓMICA DE ESE MISMO GEN (CARECE DE INTRONES, PROMOTORES Y SECUENCIAS
REGULADORAS).
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR.
INVESTIGACIÓN BÁSICA:
DESCIFRAR SECUENCIAS GÉNICAS COMPLETAS DE CUALQUIER ORGANISMO.
ESTUDIOS FILOGENÉTICOS.
ESTUDIOS DE DIVERSIDAD GÉNICA .
ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA.
INVESTIGACIÓN APLICADA:
•CLONAR VECTORES DE EXPRESIÓN. PRODUCIR A NIVEL INDUSTRIAL PROTEÍNAS
RECOMBINANTES:
DE INTERÉS MÉDICO Y FARMACÉUTICO: INSULINA, GH, FACTOR ANTI-
HEMOFÍLICO, VACUNAS (HEPA. B), REACTIVOS PARA DIAGNÓSTICO, ETC.
DE INTERÉS EN LA INDUSTRIA QUÍMICA Y DE LA ALIMENTACIÓN: ENZIMAS Y
CATALIZADORES.
DE INTERÉS MEDIOAMBIENTAL: CREACIÓN DE MICROORGANISMOS CAPACES DE
METABOLIZAR PETRÓLEO, PRODUCTOS TÓXICOS Y MATERIALES DE DESECHO,
ETC.
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR.
IINVESTIGACIÓN APLICADA:
•ORGANISMOS TRANSGÉNICOS U ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE (GMO).
CLONANDO MEDIANTE INSERCIÓN DE GENES EN EL GENOMA DE CÉLULAS VEGETALES O
ANIMALES. TRANSFIEREN CARACTERES DE INTERÉS A PLANTAS Y ANIMALES
(RESISTENCIAS A ENFERMEDADES O A TÓXICOS, MÁS FÉRTILES, CON MAYORES TASAS DE
PRODUCCIÓN, ETC).
EN MEDICINA:
DOS APLICACIONES:
RATONES TRANSGÉNICOS. MODIFICADO SU ADN, ESTUDIAR ENFERMEDADES
GENÉTICAS (NIVEL DE COMPRENSIÓN COMO DE TRATAMIENTO).
*RATONES KNOCKOUT. INACTIVA UN GEN DETERMINADO, POR DELECIÓN O POR
INSERCIÓN DE OTRO GEN DISTINTO (QUE INTERRUMPE LA SECUENCIA CODIFICANTE
DEL GEN A INACTIVAR).
*RATONES KNOCKIN. GEN NORMAL POR OTRO MUTADO. MUTAGÉNESIS SE PUEDEN
ESTUDIAR:
-PEQUEÑAS MUTACIONES (CAMBIOS DE UN ÚNICO AMINOÁCIDO).
-MUTACIONES DE ENVERGADURA (MODIFICACIÓN DE DOMINIOS, SUSTITUCIÓN DE
CADENAS POLIPEPTÍDICAS ENTERAS, ETC.).
APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR.
EN MEDICINA:
DOS APLICACIONES:
TERAPIA GÉNICA. LA TERAPIA GÉNICA CONSISTE EN TRANSFERIR GENES
NORMALES A CÉLULAS SOMÁTICAS PARA CORREGIR UNA ENFERMEDAD
GENÉTICA.
LAS CÉLULAS TRATADAS SINTETIZAN EL PRODUCTO GÉNICO NORMAL, EVITANDO
UN TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE POR VIDA.
SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS.
PROCESO DE DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE
COMPONEN UNA MOLÉCULA DE ADN O DE ARN Y QUE SE REPRESENTA POR LAS
INICIALES DE LAS BASES NITROGENADAS QUE PORTAN.
EN UNA MOLÉCULA MONOCATENARIA LA TRANSCRIPCIÓN DE LETRAS SE INICIA EN EL
EXTREMO 5’ Y FINALIZA EN EL EXTREMO 3’.
EN UNA MOLÉCULA BICATENARIA SE TRANSCRIBE SOLO LA SECUENCIA DE LA
CADENA 5’->3’.
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ADN.
TÉCNICAS MANUALES BASADAS EN REACCIONES QUÍMICAS O REACCIONES
ENZIMÁTICAS.
 MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
 MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA.
MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENRACIÓN.
 SECUENCIACIÓN MASIVA 2ª GENERACIÓN.
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
BASADO EN LA MODIFICACIÓN DE LAS BASES NITROGENADAS MEDIANTE REACCIONES
QUÍMICAS ESPECÍFICAS.
 PERMITE SECUENCIAR FRAGMENTOS CORTOS DE ADN (< 250 KB).
 REQUIERE CANTIDADES ELEVADAS DE LA MOLÉCULA DE ADN PURIFICADA.
PROTOCOLO:
5´- ATTGACTTAGCC-3´
3´-TAACTGAATCGG-5´
1.MARCAJE DEL EXTREMO 5’ CON EL ISÓTOPO RADIACTIVO 32P.
DEFOSFORILACIÓN (FOSFATASA ALCALINA) Y FOSFORILÁNDOLO (POLINUCLEÓTIDO
KINASA Y ATP MARCADO CON 32P).
32P-- ATTGACTTAGCC-3´
2. REACCIONES DE MODIFICACIÓN QUÍMICA DE LAS BASES NITROGENADAS.
[REACTIVOS] + LAS CONDICIONES EN LAS QUE SE REALIZAN => MODIFICAN UN NÚMERO
PEQUEÑO DE BASES EN CADA MOLÉCULA DE ADN.
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
MUESTRA => CUATRO ALÍCUOTAS => REACCIÓN QUÍMICA DISTINTA:
 TUBO 1: MODIFICACIÓN DE “G” POR LA ACCIÓN DEL DMS.
32P-- ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTA; 32P-- ATT
 TUBO 2: MODIFICACIÓN DE PURINAS (“A” + “G”) POR EL ÁCIDO FÓRMICO.
32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTA; 32P– ATTGACTT; 32P– ATTG; 32P– ATT
 TUBO 3: MODIFICACIÓN DE PIRIMIDINAS (“C” + “T”) CON HIDRACINA.
32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTAGC; 32P– ATTGACTTAG; 32P– ATTGACT;
32P– ATTGAC; 32P– ATTGA; 32P– AT; 32P-- A
 TUBO 4: MODIFICACIÓN DE “C” CON HIDRACINA + SALES (NACL 2 M).
32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTAGC; 32P– ATTGACTTAG; 32P– ATTGA
FINALIZADA => PIPERIDINA (ROMPE LA CADENA A NIVEL DE LAS BASES MODIFICADAS).
FRAGMENTOS MARCADOS Y SIN MARCAR, DE LONGITUDES VARIABLES.
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
3. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (10-20%).
EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES (SEPARAR POR TAMAÑO LOS FRAGMENTOS
PRESENTES EN CADA TUBO).
4. AUTORRADIOGRAFÍA DEL GEL (FRAGMENTOS MARCADOS).
5. ANÁLISIS DE LA AUTORRADIOGRAFÍA (SECUENCIA DE LA MOLÉCULA DE ADN).
LECTURA SE INICIA POR EL EXTREMO INFERIOR DE LA AUTORRADIOGRAFÍA (EXTREMO 5’ DE
LA MOLÉCULA SECUENCIADA-FRAGMENTOS MÁS CORTOS MIGRAN MÁS RÁPIDAMENTE QUE
LOS LARGOS).
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
MÉTODO ENZIMÁTICO BASADO EN REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN DE CADENAS
COMPLEMENTARIAS A LA QUE SE QUIERE SECUENCIAR.
 MEZCLA DE REACCIÓN => AÑADEN DIDESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO
(DDNTP) = DESOXINUCLEÓTIDOS QUE CARECEN DEL GRUPO 3’-OH PARA
FORMAR UN NUEVO ENLACE FOSFODIÉSTER.
 LOS DDNTP QUE SE INCORPORAN A UNA CADENA DE ADN EN CRECIMIENTO,
ACTÚAN COMO TERMINADORES DE CADENA Y DETIENEN LA SÍNTESIS.
 CONSTA DE CUATRO FASES (TRES ÚLTIMAS COMUNES AL MÉTODO QUÍMICO):
1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN.
2. ELECTROFORESIS EN GEL.
3. AUTORRADIOGRAFÍA.
4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS.
MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN.
 DIVIDE EN CUATRO ALÍCUOTAS (REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN, UNA POR CADA
BASE NITROGENADA).
 CADA TUBO DE REACCIÓN CONTIENE:
 HEBRA MOLDE DE ADN.
 CEBADOR MARCADO EN SU EXTREMO 5’ CON 32P Y COMPLEMENTARIO
DEL EXTREMO 3’ DE LA HEBRA MOLDE.
 ADN POLIMERASA.
 CUATRO DNTP.
 UNO DE LOS CUATRO DDNTP POSIBLES (MARCA LA ESPECIFICIDAD DE
CADA REACCIÓN). 200 VECES MENOS CONCENTRADO QUE LOS DNTP.
 REACCIÓN DE POLIMERIZACIÓN => ADN POLIMERASA EXTIENDE EL CEBADOR
MARCADO => SINTETIZANDO UNA CADENA DE ADN COMPLEMENTARIA DE LA HEBRA
MOLDE HASTA INCORPORA ALEATORIAMENTE UN DDNTP => DETIENE LA
ELONGACIÓN.
MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
2. ELECTROFORESIS EN GEL.
3. AUTORRADIOGRAFÍA DEL GEL.
4. ANÁLISIS DE LA AUTORRADIOGRAFÍA.
CADA CALLE => NUCLEÓTIDO EN POSICIÓN 3’) DEL FRAGMENTO QUE REPRESENTA
CADA BANDA ES EL DDNTP AÑADIDO EN EL TUBO.
SECUENCIA COMPLEMENTARIA. LECTURA SE INICIA POR EL EXTREMO INFERIOR DE
LA AUTORRADIOGRAFÍA.
TENER EN CUENTA => SECUENCIA QUE SE LEE DIRECTAMENTE DE LA
AUTORRADIOGRAFÍA CORRESPONDE A LA CADENA DE NUEVA SÍNTESIS EN DIRECCIÓN
5’->3’ => SECUENCIA DE LA HEBRA MOLDE SERÁ LA COMPLEMENTARIA E IRÁ EN
SENTIDO CONTRARIO A LA LEÍDA.
MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
BASADA EN EL MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA DE SANGER Y EN EL
USO DE CUATRO FLUORÓFOROS COMO MARCADORES.
 PCR.
UTILIZAN SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS => AUTOMATIZAN LAS FASES DE LA
ELECTROFORESIS –EN GEL O CAPILAR–, LA DETECCIÓN DE LAS BANDAS
FLUORESCENTES Y EL ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS.
1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN. PCR.
TÉCNICAS DE PCR Y SU INCORPORACIÓN A LA SECUENCIACIÓN, AUMENTAN SU EFICACIA
RESPECTO A LA SECUENCIACIÓN DE SANGER.
DOS GRANDES VENTAJAS:
 REQUIERE MENOR CANTIDAD DEL ADN A SECUENCIAR.
 PUEDE SECUENCIARSE A PARTIR DE UNA MEZCLA COMPLEJA DE MOLÉCULAS DE
ADN BICATENARIAS.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
DOS PCR CONSECUTIVAS Y ACOPLADAS:
• 1ª PCR CONVENCIONAL DE AMPLIFICACIÓN. UN PAR DE CEBADORES, PARA
AMPLIFICAR EL FRAGMENTO DE ADN A SECUENCIAR.
• 2ª PCR DE SECUENCIACIÓN. UNO DE LOS CEBADORES EMPLEADOS EN LA 1ª.
UTILIZA COMO ADN MOLDE LOS AMPLICONES DE LA PRIMERA PCR.
SEGÚN CÓMO SE INCORPORE EL MARCAJE FLUORESCENTE EN LOS FRAGMENTOS
POLIMERIZADOS, Ǝ DOS TIPOS (PCR DE SECUENCIACIÓN):
 SECUENCIACIÓN CON CEBADOR FLUORESCENTE (DYE PRIMER SEQUENCING, EN
INGLÉS).
 SECUENCIACIÓN POR TERMINADOR FLUORESCENTE (DYE TERMINATOR
SEQUENCING, EN INGLÉS).
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
SECUENCIACIÓN CON CEBADOR FLUORESCENTE
REALIZA CUATRO PCR EN TUBOS SEPARADOS:
• EN TODAS SE UTILIZA EL MISMO CEBADOR CON UN FLUORÓFORO DISTINTO EN
CADA TUBO.
• EN CADA TUBO SE AÑADE A LA MEZCLA DE REACCIÓN UN DDNTP DISTINTO =>
ASOCIA UN COLOR FLUORESCENTE DISTINTO A CADA DDNTP.
TERMINA LA PCR => CADA TUBO CONTIENE TODOS LOS FRAGMENTOS POSIBLES =>
NUCLEÓTIDOS MARCADOS CON EL MISMO FLUORÓFORO EN EL EXTREMO 5’ DEL
CEBADOR.
FINALMENTE => PRODUCTOS DE LAS CUATRO PCR SE MEZCLAN Y SE CARGAN EN EL
SECUENCIADOR.
ÚTIL PARA SECUENCIAR BIBLIOTECAS DE ADN.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
SECUENCIACIÓN POR TERMINADOR FLUORESCENTE.
MÉTODO MÁS UTILIZADO PARA SECUENCIAR CUALQUIER MOLÉCULA DE ADN.
UNA ÚNICA PCR (UN SOLO TUBO):
• SE MARCAN LOS CUATRO DDNTP, CADA UNO CON UN FLUORÓFORO DISTINTO.
• EL CEBADOR (DNTP) SE UTILIZA SIN MARCAR.
AÑADE AL TUBO LOS CUATRO DDNTP Y LOS DNTP SIN MARCAR.
FINALIZADA LA PCR = TUBO CON UNA MEZCLA DE TODOS LOS FRAGMENTOS POSIBLES
MARCADOS CON CUATRO FLUORÓFOROS DISTINTOS EN EL EXTREMO 3’.
ESTE PRODUCTO SE CARGA EN EL SECUENCIADOR.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR.
2.1. ELECTROFORESIS.
SISTEMA DE ELECTROFORESIS PUEDEN SER:
 ELECTROFORESIS EN GEL.
GELES PLANOS DE POLIACRILAMIDA ULTRAFINOS (< 200 mm DE GROSOR).
PUEDEN CARGAR HASTA 96 MUESTRAS DISTINTAS.
VELOCIDAD DE LECTURA DEPENDE DEL GROSOR Y DE LAS CONDICIONES DE LA
ELECTROFORESIS (~ 200 BASES/HORA Y MUESTRA).
 ELECTROFORESIS CAPILAR.
CAPILARES DE SÍLICE FUNDIDA CON UN DIÁMETRO ENTRE 10 Y 200 mm.
MAYOR CAPACIDAD CON 96 CAPILARES.
VELOCIDAD DE LECTURA ~ 500 BASES/HORA Y POSIBILIDAD DE VARIAS RECARGAS
AUTOMÁTICAS.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR.
2.2. DETECCIÓN.
SISTEMA DE DETECCIÓN SE SITÚA EN LA PORCIÓN INFERIOR DEL GEL O DEL CAPILAR.
UN LÁSER QUE EXCITA EL FLUORÓFORO.
UN FRAGMENTO DE ADN MARCADO ALCANZA LA VENTANA DE LECTURA DEL SISTEMA DE
DETECCIÓN, EL LÁSER EXCITA EL FLUORÓFORO => EMITE FLUORESCENCIA (λ
DETERMINADA), LA CUAL ES CAPTADA POR EL DETECTOR Y REFLEJADA COMO UN PICO DE
FLUORESCENCIA DE UN COLOR DETERMINADO (ELECTROFEROGRAMA).
A – VERDE; T – ROJO; G – NEGRO; C – AZUL = SECUENCIA DE ADN.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª
GENERACIÓN (S. SANGER).
2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR.
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
DEPENDERA DEL CEBADOR UTILIZADO EN LA PCR DE SECUENCIACIÓN:
CEBADOR O PRIMER FORWARD (F) => SECUENCIA OBTENIDA = A LA DE LA CADENA 5’->3’
DE LA MOLÉCULA A SECUENCIAR.
CEBADOR O PRIMER REVERSE (R) => SECUENCIA OBTENIDA = ES LA COMPLEMENTARIA Y
EN SENTIDO INVERSO DE LA SECUENCIA 5’->3’ DE LA MOLÉCULA A SECUENCIAR.
5´-CGTAACGTA-3´
SECUENCIACIÓN MASIVA.
SECUENCIAR GENOMAS COMPLETOS INDIVIDUALES EN POCO TIEMPO Y A BAJO COSTE.
TECNOLOGÍA AUTOMATIZADA QUE CONSTA DE TRES FASES:
1. PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A SECUENCIAR (MOLDE).
2. SECUENCIACIÓN PROPIAMENTE DICHA.
3. ANÁLISIS DE LOS DATOS.
1. FASE DE PREPARACIÓN DEL ADN MOLDE.
FRAGMENTOS CON EXTREMOS UNIVERSALES PUEDE SER
AMPLIFICADA EN SU TOTALIDAD CON UN SOLO JUEGO DE
CEBADORES COMPLEMENTARIOS DE LOS ADAPTADORES.
POSTERIORMENTE, AMPLIFICA PREVIAMENTE LA BIBLIOTECA (AMPLIFICACIÓN CLONAL
DEL ADN MOLDE), OBTENIENDO CLONES DE CADA FRAGMENTO.
SECUENCIACIÓN MASIVA.
PCR EN EMULSIÓN (EMPCR). MICROESFERAS RECUBIERTAS DE UNO DE LOS CEBADORES
UNIVERSALES.
PROTOCOLO:
1º DESNATURALIZACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE TAMAÑO ADECUADO.
MEDIANTE HIBRIDACIÓN CEBADOR/ADAPTADOR LOS FRAGMENTOS SON CAPTURADOS
SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS ESFERAS. CADA ESFERA CAPTURA UN ÚNICO FRAGMENTO
DE ADN MOLDE.
2º INTRODUCCIÓN EN UN TUBO EPPENDORF DE LAS ESFERAS JUNTO A UNA MEZCLA DE
PCR CON EL SEGUNDO CEBADOR UNIVERSAL (FASE ACUOSA).
3º CUBRIR CON ACEITE.
4º EMULSIONAR AMBAS FASES. OBTIENEN MULTITUD DE GOTAS ACUOSAS DE MEZCLA DE
PCR. CONTIENEN UNA ESFERA CON UN ÚNICO FRAGMENTO DE ADN MOLDE, RODEADOS
DE ACEITE.
EN LOS MICRORREACTORES SE LLEVA A CABO UNA PCR CONVENCIONAL Y AL FINAL, CADA
ESFERA ESTÁ RECUBIERTA DE MÚLTIPLES FRAGMENTOS DE ADN MOLDE IDÉNTICOS
ANCLADOS A SU SUPERFICIE.
5º TERMINADO EL PROCESO. ROMPER LA EMULSIÓN Y LAS ESFERAS SE FIJAN SOBRE UNA
SUPERFICIE O SE DEPOSITAN EN MICROPOCILLOS INDIVIDUALES DE UNA PLACA
PICOTITER.
SECUENCIACIÓN MASIVA.
2. SECUENCIACIÓN.
TECNOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA: LA TERMINACIÓN REVERSIBLE CÍCLICA Y LA
PIROSECUENCIACIÓN.
CARACTERÍSTICAS:
• SON CÍCLICOS.
• NO ELECTROFORÉTICAS.
• BASADAS EN FLUORESCENCIA O BIOLUMINISCENCIA.
PIROSECUENCIACIÓN.
BASADA EN LA PRODUCCIÓN DE BIOLUMINISCENCIA MEDIANTE REACCIONES
ENZIMÁTICAS ACOPLADAS A LA INCORPORACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO A UNA CADENA EN
CRECIMIENTO.
MÉTODO UTILIZADO AL REALIZAR PCR EN EMULSIÓN CON MICROESFERAS Y PLACAS
PICOTITER.
 SITUAR LAS MICROESFERAS EN LOS POCILLOS DE LA PLACA PICOTITER.
 LOS CEBADORES UNIVERSALES SE UNEN A LOS ADN MOLDE.
 INICIAN GRUPOS DE CUATRO CICLOS DE SECUENCIACIÓN, CADA UNO CON TRES
FASES:
 INCUBACIÓN DE LA PLACA CON ADN POLIMERASA Y UN ÚNICO DNTP.
 PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA.
 ELIMINACIÓN DEL EXCESO DEL DNTP NO INCORPORADO.
PIROSECUENCIACIÓN.
1. INCUBACIÓN DE LA PLACA CON ADN POLIMERASA Y UN ÚNICO dNTP.
ADN POLIMERASA => UNE EL FRAGMENTO DE ADN MOLDE (dNTP COMPLEMENTARIO) AL
EXTREMO 3´DEL CEBADOR => SÍNTESIS DE LA NUEVA CADENA.
2. PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA.
EN LA INCORPORACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO A UNA CADENA DE ADN SE LIBERA UNA
MOLÉCULA DE PIROFOSFATO (PPI).
PIROSECUENCIACIÓN.
2. PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA.
MEDIDA:
TRAS LA FASE DE MEDIDA = MATRIZ DE PUNTOS CLAROS Y OSCUROS.
*POCILLOS. SIN EL NUCLEÓTIDO EN CUESTIÓN NO SE PRODUCIRÁ NINGUNA SEÑAL.
*POCILLOS. INCORPORADO EL NUCLEÓTIDO. LA INTENSIDAD DE LA BIOLUMINISCENCIA
DEPENDERÁ DEL NÚMERO DE NUCLEÓTIDOS INCORPORADO.
3. ANALISIS DE DATOS.
TRES CICLOS SIGUIENTES SE INCORPORAN DE UNO EN UNO LOS OTROS TRES DNTP,
CONTINUANDO EN GRUPOS DE CUATRO CICLOS HASTA TERMINAR LA SECUENCIACIÓN.
EL SOFTWARE GENERA UNA GRÁFICA PARA CADA POCILLO
(PIROGRAMA = REPRESENTA MEDIANTE LÍNEAS VERTICALES
LA INTENSIDAD DE BIOLUMINISCENCIA DE CADA POCILLO/CICLO).
ALTURA = NÚMERO DE VECES QUE SE REPITE DE MANERA
SEGUIDA EL NUCLEÓTIDO CORRESPONDIENTE A ESE CICLO.
OTROS ANALISIS REALIZADOS CON EL
SECUENCIADOR.
ANÁLISIS DE FRAGMENTOS.
ANALIZAR CUALQUIER MEZCLA COMPLEJA DE FRAGMENTOS DE DISTINTOS TAMAÑOS,
CON LA ÚNICA CONDICIÓN DE QUE ESTÉN MARCADOS FLUORESCENTEMENTE.
APLICACIÓN GENÉRICA DE LOS SECUENCIADORES DE 1ª GENERACIÓN, BASADOS EN
ELECTROFORESIS CAPILAR.
FRAGMENTOS A ANALIZAR SE GENERAN MEDIANTE PCR CON CEBADORES
FLUORESCENTES.
APLICACIONES:
+ DETECCIÓN DE DELECIONES E INSERCIONES.
+IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS (MEDICINA FORENSE, MEDIANTE HUELLAS GENÉTICAS
BASADAS EN AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES O DE POLIMORFISMOS DE TAMAÑO EN
GENERAL).
+ ESTUDIOS DE PATERNIDAD.
+ DETECCIÓN DE QUIMERAS EN PACIENTES CON TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA.
OTROS ANALISIS REALIZADOS CON EL
SECUENCIADOR.
AMPLIFICACIÓN MÚLTIPLE DE SONDAS DEPENDIENTE DE LIGAMIENTO (MLPA).
TÉCNICA QUE COMBINA LA AMPLIFICACIÓN DE MÚLTIPLES SONDAS MEDIANTE PCR +
ANÁLISIS DE FRAGMENTOS POR UN SECUENCIADOR DE 1ª GENERACIÓN.
DETECTAR Y CUANTIFICAR (DOSIS GÉNICA) HASTA 50 SECUENCIAS GÉNICAS DISTINTAS,
SIENDO CAPAZ DE DISCRIMINAR SECUENCIAS QUE DIFIEREN EN UN ÚNICO NUCLEÓTIDO.
MLPA UTILIZA UN ÚNICO JUEGO DE CEBADORES Y SE AMPLIFICAN UNAS SONDAS
ESPECIALES COMPLEMENTARIAS DE LAS REGIONES DE INTERÉS.
APLICACIONES: DETECCIÓN DE MUTACIONES ESTRUCTURALES Y NUMÉRICAS Y
DIAGNÓSTICO PRENATA
APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE
GENÉTICA FORENSE Y BIOINFORMÁTICA.
GENÉTICA FORENSE = PARTE DE LA GENÉTICA Y DE LA MEDICINA LEGAL Y
FORENSE QUE ANALIZA LA VARIABILIDAD GENÉTICA HUMANA PARA RESOLVER
PROBLEMAS DE IDENTIFICACIÓN.
PRINCIPALES PROBLEMAS:
 ESTUDIOS DE PATERNIDAD.
 IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS.
 INVESTIGACIONES CRIMINALÍSTICAS A PARTIR DE TODO TIPO DE
MUESTRAS BIOLÓGICAS HUMANAS (SANGRE, PELO, PIEL, SEMEN, SALIVA,
ETC.).
APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE
ANÁLISIS DEL ADN MITOCONDRIAL (ADNMT).
ESTUDIOS FORENSES DE MUESTRAS MUY ANTIGUAS, MUY DEGRADADAS O CON AUSENCIA
DE ADN NUCLEAR .
DEBIDO A:
• ADNMT ES UNA MOLÉCULA CIRCULAR, MÁS ESTABLE Y MÁS RESISTENTE A LAS
EXONUCLEASAS QUE EL ADN NUCLEAR LINEAL.
• NÚMERO DE MITOCONDRIAS POR CÉLULA Y A QUE CADA MITOCONDRIA TIENE
MÚLTIPLES COPIAS DE ADNMT => NÚMERO DE MOLÉCULAS DE ESE TIPO DE ADN POR
CÉLULA ES MUY SUPERIOR AL NUCLEAR.
TENER EN CUENTA EN GENÉTICA FORENSE ES QUE SU HERENCIA ES MATERNA => NO HAY
DIFERENCIAS ENTRE INDIVIDUOS DE UN MISMO LINAJE MATERNO (SALVO POR MUTACIONES).
ESTUDIOS FORENSES DE ADNMT SE BASAN EN POLIMORFISMOS DE SECUENCIA.
ADNMT HUMANO TIENE 16.569 PB Y ESTÁ TOTALMENTE SECUENCIADO.
DOS REGIONES HIPERVARIABLES. HVI (342 PB) Y HVII (268 PB). AMBAS UTILIZADAS PARA ESTE
TIPO DE ESTUDIOS. METODOLOGÍA: AMPLIFICAR Y SECUENCIAR ESTAS REGIONES PARA
ESTABLECER COMPARACIONES.
APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DEL CROMOSOMA Y.
CROMOSOMA ACROCÉNTRICO PEQUEÑO QUE PRÁCTICAMENTE NO SUFRE RECOMBINACIÓN DURANTE
LA MEIOSIS.
LO CUAL LO HACE INTERESANTE PARA ESTUDIOS FORENSES, PRÁCTICAMENTE TODO EL CROMOSOMA
CONSTITUYE UN GRUPO DE LIGAMIENTO QUE SE HEREDA JUNTO.
ANÁLISIS CON FINES FORENSES SE BASA EN POLIMORFISMOS DE LONGITUD Y, CONCRETAMENTE, EN
STR (Y-STR).
TODOS LOS Y-STR, SE ENCUENTRAN EN LA ZONA NO RECOMBINANTE DEL CROMOSOMA Y. SE HEREDAN
EN BLOQUE DE PADRES A HIJOS VARONES, CONSTITUYENDO UN HAPLOTIPO, MANTENIENDOSE
GENERACIÓN TRAS GENERACIÓN SIN MÁS CAMBIOS (SALVO MUTACIONES).
APLICACIONES:
• ESTUDIOS ANTROPOLÓGICOS PARA ESTUDIAR LA EVOLUCIÓN DE LINAJES PATERNOS.
• ESTUDIOS DE PATERNIDAD DE INDIVIDUOS VARONES (SIN MUESTRA DEL PRESUNTO PADRE, PERO
CON ACCESO A OTROS MIEMBROS DEL LINAJE PATERNO).
• CRIMINALÍSTICO. DELITOS SEXUALES. CÉLULAS DEL SEMEN O DE OTRO TIPO DE UN AGRESOR.
PROBLEMA: LOS VARONES DE UN MISMO LINAJE PATERNO TIENEN EL MISMO HAPLOTIPO =>
COMBINAR EL ANÁLISIS DEL CROMOSOMA Y CON ESTUDIOS DE POLIMORFISMO AUTOSÓMICO.

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METODOS DE CLONACION-SECUENCIACIONCIACION

  • 1. UNIDAD TRABAJO 7 DETERMINACIÓN DE MÉTODOS DE CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL ADN. REV.04/05/19 V.1
  • 2. MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR. CLONACIÓN MOLECULAR = PROCESO DE AMPLIFICACIÓN IN VIVO DE SECUENCIAS DE ADN GENÓMICO O DE ADNc BASADA EN LA TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE = UNA APLICACIÓN DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR. PARA CREAR MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE QUE SERÁN INTRODUCIDAS EN UNA CÉLULA HUÉSPED => POR MULTIPLICACIÓN DE ESTAS CÉLULAS. MULTITUD DE COPIAS DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DE INTERÉS.
  • 4. MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR. 1.INSERCIÓN EN UNA MOLÉCULA PORTADORA O VECTOR. 2.INTRODUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE. 3.SELECCIÓN Y MULTIPLICACIÓN EN CULTIVO DE LAS CÉLULAS PORTADORAS DEL ADN RECOMBINANTE. 4.RECUPERACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO.
  • 5. MÉTODOS DE CLONACIÓN MOLECULAR. VENTAJAS: •CLONAR EL GENOMA ENTERO DE UN ORGANISMO, CREANDO LIBRERÍAS GENÓMICAS Y CLONAR TODOS LOS ARNm DE UNA POBLACIÓN CELULAR CREANDO LIBRERÍAS DE ADNc. •EXPRESAR GENES O DE SECUENCIAS DE INTERÉS CON APLICACIONES EN INDUSTRIA (PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS, HORMONAS, ETC.), EN INVESTIGACIÓN, EN INDUSTRIA AGRARIA O EN MEDICINA.
  • 6. COMPONENTES DE LA CLONACIÓN. VECTORES DE CLONACIÓN = MOLÉCULAS DE ADN QUE PUEDEN REPLICARSE AUTÓNOMAMENTE EN UNA CÉLULA HUÉSPED Y QUE PERMITEN LA INSERCIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN EXÓGENO DE INTERÉS (INSERTO), SIN PERDER LA CAPACIDAD DE REPLICACIÓN AUTÓNOMA. CÉLULAS HOSPEDADORAS = AQUELLAS EN LAS QUE SE INTRODUCE EL VECTOR DE CLONACIÓN PARA SU AMPLIFICACIÓN MEDIANTE REPLICACIÓN. CÉLULA HOSPEDADORA => PROGENIE DE CÉLULAS CON LA MISMA CARGA GENÉTICA (=CLON). * BACTERIAS. * CÉLULAS EUCARIOTAS.
  • 7. CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES. ORIGEN DE REPLICACIÓN QUE LE PERMITA REPLICARSE EN LA CÉLULA HUÉSPED JUNTO CON EL INSERTO. MÍNIMO, UN SITIO DE INSERCIÓN DE ADN EXTRAÑO = SECUENCIAS DIANA DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, PRESENTES UNA ÚNICA VEZ EN TODA LA MOLÉCULA. Ǝ VECTORES CON MÚLTIPLES DIANAS DE RESTRICCIÓN DIFERENTES Y ÚNICAS (INSERCIÓN DE CUALQUIER ADN EXTRAÑO). SI TODAS LAS DIANAS DE RESTRICCIÓN SE CONCENTRAN EN UN SEGMENTO CORTO DEL VECTOR = SITIO MÚLTIPLE DE RESTRICCIÓN O SITIO MÚLTIPLE DE CLONACIÓN (POLYLINKER).
  • 8. CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES. CONTENER ALGÚN MARCADOR DE SELECCIÓN (GENES DE RESISTENCIA O QUE CODIFICAN ENZIMAS EXÓGENAS A LA CÉLULA HUÉSPED) => DISTINGUIR LAS CÉLULAS QUE PORTAN EL VECTOR DE LAS QUE NO LO PORTAN. CONTENER UN MARCADOR DE IDENTIFICACIÓN (DISTINGUIR LAS CÉLULAS QUE PORTAN UN VECTOR RECOMBINANTE CON ADN EXTRAÑO, DE LAS QUE PORTAN UN VECTOR SIN ADN EXTRAÑO) O PUEDEN CONTENER UN PROMOTOR (TRANSCRIPCIÓN DEL INSERTO Y SU TRADUCCIÓN) (VECTORES DE EXPRESIÓN).
  • 10. ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR. PLÁSMIDOS. MOLÉCULAS CIRCULARES DE ADN BICATENARIO EXTRACROMOSÓMICO CON CAPACIDAD AUTÓNOMA DE REPLICACIÓN. PLÁSMIDOS NATURALES => DISEÑAN VECTORES PLASMÍDICOS MODIFICÁNDOLOS MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA COMO VECTORES DE CLONACIÓN. CADA CASO DE CLONACIÓN TIENE UN PLÁSMIDO IDÓNEO => DOS PARÁMETROS: •TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDE TRANSPORTAR. •NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO/CÉLULA QUE PUEDE ALCANZAR TRAS SU REPLICACIÓN EN LA CÉLULA HOSPEDADORA (TASA DE REPLICACIÓN). pBR322 INSERTOS PEQUEÑOS ENTRE 3,5 Y 5 KB Y ~ 20 COPIAS/CÉLULA O pUC18 INSERTOS HASTA 10 KB Y ~ 500 COPIAS/CÉLULA. TIPOS DE VECTORES.
  • 11. ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR. BACTERIÓFAGOS (FAGOS). FAGO INTRODUCE SU MATERIAL GENÉTICO EN EL INTERIOR DE LA BACTERIA. CICLO LISOGÉNICO = FAGO LAMBDA (FAGO λ), ACEPTA INSERTOS DE HASTA 20 KB. TIPOS DE VECTORES.
  • 12. ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR. CÓSMIDOS. VECTORES HÍBRIDOS. PARTE DEL CROMOSOMA DEL FAGO λ (SECUENCIAS COS) + ORIGEN DE REPLICACIÓN, UN GEN DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS Y UN POLYLINKER DE UN PLÁSMIDO. SECUENCIAS COS PERMITEN EMPAQUETAR DENTRO DE CÁPSIDES DE FAGO λ. ADMITE INSERTOS DE HASTA 50 KB. FAGÉMIDOS. VECTORES HÍBRIDOS. PLÁSMIDO (CON SU ORIGEN DE REPLICACIÓN BACTERIANO) + ORIGEN DE REPLICACIÓN (FAGO M13). SE INFECTA LA CÉLULA HOSPEDADORA QUE CONTIENE EL PLÁSMIDO CON M13, DE MANERA QUE LAS PROTEÍNAS DEL VIRUS RECONOCEN EL ORIGEN DE REPLICACIÓN DEL FAGÉMIDO E INICIAN LA REPLICACIÓN DE ADN MONOCATENARIO QUE SALE AL MEDIO EXTERNO. PARA EXPERIMENTOS DE SECUENCIACIÓN Y PARA PRODUCIR SONDAS MONOCATENARIAS. TIPOS DE VECTORES.
  • 13. ORIGEN DE LA MOLÉCULA, LA DISPOSICIÓN DE LOS DISTINTOS ELEMENTOS QUE LO INTEGRAN Y EL TAMAÑO DEL INSERTO QUE PUEDEN INCORPORAR. CROMOSOMAS ARTIFICIALES. VECTORES DE ALTA CAPACIDAD. ADMITEN FRAGMENTOS DE GRAN TAMAÑO. CONSTRUIR GENOTECAS GENÓMICAS => PERMITEN CLONAR CON GRAN ESTABILIDAD. MÁS UTILIZADOS: CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS (BAC): INSERTOS DE HASTA 300 KB. CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS (YAC): INSERTOS > 1 MB. VECTORES LANZADERA (VECTORES TRANSBORDADORES). VECTORES HÍBRIDOS, CON ORÍGENES DE REPLICACIÓN DE DOS HOSPEDADORES DIFERENTES. (UNO DE UN PLÁSMIDO BACTERIANO Y OTRO DE LEVADURA O DE VIRUS ANIMAL -SV40-). USO TRANSPORTAR INSERTOS ENTRE DOS HOSPEDADORES DISTINTOS, PARA ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA: EN EL PRIMERO (Escherichia coli) SE AMPLIFICA EL INSERTO. EN EL SEGUNDO SE EXPRESA EL GEN AMPLIFICADO. TIPOS DE VECTORES.
  • 14. ELECCIÓN DE LA CÉLULA HOSPEDADORA DEPENDE DEL VECTOR DE CLONACIÓN Y DE LA FINALIDAD PERSEGUIDA => SISTEMA VECTOR/HOSPEDADOR. BACTERIAS. PRESENTAN ESCASA COMPLICACIÓN TÉCNICA EN SU MANIPULACIÓN, SON MUY VERSÁTILES Y CRECEN CON RAPIDEZ. CÉLULAS MÁS UTILIZADAS COMO HOSPEDADORAS PARA CLONAR PLÁSMIDOS, FAGOS Y CÓSMIDOS. USAN CEPAS CARENTES DE ALGUNAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS PARA FAVORECER LA ESTABILIDAD DE LOS VECTORES (EJ. CARECER DE EXONUCLEASAS PARA EVITAR LA DEGRADACIÓN DE VECTORES DE CLONACIÓN). MÁS UTILIZADAS: Escherichia coli (CEPA K12), Bacillus subtilis O ESPECIES DEL GÉNERO Streptomyces. TIPOS DE CÉLULAS HOSPEDADORAS.
  • 15. ELECCIÓN DE LA CÉLULA HOSPEDADORA DEPENDE DEL VECTOR DE CLONACIÓN Y DE LA FINALIDAD PERSEGUIDA => SISTEMA VECTOR/HOSPEDADOR. CÉLULAS HOSPEDADORAS EUCARIOTAS. LEVADURAS. ORGANISMOS EUCARIÓTICOS UNICELULARES CON CRECIMIENTO SIMILAR A LAS BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS Y LÍQUIDOS. PARA CLONAR YAC Y PLÁSMIDOS DE LEVADURAS (PLÁSMIDO 2 µ). Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. CÉLULAS VEGETALES Y ANIMALES. EXPERIMENTOS DE CLONACIÓN ENFOCADOS EN INSERTAR GENES EXTRAÑOS EN EL GENOMA DE LA CÉLULA HOSPEDADORA Y SU POSTERIOR EXPRESIÓN PARA OBTENER ORGANISMOS TRANSGÉNICOS. CÉLULAS VEGETALES SE UTILIZAN VECTORES BASADOS EN EL PLÁSMIDO Ti (Agrobacterium tumefaciens). CÉLULAS ANIMALES SE UTILIZAN VECTORES VÍRICOS (DERIVADOS DEL GENOMA DE BACULOVIRUS -INFECTAN CÉLULAS DE INSECTOS- O RETROVIRUS -INFECTAN CÉLULAS DE MAMÍFEROS). TIPOS DE CÉLULAS HOSPEDADORAS.
  • 16. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN.
  • 17. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE (CONTIENE UN INSERTO DE ADN EXTRAÑO). PREPARAR EL ADN QUE SE VA CLONAR. VECTOR DE CLONACIÓN. PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR. EXTREMOS COHESIVOS => ENZIMA DE RESTRICCIÓN QUE GENERAN ESTE TIPO DE EXTREMOS. OBTENER EXTREMOS COHESIVOS: ADN GENÓMICO COMPLETO PURIFICADO => DIGERIRLO CON UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN COMPATIBLE CON EL VECTOR A UTILIZAR (TIENE UNA DIANA DE RESTRICCIÓN PARA DICHA ENZIMA) Y SIN DIANA DE RESTRICCIÓN EN EL INTERIOR DE LA SECUENCIA A CLONAR. DIGESTIÓN = MÚLTIPLES FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS (ALGUNO CONTENDRÁ LA SECUENCIA DIANA). AMBOS SE UNE MEDIANTE UNA LIGASA. NECESARIO CREAR EXTREMOS COHESIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN AMBAS MOLÉCULAS.
  • 18. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE. PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR. EXPERIMENTOS DE CLONACIÓN CON DIFERENTES ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, ASEGURAMOS QUE ALGÚN FRAGMENTO DEL TAMAÑO ADECUADO CONTENGA LA SECUENCIA DIANA => LIBRERÍAS GENÓMICAS (= COLECCIONES DE VECTORES RECOMBINANTES CLONADOS QUE INCLUYEN EL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO). CLONAR SÓLO UN GEN => AMPLIFICAMOS PREVIAMENTE EL ADN A CLONAR (DIGERIR SE VAN A GENERAR TANTOS VECTORES RECOMBINANTES COMO FRAGMENTOS DEL TAMAÑO ADECUADO => SUPONE MÁS TIEMPO Y MÁS GASTO DE RECURSOS AL IDENTIFICAR EL CLON ESPECÍFICO.
  • 19. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE. PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN. DIGERIR EL VECTOR CON LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN UTILIZADA PARA EL ADN . SITUACIONES POSIBLES: VECTOR CIRCULAR, CON DIANA DE RESTRICCIÓN ÚNICA. (MAYORÍA DE LOS PLÁSMIDOS). DIGESTIÓN ENZIMÁTICA = UNA MOLÉCULA LINEAL CON EXTREMOS COHESIVOS. VECTOR CIRCULAR CON DOS DIANAS DE RESTRICCIÓN. DOS MOLÉCULAS LINEALES CON EXTREMOS COHESIVOS Y TAMAÑOS DIFERENTES: -UNO GRANDE. MARCADORES GENÉTICOS DE SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN Y ES LA BASE PARA EL VECTOR RECOMBINANTE. - OTRO PEQUEÑO. SIN INTERÉS PARA LA CLONACIÓN Y ES SUSTITUIDO POR EL ADN EXTRAÑO. VECTOR LINEAL CON DIANA DE RESTRICCIÓN ÚNICA. DOS FRAGMENTOS (BRAZOS), IZQUIERDO Y DERECHO. CON UN EXTREMO ROMO Y UN EXTREMO COHESIVO/BRAZO. VECTOR LINEAL CON DOS DIANAS DE RESTRICCIÓN (COMO EL FAGO λ). DOS BRAZOS (IZQUIERDO Y DERECHO), CON UN EXTREMO ROMO Y OTRO COHESIVO. PORTAN LOS MARCADORES DE SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN. REGIÓN CENTRAL (NO SE REQUIERE PARA LA CLONACIÓN Y ES SUSTITUIDA POR EL ADN EXTRAÑO) CON EXTREMOS COHESIVOS.
  • 20. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE I. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE. INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR. MEZCLA DEL [ADN EXTRAÑO + VECTOR DE CLONACIÓN] INCUBACIÓN EN CONDICIONES ÓPTIMAS. UNIÓN A TRAVÉS DE LOS EXTREMOS COHESIVOS MEDIANTE COMPLEMENTARIEDAD DE BASES => ADN LIGASA. LIGASA SELLA LAS MELLAS EN LA DOBLE HÉLICE DE ADN = VECTOR RECOMBINANTE. REACCIÓN DE LIGACIÓN = MEZCLA COMPLEJA DE MOLÉCULAS: VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO. PRODUCTOS NO DESEADOS (VECTORES RECIRCULARIZADOS SIN ADN EXTRAÑO, MOLÉCULAS DE ADN EXTRAÑO UNIDAS ENTRE SÍ, VECTORES UNIDOS ENTRE SÍ, COMBINACIONES DE VECTOR Y ADN EXTRAÑO CON DISTINTOS GRADOS DE COMPLEJIDAD, ETC) => ESTOS PRODUCTOS SON INTRODUCIDOS EN CÉLULAS HOSPEDADORAS Y HABRÁ QUE IR ELIMINANDOS EN FASES POSTERIORES DEL PROCESO.
  • 21. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA. MÉTODOS: TRANSFORMACIÓN BACTERIANA. TRANSFECCIÓN. TRANSDUCCIÓN. ELECTROPORACIÓN. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA. CAPTAR E INTERNALIZAR POR PARTE DE UNA BACTERIA, MOLÉCULAS DE ADN DESNUDAS PRESENTES EN EL MEDIO EXTERNO. ESTE PROCESO = BACTERIAS COMPETENTES. ESPECIE BACTERIANA MÁS UTILIZADA COMO HOSPEDADORA = E. coli (NO ES COMPETENTE DE FORMA NATURAL => HAY QUE CONVERTIRLA EN COMPETENTE). CONVERSIÓN CONSISTE EN UN TRATAMIENTO CON CaCl + CHOQUE TÉRMICO => AUMENTA LA PERMEABILIDAD DE LA PARED Y LA MEMBRANA CELULARES => BACTERIAS SE SIEMBRAN EN MEDIO SÓLIDO.
  • 22. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA. TRANSFECCIÓN. INTRODUCCIÓN DE VECTORES RECOMBINANTES EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS NO MEDIADA POR VIRUS (ANIMALES). MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE AGENTES QUÍMICOS. AÑADE EL VECTOR RECOMBINANTE EN UNA SOLUCIÓN TAMPONADA DE Ca3 (PO4)2 SOBRE UN CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES EN MONOCAPA. EL VECTOR COPRECIPITA + Ca3 (PO4)2 SOBRE LAS MEMBRANAS CELULARES Y ES INTRODUCIDO EN EL INTERIOR DE LA CÉLULA POR ENDOCITOSIS. MÉTODO MAS EFICIENTE. INCLUIYE EL VECTOR EN EL INTERIOR DE LIPOSOMAS Y ESTOS SE FUSIONAN CON LAS MEMBRANAS CELULARES, LIBERANDO EL CONTENIDO AL INTERIOR DE LA CÉLULA.
  • 23. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE II. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA. TRANSDUCCIÓN. INTRODUCCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO EXTRAÑO EN UNA CÉLULA POR LA ACCIÓN DE UN VIRUS. EL VECTOR RECOMBINANTE SE EMPAQUETA DENTRO DE LA CÁPSIDE DE UN VIRUS. INFECCIÓN DE CULTIVOS BACTERIANOS CON FAGOS RECOMBINANTES O CÓSMIDOS EMPAQUETADOS EN FAGOS. FAGOS λ RECOMBINANTES Y CÓSMIDOS => SECUENCIAS “COS” EN LOS EXTREMOS, (EMPAQUETAMIENTO) MEZCLA DEL VECTOR RECOMBINANTE + PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDE VÍRICA => PARTÍCULAS VÍRICAS CON VECTORES DEL TAMAÑO ADECUADO = VIRIONES QUE INTRODUCEN EL MATERIAL GENÉTICO EN EL INTERIOR DE LA BACTERIA. SI EL VECTOR ES UN FAGO RECOMBINANTE = CICLO LÍTICO => TIENE TODOS LOS GENES NECESARIOS PARA EJECUTARLO. SI EL VECTOR ES UN CÓSMIDO = CIRCULARIZA EN EL INTERIOR (EXTREMOS COHESIVOS DE LAS SECUENCIAS “COS” ). COMPORTA COMO UN PLÁSMIDO. BACULOVIRUS, ADENOVIRUS Y RETROVIRUS => INTRODUCIR VECTORES EN CÉLULAS EUCARIOTAS (VEGETALES Y ANIMALES). ELECTROPORACIÓN.
  • 24. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. MEZCLA DE CÉLULAS: CÉLULAS NO TRANSFORMADAS SIN MOLÉCULA DE ADN EXTRAÑO. CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO. CÉLULAS TRANSFORMADAS QUE PORTAN UN VECTOR NO RECOMBINANTE O MOLÉCULAS ADN NO DESEADA PRODUCIDA DURANTE LA LIGACIÓN. PROCESO DE SELECCIÓN (ELIMINACIÓN DE CÉLULAS NO TRASFORMADAS) E IDENTIFICACIÓN DE LOS CLONES RECOMBINANTES (VECTOR RECOMBINANTE ESPECÍFICO). ESTA FASE ESTÁ CONDICIONADA POR LOS MARCADORES GENÉTICOS QUE PORTA EL VECTOR: GENES DE RESISTENCIA, ENZIMAS QUE PRODUCEN REACCIONES COLOREADAS, PROTEÍNAS FLUORESCENTES, GENES LETALES, ETC.
  • 25. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS. PRIMER SISTEMA DE DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN. SE EMPLEAN VECTORES CON DOS GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS (AMPICILINA Y TETRACICLINA). PUNTO DE INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO ESTÁ EN EL INTERIOR DE LA SECUENCIA DE UNO DE LOS GENES DE RESISTENCIA (TETRA) => VECTORES RECOMBINANTES NO SON RESISTENTES A TETRA (INACTIVACIÓN POR INSERCIÓN). INTRODUCE ESTE VECTOR EN BACTERIAS SENSIBLES A LA AMPICILINA Y LA TETRACICLINA SE OBTIENEN TRES TIPOS DE CÉLULAS: CÉLULAS NO TRANSFORMADAS (AMPICILINA Y TETRACICLINA SENSIBLES). CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE (AMPI RESISTENTES Y TETRA SENSIBLES). CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR NO RECOMBINANTE (RESISTENTES ANTIB).
  • 26. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS. SELECCIÓN => CULTIVANDO CÉLULAS EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO CON AMPICILINA => SOLO CRECEN BACTERIAS TRANSFORMADAS.
  • 27. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. ESTRATEGIA CROMOGÉNICA. UTIL CUANDO SE COMBINAN: BACTERIAS HOSPEDADORAS DEFECTIVAS LACTOSA NEGATIVAS (LAC -) Y ES SENSIBLE AL ANTIBIÓTICO PARA EL QUE PORTA RESISTENCIA EL VECTOR. VECTORES, CON UN GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO Y EL GEN LacZα (VECTORES RECOMBINANTES, ESTE GEN ES INACTIVO POR INSERCIÓN). INTRODUCE EL VECTOR EN BACTERIAS SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO SE OBTIENEN TRES TIPOS DE CÉLULAS: CÉLULAS NO TRANSFORMADAS (SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO Y LAC -). CÉLULAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE(RESISTENTES AL ANTIBIÓTICO Y LAC -). CÉLULAS TRANSFORMADAS (VECTOR NO RECOMBINANTE, RESISTENTES AL ANTIBIÓTICO Y LAC +.
  • 28. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. ESTRATEGIA CROMOGÉNICA. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SE REALIZAN SIMULTÁNEAMENTE: CULTIVAN LAS BACTERIAS EN MEDIO SÓLIDO CON EL ANTIBIÓTICO + INDUCTOR DEL OPERÓN LAC (IPTG) + SUSTRATO CROMOGÉNICO X-GAL. CRECEN LAS BACTERIAS TRANSFORMADAS. BACTERIAS CON VECTOR RECOMBINANTE (LAC -) = COLONIAS BLANCAS. BACTERIAS CON VECTOR NO RECOMBINANTE (LAC +) = COLONIAS AZULES.
  • 29. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. PROTEÍNAS FLUORESCENTES. UTILIZA VECTORES CON UN GEN DE RESISTENCIA (SELECCIÓN) Y UN GEN (REGIÓN POLYLINKER) QUE CODIFICA LA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE (GFP) – MEDUSA- (IDENTIFICACIÓN). SELECCIÓN DE BACTERIAS TRANSFORMADAS. POR CRECIMIENTO EN MEDIOS SÓLIDOS CON ANTIBIÓTICO. IDENTIFICACIÓN. ILUMINANDO LAS PLACAS DE CULTIVO CON LUZ ULTRAVIOLETA. COLONIAS DE BACTERIAS TRANSFORMADAS CON PLÁSMIDOS NO RECOMBINANTES = FLUORESCENCIA VERDE. COLONIAS TRANSFORMADAS CON PLÁSMIDOS RECOMBINANTES = NO FLUORESCENCIA.
  • 30. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN. FASE III. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES. GENES LETALES. UTILIZA VECTORES CON UN GEN DE RESISTENCIA A UN ANTIBIÓTICO (MARCADOR DE SELECCIÓN) Y UN GEN (REGIÓN POLYLINKER) QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA LETAL PARA LAS BACTERIAS (MARCADOR DE IDENTIFICACIÓN). EN VECTORES RECOMBINANTES LA PROTEÍNA LETAL NO ES FUNCIONAL POR INACTIVACIÓN POR INSERCIÓN. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN. SIMPLEMENTE CULTIVANDO LAS BACTERIAS EN UN MEDIO CON EL ANTIBIÓTICO EN CUESTIÓN. DESARROLLO DE BACTERIAS CON EL VECTOR RECOMBINANTE. BACTERIAS NO TRANSFORMADAS NO CRECEN (SON SENSIBLES AL ANTIBIÓTICO). BACTERIAS TRANSFORMADAS CON EL VECTOR NO RECOMBINANTE (MUEREN POR LA PROTEÍNA LETAL).
  • 31. BIBLIOTECAS DE ADN. BIBLIOTECAS GENÓMICAS. COLECCIONES DE VECTORES RECOMBINANTES CLONADOS QUE INCLUYEN EL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO. ORGANISMOS SUPERIORES. SE USAN VECTORES DE ALTA CAPACIDAD = CONTENER EL GENOMA COMPLETO EN EL MENOR NÚMERO POSIBLE DE CLONES. FAGOS, CÓSMIDOS, BAC O YAC. CONTIENE AL MENOS UNA COPIA DE CUALQUIER SECUENCIA PRESENTE EN EL GENOMA DE UN ORGANISMO. UNA BIBLIOTECA GENÓMICA HUMANA EN FAGO λ DEBERÍA CONTENER VARIOS CIENTOS DE MILES (APROXIMADAMENTE 8 105) DE CLONES.
  • 32. BIBLIOTECAS DE ADN. BIBLIOTECAS CROMOSÓMICAS. CONSTRUIDAS A PARTIR DE UN ÚNICO CROMOSOMA O FRACCIÓN CROMOSÓMICA. PARTEN DE UN ÚNICO CROMOSOMA PREVIAMENTE AISLADO DE CÉLULAS MITÓTICAS EN METAFASE, POR MICRODISECCIÓN, CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD O CITOMETRÍA DE FLUJO. BIBLIOTECAS DE ADNc. A PARTIR DEL ARNm DE UN TEJIDO O UNA POBLACIÓN CELULAR DETERMINADA. REPRESENTAN SOLO EL SUBCONJUNTO DE GENES DE UN ORGANISMO QUE SE ESTÁN EXPRESANDO EN UN TIPO CELULAR Y UN ESTADO METABÓLICO CONCRETOS. CADA CLON PORTA UN GEN COMPLETO, PERO SU SECUENCIA DIFIERE DE LA SECUENCIA GENÓMICA DE ESE MISMO GEN (CARECE DE INTRONES, PROMOTORES Y SECUENCIAS REGULADORAS).
  • 33. APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR. INVESTIGACIÓN BÁSICA: DESCIFRAR SECUENCIAS GÉNICAS COMPLETAS DE CUALQUIER ORGANISMO. ESTUDIOS FILOGENÉTICOS. ESTUDIOS DE DIVERSIDAD GÉNICA . ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA. INVESTIGACIÓN APLICADA: •CLONAR VECTORES DE EXPRESIÓN. PRODUCIR A NIVEL INDUSTRIAL PROTEÍNAS RECOMBINANTES: DE INTERÉS MÉDICO Y FARMACÉUTICO: INSULINA, GH, FACTOR ANTI- HEMOFÍLICO, VACUNAS (HEPA. B), REACTIVOS PARA DIAGNÓSTICO, ETC. DE INTERÉS EN LA INDUSTRIA QUÍMICA Y DE LA ALIMENTACIÓN: ENZIMAS Y CATALIZADORES. DE INTERÉS MEDIOAMBIENTAL: CREACIÓN DE MICROORGANISMOS CAPACES DE METABOLIZAR PETRÓLEO, PRODUCTOS TÓXICOS Y MATERIALES DE DESECHO, ETC.
  • 34. APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR. IINVESTIGACIÓN APLICADA: •ORGANISMOS TRANSGÉNICOS U ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE (GMO). CLONANDO MEDIANTE INSERCIÓN DE GENES EN EL GENOMA DE CÉLULAS VEGETALES O ANIMALES. TRANSFIEREN CARACTERES DE INTERÉS A PLANTAS Y ANIMALES (RESISTENCIAS A ENFERMEDADES O A TÓXICOS, MÁS FÉRTILES, CON MAYORES TASAS DE PRODUCCIÓN, ETC). EN MEDICINA: DOS APLICACIONES: RATONES TRANSGÉNICOS. MODIFICADO SU ADN, ESTUDIAR ENFERMEDADES GENÉTICAS (NIVEL DE COMPRENSIÓN COMO DE TRATAMIENTO). *RATONES KNOCKOUT. INACTIVA UN GEN DETERMINADO, POR DELECIÓN O POR INSERCIÓN DE OTRO GEN DISTINTO (QUE INTERRUMPE LA SECUENCIA CODIFICANTE DEL GEN A INACTIVAR). *RATONES KNOCKIN. GEN NORMAL POR OTRO MUTADO. MUTAGÉNESIS SE PUEDEN ESTUDIAR: -PEQUEÑAS MUTACIONES (CAMBIOS DE UN ÚNICO AMINOÁCIDO). -MUTACIONES DE ENVERGADURA (MODIFICACIÓN DE DOMINIOS, SUSTITUCIÓN DE CADENAS POLIPEPTÍDICAS ENTERAS, ETC.).
  • 35. APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR. EN MEDICINA: DOS APLICACIONES: TERAPIA GÉNICA. LA TERAPIA GÉNICA CONSISTE EN TRANSFERIR GENES NORMALES A CÉLULAS SOMÁTICAS PARA CORREGIR UNA ENFERMEDAD GENÉTICA. LAS CÉLULAS TRATADAS SINTETIZAN EL PRODUCTO GÉNICO NORMAL, EVITANDO UN TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE POR VIDA.
  • 36. SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS. PROCESO DE DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS QUE COMPONEN UNA MOLÉCULA DE ADN O DE ARN Y QUE SE REPRESENTA POR LAS INICIALES DE LAS BASES NITROGENADAS QUE PORTAN. EN UNA MOLÉCULA MONOCATENARIA LA TRANSCRIPCIÓN DE LETRAS SE INICIA EN EL EXTREMO 5’ Y FINALIZA EN EL EXTREMO 3’. EN UNA MOLÉCULA BICATENARIA SE TRANSCRIBE SOLO LA SECUENCIA DE LA CADENA 5’->3’.
  • 37. MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DE ADN. TÉCNICAS MANUALES BASADAS EN REACCIONES QUÍMICAS O REACCIONES ENZIMÁTICAS.  MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.  MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA. MÉTODO DE SANGER Y COULSON.  SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENRACIÓN.  SECUENCIACIÓN MASIVA 2ª GENERACIÓN.
  • 38. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT. BASADO EN LA MODIFICACIÓN DE LAS BASES NITROGENADAS MEDIANTE REACCIONES QUÍMICAS ESPECÍFICAS.  PERMITE SECUENCIAR FRAGMENTOS CORTOS DE ADN (< 250 KB).  REQUIERE CANTIDADES ELEVADAS DE LA MOLÉCULA DE ADN PURIFICADA. PROTOCOLO: 5´- ATTGACTTAGCC-3´ 3´-TAACTGAATCGG-5´ 1.MARCAJE DEL EXTREMO 5’ CON EL ISÓTOPO RADIACTIVO 32P. DEFOSFORILACIÓN (FOSFATASA ALCALINA) Y FOSFORILÁNDOLO (POLINUCLEÓTIDO KINASA Y ATP MARCADO CON 32P). 32P-- ATTGACTTAGCC-3´ 2. REACCIONES DE MODIFICACIÓN QUÍMICA DE LAS BASES NITROGENADAS. [REACTIVOS] + LAS CONDICIONES EN LAS QUE SE REALIZAN => MODIFICAN UN NÚMERO PEQUEÑO DE BASES EN CADA MOLÉCULA DE ADN.
  • 39. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT. MUESTRA => CUATRO ALÍCUOTAS => REACCIÓN QUÍMICA DISTINTA:  TUBO 1: MODIFICACIÓN DE “G” POR LA ACCIÓN DEL DMS. 32P-- ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTA; 32P-- ATT  TUBO 2: MODIFICACIÓN DE PURINAS (“A” + “G”) POR EL ÁCIDO FÓRMICO. 32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTA; 32P– ATTGACTT; 32P– ATTG; 32P– ATT  TUBO 3: MODIFICACIÓN DE PIRIMIDINAS (“C” + “T”) CON HIDRACINA. 32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTAGC; 32P– ATTGACTTAG; 32P– ATTGACT; 32P– ATTGAC; 32P– ATTGA; 32P– AT; 32P-- A  TUBO 4: MODIFICACIÓN DE “C” CON HIDRACINA + SALES (NACL 2 M). 32P– ATTGACTTAGCC; 32P– ATTGACTTAGC; 32P– ATTGACTTAG; 32P– ATTGA FINALIZADA => PIPERIDINA (ROMPE LA CADENA A NIVEL DE LAS BASES MODIFICADAS). FRAGMENTOS MARCADOS Y SIN MARCAR, DE LONGITUDES VARIABLES.
  • 40. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT. 3. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (10-20%). EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES (SEPARAR POR TAMAÑO LOS FRAGMENTOS PRESENTES EN CADA TUBO). 4. AUTORRADIOGRAFÍA DEL GEL (FRAGMENTOS MARCADOS). 5. ANÁLISIS DE LA AUTORRADIOGRAFÍA (SECUENCIA DE LA MOLÉCULA DE ADN). LECTURA SE INICIA POR EL EXTREMO INFERIOR DE LA AUTORRADIOGRAFÍA (EXTREMO 5’ DE LA MOLÉCULA SECUENCIADA-FRAGMENTOS MÁS CORTOS MIGRAN MÁS RÁPIDAMENTE QUE LOS LARGOS).
  • 41. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT.
  • 42. MÉTODO DE SANGER Y COULSON. MÉTODO ENZIMÁTICO BASADO EN REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN DE CADENAS COMPLEMENTARIAS A LA QUE SE QUIERE SECUENCIAR.  MEZCLA DE REACCIÓN => AÑADEN DIDESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO (DDNTP) = DESOXINUCLEÓTIDOS QUE CARECEN DEL GRUPO 3’-OH PARA FORMAR UN NUEVO ENLACE FOSFODIÉSTER.  LOS DDNTP QUE SE INCORPORAN A UNA CADENA DE ADN EN CRECIMIENTO, ACTÚAN COMO TERMINADORES DE CADENA Y DETIENEN LA SÍNTESIS.  CONSTA DE CUATRO FASES (TRES ÚLTIMAS COMUNES AL MÉTODO QUÍMICO): 1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN. 2. ELECTROFORESIS EN GEL. 3. AUTORRADIOGRAFÍA. 4. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS.
  • 43. MÉTODO DE SANGER Y COULSON. 1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN.  DIVIDE EN CUATRO ALÍCUOTAS (REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN, UNA POR CADA BASE NITROGENADA).  CADA TUBO DE REACCIÓN CONTIENE:  HEBRA MOLDE DE ADN.  CEBADOR MARCADO EN SU EXTREMO 5’ CON 32P Y COMPLEMENTARIO DEL EXTREMO 3’ DE LA HEBRA MOLDE.  ADN POLIMERASA.  CUATRO DNTP.  UNO DE LOS CUATRO DDNTP POSIBLES (MARCA LA ESPECIFICIDAD DE CADA REACCIÓN). 200 VECES MENOS CONCENTRADO QUE LOS DNTP.  REACCIÓN DE POLIMERIZACIÓN => ADN POLIMERASA EXTIENDE EL CEBADOR MARCADO => SINTETIZANDO UNA CADENA DE ADN COMPLEMENTARIA DE LA HEBRA MOLDE HASTA INCORPORA ALEATORIAMENTE UN DDNTP => DETIENE LA ELONGACIÓN.
  • 44. MÉTODO DE SANGER Y COULSON. 2. ELECTROFORESIS EN GEL. 3. AUTORRADIOGRAFÍA DEL GEL. 4. ANÁLISIS DE LA AUTORRADIOGRAFÍA. CADA CALLE => NUCLEÓTIDO EN POSICIÓN 3’) DEL FRAGMENTO QUE REPRESENTA CADA BANDA ES EL DDNTP AÑADIDO EN EL TUBO. SECUENCIA COMPLEMENTARIA. LECTURA SE INICIA POR EL EXTREMO INFERIOR DE LA AUTORRADIOGRAFÍA. TENER EN CUENTA => SECUENCIA QUE SE LEE DIRECTAMENTE DE LA AUTORRADIOGRAFÍA CORRESPONDE A LA CADENA DE NUEVA SÍNTESIS EN DIRECCIÓN 5’->3’ => SECUENCIA DE LA HEBRA MOLDE SERÁ LA COMPLEMENTARIA E IRÁ EN SENTIDO CONTRARIO A LA LEÍDA.
  • 45. MÉTODO DE SANGER Y COULSON.
  • 46. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). BASADA EN EL MÉTODO ENZIMÁTICO DE TERMINACIÓN DE CADENA DE SANGER Y EN EL USO DE CUATRO FLUORÓFOROS COMO MARCADORES.  PCR. UTILIZAN SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS => AUTOMATIZAN LAS FASES DE LA ELECTROFORESIS –EN GEL O CAPILAR–, LA DETECCIÓN DE LAS BANDAS FLUORESCENTES Y EL ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. 1. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN. PCR. TÉCNICAS DE PCR Y SU INCORPORACIÓN A LA SECUENCIACIÓN, AUMENTAN SU EFICACIA RESPECTO A LA SECUENCIACIÓN DE SANGER. DOS GRANDES VENTAJAS:  REQUIERE MENOR CANTIDAD DEL ADN A SECUENCIAR.  PUEDE SECUENCIARSE A PARTIR DE UNA MEZCLA COMPLEJA DE MOLÉCULAS DE ADN BICATENARIAS.
  • 47. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). DOS PCR CONSECUTIVAS Y ACOPLADAS: • 1ª PCR CONVENCIONAL DE AMPLIFICACIÓN. UN PAR DE CEBADORES, PARA AMPLIFICAR EL FRAGMENTO DE ADN A SECUENCIAR. • 2ª PCR DE SECUENCIACIÓN. UNO DE LOS CEBADORES EMPLEADOS EN LA 1ª. UTILIZA COMO ADN MOLDE LOS AMPLICONES DE LA PRIMERA PCR. SEGÚN CÓMO SE INCORPORE EL MARCAJE FLUORESCENTE EN LOS FRAGMENTOS POLIMERIZADOS, Ǝ DOS TIPOS (PCR DE SECUENCIACIÓN):  SECUENCIACIÓN CON CEBADOR FLUORESCENTE (DYE PRIMER SEQUENCING, EN INGLÉS).  SECUENCIACIÓN POR TERMINADOR FLUORESCENTE (DYE TERMINATOR SEQUENCING, EN INGLÉS).
  • 48. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). SECUENCIACIÓN CON CEBADOR FLUORESCENTE REALIZA CUATRO PCR EN TUBOS SEPARADOS: • EN TODAS SE UTILIZA EL MISMO CEBADOR CON UN FLUORÓFORO DISTINTO EN CADA TUBO. • EN CADA TUBO SE AÑADE A LA MEZCLA DE REACCIÓN UN DDNTP DISTINTO => ASOCIA UN COLOR FLUORESCENTE DISTINTO A CADA DDNTP. TERMINA LA PCR => CADA TUBO CONTIENE TODOS LOS FRAGMENTOS POSIBLES => NUCLEÓTIDOS MARCADOS CON EL MISMO FLUORÓFORO EN EL EXTREMO 5’ DEL CEBADOR. FINALMENTE => PRODUCTOS DE LAS CUATRO PCR SE MEZCLAN Y SE CARGAN EN EL SECUENCIADOR. ÚTIL PARA SECUENCIAR BIBLIOTECAS DE ADN.
  • 50. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). SECUENCIACIÓN POR TERMINADOR FLUORESCENTE. MÉTODO MÁS UTILIZADO PARA SECUENCIAR CUALQUIER MOLÉCULA DE ADN. UNA ÚNICA PCR (UN SOLO TUBO): • SE MARCAN LOS CUATRO DDNTP, CADA UNO CON UN FLUORÓFORO DISTINTO. • EL CEBADOR (DNTP) SE UTILIZA SIN MARCAR. AÑADE AL TUBO LOS CUATRO DDNTP Y LOS DNTP SIN MARCAR. FINALIZADA LA PCR = TUBO CON UNA MEZCLA DE TODOS LOS FRAGMENTOS POSIBLES MARCADOS CON CUATRO FLUORÓFOROS DISTINTOS EN EL EXTREMO 3’. ESTE PRODUCTO SE CARGA EN EL SECUENCIADOR.
  • 52. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). 2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR. 2.1. ELECTROFORESIS. SISTEMA DE ELECTROFORESIS PUEDEN SER:  ELECTROFORESIS EN GEL. GELES PLANOS DE POLIACRILAMIDA ULTRAFINOS (< 200 mm DE GROSOR). PUEDEN CARGAR HASTA 96 MUESTRAS DISTINTAS. VELOCIDAD DE LECTURA DEPENDE DEL GROSOR Y DE LAS CONDICIONES DE LA ELECTROFORESIS (~ 200 BASES/HORA Y MUESTRA).  ELECTROFORESIS CAPILAR. CAPILARES DE SÍLICE FUNDIDA CON UN DIÁMETRO ENTRE 10 Y 200 mm. MAYOR CAPACIDAD CON 96 CAPILARES. VELOCIDAD DE LECTURA ~ 500 BASES/HORA Y POSIBILIDAD DE VARIAS RECARGAS AUTOMÁTICAS.
  • 53. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). 2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR. 2.2. DETECCIÓN. SISTEMA DE DETECCIÓN SE SITÚA EN LA PORCIÓN INFERIOR DEL GEL O DEL CAPILAR. UN LÁSER QUE EXCITA EL FLUORÓFORO. UN FRAGMENTO DE ADN MARCADO ALCANZA LA VENTANA DE LECTURA DEL SISTEMA DE DETECCIÓN, EL LÁSER EXCITA EL FLUORÓFORO => EMITE FLUORESCENCIA (λ DETERMINADA), LA CUAL ES CAPTADA POR EL DETECTOR Y REFLEJADA COMO UN PICO DE FLUORESCENCIA DE UN COLOR DETERMINADO (ELECTROFEROGRAMA). A – VERDE; T – ROJO; G – NEGRO; C – AZUL = SECUENCIA DE ADN.
  • 54. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA 1ª GENERACIÓN (S. SANGER). 2. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR. 2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEPENDERA DEL CEBADOR UTILIZADO EN LA PCR DE SECUENCIACIÓN: CEBADOR O PRIMER FORWARD (F) => SECUENCIA OBTENIDA = A LA DE LA CADENA 5’->3’ DE LA MOLÉCULA A SECUENCIAR. CEBADOR O PRIMER REVERSE (R) => SECUENCIA OBTENIDA = ES LA COMPLEMENTARIA Y EN SENTIDO INVERSO DE LA SECUENCIA 5’->3’ DE LA MOLÉCULA A SECUENCIAR. 5´-CGTAACGTA-3´
  • 55. SECUENCIACIÓN MASIVA. SECUENCIAR GENOMAS COMPLETOS INDIVIDUALES EN POCO TIEMPO Y A BAJO COSTE. TECNOLOGÍA AUTOMATIZADA QUE CONSTA DE TRES FASES: 1. PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A SECUENCIAR (MOLDE). 2. SECUENCIACIÓN PROPIAMENTE DICHA. 3. ANÁLISIS DE LOS DATOS. 1. FASE DE PREPARACIÓN DEL ADN MOLDE. FRAGMENTOS CON EXTREMOS UNIVERSALES PUEDE SER AMPLIFICADA EN SU TOTALIDAD CON UN SOLO JUEGO DE CEBADORES COMPLEMENTARIOS DE LOS ADAPTADORES. POSTERIORMENTE, AMPLIFICA PREVIAMENTE LA BIBLIOTECA (AMPLIFICACIÓN CLONAL DEL ADN MOLDE), OBTENIENDO CLONES DE CADA FRAGMENTO.
  • 56. SECUENCIACIÓN MASIVA. PCR EN EMULSIÓN (EMPCR). MICROESFERAS RECUBIERTAS DE UNO DE LOS CEBADORES UNIVERSALES. PROTOCOLO: 1º DESNATURALIZACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE TAMAÑO ADECUADO. MEDIANTE HIBRIDACIÓN CEBADOR/ADAPTADOR LOS FRAGMENTOS SON CAPTURADOS SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS ESFERAS. CADA ESFERA CAPTURA UN ÚNICO FRAGMENTO DE ADN MOLDE. 2º INTRODUCCIÓN EN UN TUBO EPPENDORF DE LAS ESFERAS JUNTO A UNA MEZCLA DE PCR CON EL SEGUNDO CEBADOR UNIVERSAL (FASE ACUOSA). 3º CUBRIR CON ACEITE. 4º EMULSIONAR AMBAS FASES. OBTIENEN MULTITUD DE GOTAS ACUOSAS DE MEZCLA DE PCR. CONTIENEN UNA ESFERA CON UN ÚNICO FRAGMENTO DE ADN MOLDE, RODEADOS DE ACEITE. EN LOS MICRORREACTORES SE LLEVA A CABO UNA PCR CONVENCIONAL Y AL FINAL, CADA ESFERA ESTÁ RECUBIERTA DE MÚLTIPLES FRAGMENTOS DE ADN MOLDE IDÉNTICOS ANCLADOS A SU SUPERFICIE. 5º TERMINADO EL PROCESO. ROMPER LA EMULSIÓN Y LAS ESFERAS SE FIJAN SOBRE UNA SUPERFICIE O SE DEPOSITAN EN MICROPOCILLOS INDIVIDUALES DE UNA PLACA PICOTITER.
  • 57. SECUENCIACIÓN MASIVA. 2. SECUENCIACIÓN. TECNOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA: LA TERMINACIÓN REVERSIBLE CÍCLICA Y LA PIROSECUENCIACIÓN. CARACTERÍSTICAS: • SON CÍCLICOS. • NO ELECTROFORÉTICAS. • BASADAS EN FLUORESCENCIA O BIOLUMINISCENCIA.
  • 58. PIROSECUENCIACIÓN. BASADA EN LA PRODUCCIÓN DE BIOLUMINISCENCIA MEDIANTE REACCIONES ENZIMÁTICAS ACOPLADAS A LA INCORPORACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO A UNA CADENA EN CRECIMIENTO. MÉTODO UTILIZADO AL REALIZAR PCR EN EMULSIÓN CON MICROESFERAS Y PLACAS PICOTITER.  SITUAR LAS MICROESFERAS EN LOS POCILLOS DE LA PLACA PICOTITER.  LOS CEBADORES UNIVERSALES SE UNEN A LOS ADN MOLDE.  INICIAN GRUPOS DE CUATRO CICLOS DE SECUENCIACIÓN, CADA UNO CON TRES FASES:  INCUBACIÓN DE LA PLACA CON ADN POLIMERASA Y UN ÚNICO DNTP.  PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA.  ELIMINACIÓN DEL EXCESO DEL DNTP NO INCORPORADO.
  • 59. PIROSECUENCIACIÓN. 1. INCUBACIÓN DE LA PLACA CON ADN POLIMERASA Y UN ÚNICO dNTP. ADN POLIMERASA => UNE EL FRAGMENTO DE ADN MOLDE (dNTP COMPLEMENTARIO) AL EXTREMO 3´DEL CEBADOR => SÍNTESIS DE LA NUEVA CADENA. 2. PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA. EN LA INCORPORACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO A UNA CADENA DE ADN SE LIBERA UNA MOLÉCULA DE PIROFOSFATO (PPI).
  • 60. PIROSECUENCIACIÓN. 2. PRODUCCIÓN Y MEDIDA DE BIOLUMINISCENCIA. MEDIDA: TRAS LA FASE DE MEDIDA = MATRIZ DE PUNTOS CLAROS Y OSCUROS. *POCILLOS. SIN EL NUCLEÓTIDO EN CUESTIÓN NO SE PRODUCIRÁ NINGUNA SEÑAL. *POCILLOS. INCORPORADO EL NUCLEÓTIDO. LA INTENSIDAD DE LA BIOLUMINISCENCIA DEPENDERÁ DEL NÚMERO DE NUCLEÓTIDOS INCORPORADO. 3. ANALISIS DE DATOS. TRES CICLOS SIGUIENTES SE INCORPORAN DE UNO EN UNO LOS OTROS TRES DNTP, CONTINUANDO EN GRUPOS DE CUATRO CICLOS HASTA TERMINAR LA SECUENCIACIÓN. EL SOFTWARE GENERA UNA GRÁFICA PARA CADA POCILLO (PIROGRAMA = REPRESENTA MEDIANTE LÍNEAS VERTICALES LA INTENSIDAD DE BIOLUMINISCENCIA DE CADA POCILLO/CICLO). ALTURA = NÚMERO DE VECES QUE SE REPITE DE MANERA SEGUIDA EL NUCLEÓTIDO CORRESPONDIENTE A ESE CICLO.
  • 61. OTROS ANALISIS REALIZADOS CON EL SECUENCIADOR. ANÁLISIS DE FRAGMENTOS. ANALIZAR CUALQUIER MEZCLA COMPLEJA DE FRAGMENTOS DE DISTINTOS TAMAÑOS, CON LA ÚNICA CONDICIÓN DE QUE ESTÉN MARCADOS FLUORESCENTEMENTE. APLICACIÓN GENÉRICA DE LOS SECUENCIADORES DE 1ª GENERACIÓN, BASADOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR. FRAGMENTOS A ANALIZAR SE GENERAN MEDIANTE PCR CON CEBADORES FLUORESCENTES. APLICACIONES: + DETECCIÓN DE DELECIONES E INSERCIONES. +IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS (MEDICINA FORENSE, MEDIANTE HUELLAS GENÉTICAS BASADAS EN AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES O DE POLIMORFISMOS DE TAMAÑO EN GENERAL). + ESTUDIOS DE PATERNIDAD. + DETECCIÓN DE QUIMERAS EN PACIENTES CON TRASPLANTE DE MÉDULA ÓSEA.
  • 62. OTROS ANALISIS REALIZADOS CON EL SECUENCIADOR. AMPLIFICACIÓN MÚLTIPLE DE SONDAS DEPENDIENTE DE LIGAMIENTO (MLPA). TÉCNICA QUE COMBINA LA AMPLIFICACIÓN DE MÚLTIPLES SONDAS MEDIANTE PCR + ANÁLISIS DE FRAGMENTOS POR UN SECUENCIADOR DE 1ª GENERACIÓN. DETECTAR Y CUANTIFICAR (DOSIS GÉNICA) HASTA 50 SECUENCIAS GÉNICAS DISTINTAS, SIENDO CAPAZ DE DISCRIMINAR SECUENCIAS QUE DIFIEREN EN UN ÚNICO NUCLEÓTIDO. MLPA UTILIZA UN ÚNICO JUEGO DE CEBADORES Y SE AMPLIFICAN UNAS SONDAS ESPECIALES COMPLEMENTARIAS DE LAS REGIONES DE INTERÉS. APLICACIONES: DETECCIÓN DE MUTACIONES ESTRUCTURALES Y NUMÉRICAS Y DIAGNÓSTICO PRENATA
  • 63. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE GENÉTICA FORENSE Y BIOINFORMÁTICA. GENÉTICA FORENSE = PARTE DE LA GENÉTICA Y DE LA MEDICINA LEGAL Y FORENSE QUE ANALIZA LA VARIABILIDAD GENÉTICA HUMANA PARA RESOLVER PROBLEMAS DE IDENTIFICACIÓN. PRINCIPALES PROBLEMAS:  ESTUDIOS DE PATERNIDAD.  IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS.  INVESTIGACIONES CRIMINALÍSTICAS A PARTIR DE TODO TIPO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS HUMANAS (SANGRE, PELO, PIEL, SEMEN, SALIVA, ETC.).
  • 64. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE ANÁLISIS DEL ADN MITOCONDRIAL (ADNMT). ESTUDIOS FORENSES DE MUESTRAS MUY ANTIGUAS, MUY DEGRADADAS O CON AUSENCIA DE ADN NUCLEAR . DEBIDO A: • ADNMT ES UNA MOLÉCULA CIRCULAR, MÁS ESTABLE Y MÁS RESISTENTE A LAS EXONUCLEASAS QUE EL ADN NUCLEAR LINEAL. • NÚMERO DE MITOCONDRIAS POR CÉLULA Y A QUE CADA MITOCONDRIA TIENE MÚLTIPLES COPIAS DE ADNMT => NÚMERO DE MOLÉCULAS DE ESE TIPO DE ADN POR CÉLULA ES MUY SUPERIOR AL NUCLEAR. TENER EN CUENTA EN GENÉTICA FORENSE ES QUE SU HERENCIA ES MATERNA => NO HAY DIFERENCIAS ENTRE INDIVIDUOS DE UN MISMO LINAJE MATERNO (SALVO POR MUTACIONES). ESTUDIOS FORENSES DE ADNMT SE BASAN EN POLIMORFISMOS DE SECUENCIA. ADNMT HUMANO TIENE 16.569 PB Y ESTÁ TOTALMENTE SECUENCIADO. DOS REGIONES HIPERVARIABLES. HVI (342 PB) Y HVII (268 PB). AMBAS UTILIZADAS PARA ESTE TIPO DE ESTUDIOS. METODOLOGÍA: AMPLIFICAR Y SECUENCIAR ESTAS REGIONES PARA ESTABLECER COMPARACIONES.
  • 65. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA FORENSE ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DEL CROMOSOMA Y. CROMOSOMA ACROCÉNTRICO PEQUEÑO QUE PRÁCTICAMENTE NO SUFRE RECOMBINACIÓN DURANTE LA MEIOSIS. LO CUAL LO HACE INTERESANTE PARA ESTUDIOS FORENSES, PRÁCTICAMENTE TODO EL CROMOSOMA CONSTITUYE UN GRUPO DE LIGAMIENTO QUE SE HEREDA JUNTO. ANÁLISIS CON FINES FORENSES SE BASA EN POLIMORFISMOS DE LONGITUD Y, CONCRETAMENTE, EN STR (Y-STR). TODOS LOS Y-STR, SE ENCUENTRAN EN LA ZONA NO RECOMBINANTE DEL CROMOSOMA Y. SE HEREDAN EN BLOQUE DE PADRES A HIJOS VARONES, CONSTITUYENDO UN HAPLOTIPO, MANTENIENDOSE GENERACIÓN TRAS GENERACIÓN SIN MÁS CAMBIOS (SALVO MUTACIONES). APLICACIONES: • ESTUDIOS ANTROPOLÓGICOS PARA ESTUDIAR LA EVOLUCIÓN DE LINAJES PATERNOS. • ESTUDIOS DE PATERNIDAD DE INDIVIDUOS VARONES (SIN MUESTRA DEL PRESUNTO PADRE, PERO CON ACCESO A OTROS MIEMBROS DEL LINAJE PATERNO). • CRIMINALÍSTICO. DELITOS SEXUALES. CÉLULAS DEL SEMEN O DE OTRO TIPO DE UN AGRESOR. PROBLEMA: LOS VARONES DE UN MISMO LINAJE PATERNO TIENEN EL MISMO HAPLOTIPO => COMBINAR EL ANÁLISIS DEL CROMOSOMA Y CON ESTUDIOS DE POLIMORFISMO AUTOSÓMICO.

Notas del editor

  1. 1
  2. 2
  3. 3
  4. 4
  5. 5
  6. 6
  7. 7
  8. 8
  9. 9
  10. 10
  11. 11
  12. 12
  13. 13
  14. 14
  15. 15
  16. 16
  17. 17
  18. 18
  19. 19
  20. 20
  21. 21
  22. 22
  23. 23
  24. 24
  25. 25
  26. 26
  27. 27
  28. 28
  29. 29
  30. 30
  31. 31
  32. 32
  33. 33
  34. 34
  35. 35
  36. 36
  37. 37
  38. 38
  39. 39
  40. 40
  41. 41
  42. 42
  43. 43
  44. 44
  45. 45
  46. 46
  47. 47
  48. 48
  49. 49
  50. 50
  51. 51
  52. 52
  53. 53
  54. 54
  55. 55
  56. 56
  57. 57
  58. 58
  59. 59
  60. 60
  61. 61
  62. 62
  63. 63
  64. 64
  65. 65