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la hidrofóbica BF0, inserta en la membrana citoplásmica, y la BF1 a modo de tallo que se proyecta hacia el interior celular.
La porción BF0 forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H+ desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera.
La porción BF1 es la parte enzimáticamente activa del complejo.
Esencialmente, el mecanismo consiste en que la disipación del gradiente de protones a través de BF0 suministra la energía para la síntesis de ATP por parte de la BF1. La reacción se puede expresar así:
2H+ (ext) + ADP (int) + P (int) → 2H+ (int) + ATP (int) + H2O (ext)
El balance final del funcionamiento de la c.t.e. es:
DH2(int) + A(int) + ADP(int) + P(int) → D(int) + AH2 + ATP(int) + H2O (ext)
El esquema anterior hace referencia al funcionamiento de una cadena transportadora con un solo bucle translocador de protones. Pero en la realidad las c.t.e. suelen poseer más de uno de estos bucles.
Véase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP.
Véase también la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O2 como aceptor final de electrones. En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas bacterianas:
En los quimiolitotrofos, la c.t.e. respiratoria funciona en los dos sentidos:
en su sentido "normal", ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede electrones, que llegan a la c.t.e., que crea un gradiente de protones, cuya disipación a través de ATP-asa genera ATP;
pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH2O]. Este NADPH lo logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la c.t.e., usando para ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal.
Cadenas de electrones ramificadas:
Muchas cadenas respiratorias aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para minimizar los efectos nocivos de otros.
Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno, usa una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el](https://image.slidesharecdn.com/microbio1-141003092046-phpapp01/85/microbilogia-de-bacterias-anaerobicas-80-320.jpg)
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IV. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN
Los organismos fotosintéticos usan energía de la luz para convertir el CO2 en material celular,
según la fórmula general:
2 H2A + CO2 energía de luz (hv)
[CH2O] + H2O + 2 A
En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto,
al oxidarse se genera O2.
En Anoxifotobacterias el reductor exógeno ("H2A") puede ser H2, S=, S2O3
-, etc.
Tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Como
veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a
partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica.
En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de
agente oxidante externo.
Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.),
que a su vez puede convertirse en ATP.
No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO2.
En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H2A)
servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o
NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO2 hasta materia orgánica.
Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP.
4.1. COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO.
Fotosistemas: Catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en
moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están
constituidos por complejo antena y centro de reacción.
Cadenas transportadoras de electrones: Estas cadenas están ligadas de forma
estrecha al centro de reacción, y crean una f.p.m.
Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente
las principales moléculas implicadas:
A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg++
pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción.
Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del
complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a
proteínas, de modo que en este estado actúan como "trampas" para los cuantos de
luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que
se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su
estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0
' negativo, por lo que
entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.](https://image.slidesharecdn.com/microbio1-141003092046-phpapp01/85/microbilogia-de-bacterias-anaerobicas-83-320.jpg)
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El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el capítulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.
Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de transiciones T = A a C = G.
5.4.2. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS.
Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:
1. Mecanismos prerreplicativos:
a. reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación directa del daño en sí.
b. reparación por escisión y resíntesis.
2. Mecanismos posreplicativos:
a. reparación por recombinación.
b. reparación inducible de emergencia (SOS).
A) Reparación fotoenzimática
Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos):
flavina reducida (FADH2)
una pterina.
Mecanismo
1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( = 300- 500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, no está claro cuál es su papel exacto.
No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparación está muy extendida entre eucariotas.](https://image.slidesharecdn.com/microbio1-141003092046-phpapp01/85/microbilogia-de-bacterias-anaerobicas-107-320.jpg)
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B) Reparación por escisión-resíntesis.
La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.
Mecanismo:
1. Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hélice.
2. Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster "a la izquierda" del dímero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º enlace fosfodiéster "a la derecha" (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes.
4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que se había generado en la fase anterior.
5. Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración del enlace fosfodiéster del lado 5').
C) Reparación por recombinación.
Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y "salta" unos 1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una recombinación con la hebra parental homóloga intacta.
Mecanismo:
1. Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.](https://image.slidesharecdn.com/microbio1-141003092046-phpapp01/85/microbilogia-de-bacterias-anaerobicas-108-320.jpg)
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El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión no es total, sino que se da un nivel basal de producción de los polipéptidos correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN.
Descripción del sistema en una célula severamente dañada:
Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica (para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína RecA* (activada como proteasa) induce la proteólisis del represor LexA (rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula). Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes (llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que:
Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparación por recombinación;
Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone mejorar la reparación por escisión-resíntesis;
Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagénesis. Pero) por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error).
Hay dos hipótesis principales sobre este respecto:
1. Los genes umuD,C codificarían una nueva polimerasa de emergencia con menor fiabilidad de copia que las polimerasas habituales;
2. O bien, los productos de umuDC modificarían alguna polimerasa normal (como la ADN-Pol-III) de manera que ésta "relajaría" su capacidad correctora de pruebas (exonucleasa 3' → 5'), de modo que ante ausencia de molde, o ante un molde afectado por el daño colocaría nucleótidos "al azar", lo que sería la base de las frecuentes mutaciones.
Hay pruebas que favorecen a esta segunda hipótesis.
De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación "límite", pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones.](https://image.slidesharecdn.com/microbio1-141003092046-phpapp01/85/microbilogia-de-bacterias-anaerobicas-110-320.jpg)
Subido porYenny Ayaviri Choque
microbilogia de bacterias anaerobicas
Este documento presenta un manual de microbiología y medios de cultivo dividido en 10 capítulos. Cubre conceptos básicos de microbiología, estructura y metabolismo bacteriano, efectos de agentes físicos y químicos, técnicas de laboratorio e identificación, y descripciones detalladas de más de 50 medios de cultivo comúnmente usados.
![Catalasa,coagulasa,oxidasa(lab) [recuperado]](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/catalasacoagulasaoxidasalabrecuperado-121106145311-phpapp02-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
![Practica med 333 mayo agosto 2017 [recuperado]](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/practicamed333mayo-agosto2017recuperado-170606120823-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
microbilogia de bacterias anaerobicas
- 1. MICROBIOLOGIA Y MEDIOSDE CULTIVO PRACTICAS DE LABORATORIO Blgo. ALEJANDRO HANS RAMIREZ MUÑOZ T.M. JACQUELINE BALQUI RIVERA ICA – PERÚ
- 2. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 2
- 3. Ramirez - Balqui 3 MICROBIOLOGIA Y MEDIOS DE CULTIVO PRACTICAS DE LABORATORIO
- 4. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 4
- 5. Ramirez - Balqui 5 MICROBIOLOGIA Y MEDIOS DE CULTIVO PRACTICAS DE LABORATORIO EDICIONES CIENTIFICAS JACBARI S.R.Ltda. Av. Fernando León de Vivero. Urb. El Carmen C – 12 Ica – Perú. RUC: 10215479761 Se imprimieron 1000 ejemplares © Derechos reservados Primera Edición: Enero de 2004.
- 6. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 6
- 7. Ramirez - Balqui 7 INTRODUCCION Esta primera edición, tiene como finalidad, al igual que publicaciones similares, que el estudiante o profesional dedicado a la Microbiología cuente con un pequeño manual que facilite el trabajo de laboratorio. Esta edición, ha sido elaborada con algunos conceptos teóricos, hay también nuevas tablas, gráficos y por supuesto se han agregado nuevos medios de cultivo; por otro lado hay un reordenamiento de algunas tablas relacionadas con los discos de control y susceptibilidad antimircrobiana. La presente edición consta de siete capítulos. En el capítulo I se presentan algunos conceptos básicos de Microbiología Médica, Microscopía y de la Taxonomía bacteriana. En el capítulo II se da la teoría esencial e imprescindible para el conocimiento de las bacterias; es decir la estructura, nutrición y metabolismo bacteriano. En el capítulo III se desarrolla la teoría y metodología para una correcta desinfección y esterilización, los agentes físicos y químicos y su acción sobre las bacterias. En este mismo capítulo se ha comprendido lo más esencial sobre antibióticos, como son su clasificación y su valoración. En el capítulo IV se da el fundamento teórico y se desarrollan las técnicas para la colaboración bacteriana; de la misma manera para la siembra, aislamiento y transplante de bacterias tanto aerobias como anaerobias. En el capítulo V se da el conocimiento teórico, clasificación y el correcto uso del material de laboratorio; incluyéndose además los gráficos de un gran número de estos instrumentos. En el capítulo VI se desarrolla lo concerniente a las definiciones básicas, métodos de muestreo, aislamiento e identificación de microorganismos en los alimentos; incluyéndose la moderna técnica de placa petrifilm. Finalmente el VII y último capítulo trata de los medios de cultivo, razón de ser del presente manual. Se desarrolla en cada uno de éstos su fundamento, composición, preparación e interpretación. Solamente un adecuado empleo de los medios de cultivo permitirá un correcto diagnóstico bacteriano. Ica, Septiembre del 2003
- 8. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 8
- 9. Ramirez - Balqui 9 CONTENIDO Pág. Introducción CAPITULO I. CONCEPTOS E HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA. Introducción al concepto y contenido de la microbiología………………….. 16 Desarrollo histórico de la microbiología………………………………………. 17 Objeto de estudio de la microbiología………………………………………… 43 CAPITULO II. MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y TAXONOMIA BACTERIANA. Microbiología Médica…………………………………………………………… Microscopía……………………………………………………......................... Taxonomía bacteriana. Categorías taxonómicas………….......................... Cepas o clones. Biotipos……………………………………........................... Nomenclatura de las bacterias………………………………………………… Patogenicidad y virulencia……………………………………………………... Métodos inmunológicos en microbiología clínica……………………………. Métodos moleculares en microbiología clínica………………………………. Bacterias de interés médico (clasificación según Bergey).......................... Bacterias de interés industrial……………………………….......................... CAPITULO III. INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA El ciclo del diagnóstico…………………………………………………………. Virulencia de los microorganismos……………………………………………. Toma de muestra……………………………………………………………….. Transporte de muestras………………………………………………………... Recepción de muestras y observaciones preliminares……………………... Examen microscópico………………………………………………………….. Procesamiento de los cultivos………………………………………………….
- 10. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 10 Interpretación de los cultivos…………………………………………………... Informe de resultados…………………………………………………………. Seguridad en el laboratorio……………………………………………………. Controles de calidad……………………………………………………………. CAPITULO IV. ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO. Estructura bacteriana. Pared celular………………………………………….. Bacterias grammpositivas……………………………………………………… Bacterias grammnegativas…………………………………………………….. Bacterias ácido alcohol resistentes…………………………......................... Bacterias sin pared celular……………………………………………………. Cápsula bacteriana……………………………………………………………... Flagelo bacteriano…………………………………………….......................... Formas de las bacterias………………………………………………………... Tamaño de las bacterias……………………………………………………….. Crecimiento bacteriano…………………………………………………………. Nutrición bacteriana…………………………………………………………….. Tipos tróficos de las bacterias…………………………………………………. Condiciones fisicoquímicas que influyen en el crecimiento bacteriano....... Metabolismo bacteriano………………………………………………………... Catabolismo o reacciones energéticas……………………........................... Anabolismo o reacciones biosintéticas……………………………………….. CAPITULO V: EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS BACTERIAS. Introducción: Efecto de los factores ambientales sobre las bacterias………………………………………………………………... Efecto de la Temperatura…………………………………………….. Liofilización…………………………………………………………….. Desecación…………………………………………………………….. Efecto de las radiaciones sobre las bacterias……………………... Efecto de las ondas sonoras…………………………………………. Efectos de la presión hidrostática…………………………………… Efectos de la presión osmótica………………………………………. Efectos del pH…………………………………………………………. CAPITULO VI: ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS
- 11. Ramirez - Balqui 11 BACTERIAS. Conceptos generales…………………………………………………………… Desinfectantes y antisépticos………………………………………………….. Tipos de desinfectantes………………………………………………………… Quimioterápicos de síntesis y antibióticos.…………………………………... Qumioterápicos de síntesis……………………………………………………. Antibióticos………………………………………………………………………. Resistencia Bacteriana a los antibióticos…………………………………….. Bases genéticas de la resistencia…………………………………………….. Mecanismos bioquímicos………………………………………………………. CAPITULO VII. COLORACION, SIEMBRA, AISLAMIENTO Y TRANSPLANTE DE BACTERIAS. Coloraciones bacterianas………………………………………………………. Coloración Gram………………………………………………………………… Coloración Ácidos Resistente (tinción de Ziehl – Neelsen)………………… Coloración de cápsulas. Métodos de Hiss…………………………………… Siembra, aislamiento y transplante de bacterias…………………................ Aislamiento de bacterias aerobias en placas de Agar……………………… Métodos de siembra o transplante de bacterias aerobias en tubos………. Aislamiento de microorganismos anaerobios………………………………... CAPITULO VIII. INSTRUMENTACION, PROCEDIMIENTOS Y TECNICAS DE LABORATORIO. Normas de seguridad en el laboratorio de Microbiología………………….. Material de laboratorio. Material de vidrio y otros…………………………… Equipos de laboratorio………………………………………………................ Limpieza del material de laboratorio y su esterilización…………................ Láminas ilustradas de los instrumentos y equipos de laboratorio…………. CAPITULO IX. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS. Definiciones................................................................................................. Tipos de análisis a que pueden someterse los diferentes productos.......... Métodos de muestreo…………………………………………………………... Preparación y dilución de las muestras de alimentos………………………. Numeración de microorganismos aerobios, mesófilos viables…................ Numeración de Coliformes. Determinación del Número Mas Probable (NMP)……………………………………………………………………………..
- 12. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 12 Numeración de Coliformes fecales. Determinación del NMP……………… Detección de Salmonella……………………………………………................ Numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positivo……………….. Prueba de la Coagulasa………………………………………………………... Prueba de la Termonucleasa………………………………………………….. Aislamiento e identificación del Vibrio cholerae……………………………... Técnica de la placa Petrifilm en recuento de E. coli y Coliformes………… Técnica de placa Petrifilm para recuento rápido de S. aureus.................... CAPITULO X. MEDIOS DE CULTIVO. Medios de Cultivo. Preparación, esterilización y conservación……………. Clasificación de los Medios de Cultivo……………………………………….. Medios de transporte…………………………………………………………… Algunas pruebas en relación con el metabolismo bacteriano…………….. Relación de las bacterias con el oxígeno…………………………………….. Prueba de oxidación – Fermentación de Hugo – Leifson………................. Bacterias fermentativas………………………………………………………… Reacciones de la oxidasa……………………………………………………… Reacción de la catalasa………………………………………………………... Reducción de los Nitratos……………………………………………………… Reacciones del Rojo Metilo y de Voges – Proskauer……………................ Reacciones basadas en el Catabolismo……………………………………… Productos resultantes de los procesos Anabólicos…………………………. Microbiología para pruebas del laboratorio clínico………………………….. Detección de microorganismos productores de enfermedades…………… Cultivo de sangre……………………………………………………………….. Microbiología para el análisis de agua y aguas residuales......................... Microbiología para alimentos y bebidas alcohólicas………………………… Microbiología para productos lácteos………………………………………… MEDIOS DE CULTIVO Agar Almidón…………………………………………………………................ Agar Anaeróbico (Brewer)……………………………………………………… Agar Azida Sangre (Agar base con sangre y azida)………………………… Agar Baird – Parker (Agar selectivo para Estafilococos)…………………… Agar Bismuto Sulfito de Wilson Blair………………………………............... Agar Brolacin (Agar azul de bromo timol – lactosa – cistina)...................... Agar Brucella...............................................................................................
- 13. Ramirez - Balqui 13 Agar Catc (Agar citrato – azida – tween – carbonato base)........................ Agar Citrimide (Agar selectivo para Pseudomonas base)........................... Agar Chocolate............................................................................................ Agar Citrato de Simmons............................................................................. Agar Columbia (Agar con colistina y ácido nalidíxico)……………………… Agar Czapek Dox……………………………………………………………….. Agar Desoxicolato Citrato……………………………………………………… Agar DNAsa……………………………………………………………………… Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)…………………………………………. Agar Endo………………………………………………………………………... Agar Extracto de Malta…………………………………………………………. Agar Fenilalanina……………………………………………………………….. Agar Fosfatasa………………………………………………………………… Agar Gelatina………………………………………………………….............. Agar Hierro Tres Azucares (TSI)……………………………………………… Agar Lactosa Rojo Fenol……………………………………………............... Agar Levine (Agar de Levine con eosina y azul de metileno)……………… Agar Lisina Hierro (LIA)………………………………………………………… Agar Littman (Agar con bilis de buey de Littman)…………………………… Agar Mac Conkey……………………………………………………………….. Agar Manitol Movilidad (M – Mov.)……………………………………………. Agar Manitol Salado (AMS)…………………………………………............... Agar de Middlebrook……………………………………………………………. Agar Mosto………………………………………………………………………. Agar Mueller Hinton…………………………………………………………….. Agar Mycophil…………………………………………………………………… Agar Nutritivo (AN)……………………………………………………………… Agar Packer (AP)……………………………………………………………….. Agar Papa Dextrosa…………………………………………………................ Agar Plate Count (Agar peptona de caseína – glucosa – extracto de levadura)………… Agar para cultivo de Microensayo……………………………………............. Agar para Enterobactereaceas (HEKTOEN)............................................... Agar para Salmonella (ÖNÖZ)………………………………………………… Agar Salmonella – Shigella (ASS)…………………………………………….. Agar Sabouraud (Agar glucosado de Sabouraud)…………………............. Agar Sangre................................................................................................. Agar Selectivo para Candida (Agar base para Candida con Verde Bromo
- 14. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 14 Cresol).................... Agar Selectivo para Clostridios.................................................................... Agar para Dermatofitos (DTM).................................................................... Agar Selectivo para Enterococos (Barnes).................................................. Agar Selectivo para Estreptococos.............................................................. Agar Selectivo para Estafilococos Nº 110 (Chapman)................................ Agar Selectivo para Yersinia....................................................................... Agar Sulfito.................................................................................................. Agar Thayer – Martin................................................................................... Agar Tiosulfato – Citrato – Bilis – Sucrosa (TCBS)..................................... Agar Verde Brillante (Kauffman) (Agar verde brillante – rojo de fenol – lactosa)...................... Agar Violeta Cristal – Rojo Neutro – Bilis (VRVA)………………….............. Agar Xilosa – Lisina y Desoxicolato (XLD).................................................. Agua Peptonada………………………………………………………………… Agua Peptonada Tamponada………………………………………................ Caldo Brila (Caldo verde brillante – bilis – lactosa)…………………………. Caldo Cianuro…………………………………………………………………… Caldo de Enriquecimiento para Salmonella (Rappaport)…………………… Caldo de Enriquecimiento para Vibrio cholerae…………………………….. Caldo Hajna para Gramnegativos……………………………………………. Caldo Extracto de Malta………………………………………………………... Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI)……………………………………….. Caldo Lactosado………………………………………………………………… Caldo Lauril Triptosa……………………………………………………………. Caldo Malonato………………………………………………………................ Caldo Manitol Salado…………………………………………………………… Caldo Mosto……………………………………………………………………... Caldo Nitrato…………………………………………………………………….. Caldo Nutritivo…………………………………………………………………… Caldo Peptonado………………………………………………………………... Caldo Selenito…………………………………………………………………… Caldo Tetrationato Base……………………………………………………….. Caldo Tioglicolato (Medio Alternativo de la USP)…………………………… Caldo Triptosa………………………………………………………………….. Caldo Urea……………………………………………………………............... Discos Bactrol (Discos de control y susceptibilidad antimicrobiana)……… Medio Base para Fermentación de Azúcares y Alcoholes………………….
- 15. Ramirez - Balqui 15 Medio de Loefler (suero sanguíneo de Loefler)……………………………… Medio de Lowenstein – Jensen para Micobacterias………………………… Medio de Hugo y Leifson (Medio basal para oxidación y fermentación)….. Medio Gelatina Tioglicolato…………………………………………................ Medio Kliger Iron Agar (KIA) (Agar hierro dos azúcares)…………………... Medios Microbiológicos: Agar Micológico, Agar Micológico con bajo pH, Caldo – Micológico y Caldo Micológico con bajo pH Medio para Movilidad – Indol – Orinitina…………………………………….. Medio para Movilidad con Infusión de Gelatina……………………………… Medio para Decarboxilasa de Arginina – Lisina – Ornitina…………………. Medio para Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskauer (MR – VP)……. Medio SIM (Medio para sulfuro, Indol y Movilidad)………………................ Prueba de la Beta – Galactosidasa (ONPG)………………………………… Prueba de la Citocromo – Oxidasa……………………………………………. ANEXOS: Tabla 32: Diferenciación de Enterobacteriaceaes mediante pruebas bioquímicas……………………………………………………………………… Tabla 33: Pruebas claves para la identificación de las especies con mayor significado clínico……………………………………………………….. Tabla 34: Identificación presuntiva de los estreptococos………… ………. Tabla 35: Diferenciación de los cocos grampositivos catalasa negativos.. Tabla 36: Características diferenciales de las especies Neisseria aisladas frecuentemente……………………………………………………….. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
- 16. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 16
- 17. Ramirez - Balqui 17 CAPITULO I CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA. I Inttrroducciión all conceptto y contteniido de lla miicrrobiiollogíía.. Desarrrrollllo hiisttórriico de lla miicrrobiiollogíía.. Objjetto de esttudiio de lla miicrrobiiollogíía..
- 18. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 18
- 19. Ramirez - Balqui 19 CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA I. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA. La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. Precisamente, el origen tardío de la Microbiología con relación a otras ciencias biológicas, y el reconocimiento de las múltiples actividades desplegadas por los microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos y técnicas pertinentes. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 años su progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos microbianos, y a los primeros intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas naturales" de los Reinos Animal y Vegetal. El asentamiento de la Microbiología como ciencia está estrechamente ligado a una serie de controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religión de la época), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La resolución de estas polémicas dependió del desarrollo de una serie de estrategias experimentales fiables (esterilización, cultivos puros, perfeccionamiento de las técnicas microscópicas, etc.), que a su vez dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constituyó el núcleo aglutinador de la ciencia microbiológica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generación espontánea, y el triunfo de la teoría germinal de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturaleza a la joven Microbiología en el cambio de siglo. Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Química, que le aportaría varios avances metodológicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudios básicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metabólicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la nutrición de las plantas, logró hacer ver la ubicuidad ecológica y la extrema diversidad fisiológica de los microorganismos. De esta forma, se establecía una cabeza de puente entre la Microbiología y otras ciencias biológicas, que llegó a su momento decisivo
- 20. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 20 cuando se comprobó la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostró, con material y técnicas microbiológicas que la molécula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un íntimo y fértil intercambio entre la Microbiología, la Genética y la Bioquímica, que se plasma en el nacimiento de la Biología Molecular, base del espectacular auge de la Biología desde mediados de este siglo. Por otro lado, el "programa" inicial de la Microbiología (búsqueda de agentes infectivos, desentrañamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador) condujeron a la creación de ciencias subsidiarias (Virología, Inmunología) que finalmente adquirieron su mayoría de edad y una acentuada autonomía. Por último, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creación de la Microbiología, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigación básica, y hoy muestra una impresionante "hoja de servicios" y una no menos prometedora perspectiva de expansión a múltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades infecciosas (higiene, vacunación, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento económico racional de los múltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos (biotecnologías). Así pues, la sencilla definición con la que se abrió este apartado, escondía todo un cúmulo de contenidos y objetos de indagación, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse a la porción de realidad que la Microbiología tiene encomendada. En las próximas páginas ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho rápida referencia. Realizaremos un recorrido por su el desarrollo de la Microbiología a lo largo de su historia, que nos permitirá una visión concreta de algunos de sus característicos modos de abordar su objeto de estudio; finalmente, estaremos en disposición de definir este último, desglosado como objeto material y formal. II. DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA. La Microbiología, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodológicos que se habían empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisión de ideas y prejuicios seculares sobre la dinámica del mundo vivo. Siguiendo el ya clásico esquema de Collard (l976), podemos distinguir cuatro etapas o periodos en el desarrollo de la Microbiología: a) Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigüedad hasta llegar a los primeros microscopistas. b) Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde l675 aproximadamente hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por Leeuwenhoek (l675). c) Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de cristalizar a la Microbiología como ciencia experimental bien asentada.
- 21. Ramirez - Balqui 21 d) Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros días), en el que los microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiológica, bioquímica, genética, ecológica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiología, el surgimiento de disciplinas microbiológicas especializadas (Virología, Inmunología, etc.), y la estrecha imbricación de las ciencias microbiológicas en el marco general de las Ciencias Biológicas. A continuación se realiza un breve recorrido histórico de la disciplina microbiológica, desglosando los períodos 3º y 4º en varios apartados temáticos. 2.1. PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO. Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debió aguardar hasta el último tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la producción de bebidas alcohólicas, pan y productos lácteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas. Diversas fuentes escritas de la antigüedad griega y romana hablan de gérmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De rerum natura" hace varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice que las enfermedades contagiosas se deben a "gérmenes vivos" que pasan de diversas maneras de un individuo a otro. Estos inicios de explicación que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introducción en Europa de la sífilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la "cosa" que se transmite en la enfermedad siguió siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo. 2.2. EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS. Ya en el siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los objetos. En el siglo XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física óptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicación inmediata. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones "microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna repercusión. La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a Constantijn Huygens, quien relata que el inglés Cornelis Drebbel tenía en su taller un instrumento magnificador, que recibió el nombre de microscopium en l625, en la Accademia dei Lincei, de Roma. El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holandés de tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su pasión por pulir y montar lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a descuidar sus negocios. Fabricó unos cuatrocientos microscopios simples, con los que llegó a obtener aumentos de casi 300 diámetros. En 1675 descubrió que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó "animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la
- 22. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 22 Microbiología". Durante varias décadas Leeuwenhoek fue comunicando sus descubrimientos a la Royal Society de Londres a través de una serie de cartas que se difundieron, en traducción inglesa, en las "Philosophical Transactions". Sus magníficas dotes de observador le llevaron asimismo a describir protozoos (como Giardia, que encontró en sus propias heces), la estructura estriada del músculo, la circulación capilar, a descubrir los espermatozoides y los glóbulos rojos (por lo que también se le considera el fundador de la Histología animal), así como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percató de la abundancia y ubicuidad de sus animálculos, observándolos en vinagre, placa dental, etc. Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron interés al ser comunicados, pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Además, la fabricación de lentes sencillas de gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso. Simultáneamente el inglés Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios compuestos, describió los hongos filamentosos (1667), y descubrió la estructura celular de las plantas (Micrographia, 1665), acuñando el término célula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de los "animálculos" languideció durante casi 200 años, debido a sus imperfecciones ópticas, hasta que hacia 1830 se desarrollaron las lentes acromáticas. 2.3. EL DEBATE SOBRE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA. La autoridad intelectual de Aristóteles por un lado, y la autoridad moral representada por la Biblia, por otro, junto con las opiniones de escritores clásicos como Galeno, Plinio y Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura médica en la Edad Media y Renacimiento, dieron carta de naturaleza a la idea de que algunos seres vivos podían originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de materiales en putrefacción. Esta doctrina de la "generatio spontanea" o abiogénesis, fue puesta en entredicho por los experimentos de Francesco Redi (1621-1697), quien había acuñado la expresión "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los insectos y nematodos procedían de huevos puestos por animales adultos de su misma especie. Demostró que si un trozo de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no podían depositar allí sus huevos, no aparecían "gusanos", que él correctamente identificó como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de Redi tuvieron el efecto de desacreditar la teoría de la generación espontánea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los recién descubiertos "animálculos", de modo que aunque se aceptó la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no todos estaban dispuestos a admitir el más amplio "Omne vivum ex vivo" aplicado a los microorganismos. Hubo que esperar un siglo más hasta que una serie de naturalistas recomenzaran el ataque a la teoría preformacionista. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una disputa con J.T. Needham (1713-1781) en la que el primero demostró que los "infusorios" no aparecían en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas
- 23. Ramirez - Balqui 23 durante tiempo suficiente a ebullición en frascos herméticamente cerrados, pero volvían a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. Sin embargo los preformacionistas no se daban por vencidos; el mismo Needham, recogiendo una idea ya expresada por Huygens, amigo de Leeuwenhoek, replicó -con argumentos vitalistas muy propios de la época- que el calor había destruido la "fuerza vegetativa" de las infusiones y había cambiado la "cualidad" del aire dentro de los frascos. Durante el primer tercio del siglo XIX la doctrina de la arquegénesis o generación espontánea recibió un último refuerzo antes de morir, debido por un lado a razones extracientíficas (el auge del concepto de transmutación producido por la escuela de la filosofía de la naturaleza), y por otro al descubrimiento del oxígeno y de su importancia para la vida, de modo que los experimentos de Spallanzani se interpretaron como que al calentarse las infusiones, el oxígeno del aire se destruía, y por lo tanto desaparecía la "fuerza vegetativa" que originaba la aparición de microorganismos. Theodor Schwann (1810-1882) presentó en 1836 un método seguro para refutar la teoría abiogénica: calentó maceraciones en frascos a los que se había eliminado previamente el aire, pero no continuó trabajando en esta línea. Para complicar más las cosas, la publicación de "Sobre el origen de las especies" por Darwin en 1859, fue utilizada por algunos preformacionistas para apoyar sus argumentos. El mismo Haeckel, en una fecha tan tardía como 1866, se mostraba escéptico ante las pruebas aportadas por Pasteur. Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asestó el golpe definitivo y zanjó la cuestión a favor de la teoría biogénica. En un informe a la Académie des Sciences de París, en 1860 ("Expériences rélatives aux générations dites spontanées") y en escritos posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calentó infusiones en matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, haciéndolo largo, estrecho y sinuoso, y dejándolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el aire; tras esta operación demostró que el líquido no desarrollaba microorganismos, con lo que eliminó la posibilidad de que un "aire alterado" fuera la causa de la no aparición de gérmenes. Antes bien, comprobó que los gérmenes del aire quedaban retenidos a su paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del recipiente donde se encontraba la infusión, quedando ésta estéril indefinidamente. Sólo si se rompía el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de líquido a la porción de cuello, los gérmenes podían contaminar la infusión y originar un rápido crecimiento. En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cómo se pueden capturar los "cuerpos organizados" del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapón de algodón como filtro, y la manera de recuperarlos para su observación microscópica. De esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la Edad de Oro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista.
- 24. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 24 Los últimos escépticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall (1820-1893) aplicó su sistema de esterilización por calentamiento discontinuo (hoy conocida precisamente como tindalización), que evidenció la existencia de formas microbianas de reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco más tarde por Ferdinand Cohn al descubrir las esporas bacterianas. 2.4. EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS. Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar pasa a alcohol etílico y dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, había realizado importantes confirmaciones a la "teoría mineral" sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la "teoría del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microscópicas, se suponía que los procesos de fermentación y putrefacción se debían a fenómenos químicos de descomposición y muerte encuadrables en el marco de la teoría mineral de la fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se podía explicar en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de estos fenómenos a células vivas. Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de los cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen orgánico) quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostró que los agentes de la fermentación láctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur identificó distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y destilerías. Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de oxígeno.
- 25. Ramirez - Balqui 25 Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradación total de las correspondientes sustancias. Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de realizar la misma transformación de "fermentación" que las células vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y biológico: las fermentaciones eran procesos químicos catalizados por enzimas presentes dentro de células vivas, que podían ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica, nacida como una rama de la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología, encontró una alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología. 2.5. LOS AVANCES TÉCNICOS. La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo XIX, mantenía que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. A estas ideas se oponían frontalmente investigadores como Koch, Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfológica y fisiológica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El pleomorfismo había surgido como una explicación a la gran variedad de formas y actividades que aparecían en un simple frasco de infusión, pero ya Pasteur, en sus estudios sobre la fermentación, se había percatado de que los cultivos que aparecían podían considerarse como una sucesión de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composición de la comunidad microbiana. La solución definitiva a esta cuestión dependía, de nuevo, de un desarrollo técnico, que a su vez iba a suministrar una de las herramientas características de la nueva ciencia: los métodos de cultivo puro. Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, quien logró aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que existía una sola célula. Pero la técnica era larga y tediosa y, además, normalmente sólo se lograban aislar células del tipo bacteriano más abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvió para confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de las fermentaciones. Por aquella época Koch buscaba con ahínco métodos más sencillos de cultivo puro, indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patógenas. Primero (y quizá de forma un tanto casual) empleó rodajas de patata como sustrato sólido nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macroscópicas de bacterias que presentaban morfología característica, que Koch interpretó como resultantes del crecimiento a partir de células individuales. Pero enseguida recurrió a compactar el
- 26. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 26 típico caldo de cultivo a partir de carne (diseñado por Loeffler) añadiéndole gelatina (1881). El medio sólido así logrado era transparente, lo que permitía visualizar fácilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Éstas eran inoculadas en la superficie del medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la técnica de siembra en estría. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusión; ambos problemas se solventaron cuando en 1882 el médico alemán Walter Hesse, siguiendo una sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un ayudante de Koch, sustituyó las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas, usadas hasta entonces para los cultivos sólidos, por un sistema manejable de placas de cristal planas, que se conoce como cajas de Petri. El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros años del siglo XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y poseedoras de características fisiológicas distintivas (quimioautótrofas, fijadoras de nitrógeno, etc.). Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de selección natural, se diseñan de forma que su composición química definida favorezca sólo el crecimiento de ciertos tipos fisiológicos de microorganismos, únicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio. Otra importante aportación a este "período de cultivo" dentro del desarrollo de la Microbiología surgió del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta algún rasgo bioquímico o metabólico, lo que contribuye a la identificación microbiana. Fue Würtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los medios, lo cual permitía revelar la producción de acidificaciones por fermentación en ciertas bacterias. Mientras tanto, en la ciudad de Jena se había creado una atmósfera de progreso donde confluían grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger o Abbé interaccionando con una pujante editorial especializada en Biología y Medicina (Gustav Fischer) y con una poderosa industria óptica y química. Estas influencias recíprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria óptica de Abbé y Zeiss, que se mantenía en conexión con la compañía vidriera Schott, pudo satisfacer la necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acromáticas y una iluminación inferior provista de condensador. El mismo Abbé desarrolló en 1878 el objetivo de inmersión en aceite. Por otro lado, la industria química BASF, que por aquella época se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos colorantes, suministró al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que teñían las bacterias permitiendo su fácil visualización al microscopio en frotis de tejidos infectados. En 1875 Carl Weigert tiñó bacterias con pirocarmín, un colorante que ya
- 27. Ramirez - Balqui 27 venía siendo usado desde hacía unos años en estudios zoológicos. En años sucesivos se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su método de ácido-alcohol resistencia para teñir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece una tinción de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en función de sus reacción diferencial de tinción y que, como se vería mucho más tarde, reflejaba la existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su técnica de impregnación argéntica. Como veremos más adelante, la misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva también para los comienzos de la quimioterapia. Estas innovaciones técnicas (métodos de cultivo, microscopía y tinciones) fueron fundamentales (junto con los sistemas de esterilización abordados en el anterior apartado) para la consolidación de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulación que hasta entonces habían predominado. 2.6. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES. Durante el siglo XIX la atención de muchos naturalistas se había dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que vivían como parásitos de otros organismos. Este interés se redobló tras la publicación de los libros de Darwin, estudiándose las numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parásitos habían adquirido en su peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicación de propiedades de parásitos a los microorganismos vino del campo médico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el origen germinal de las enfermedades infecciosas. En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostró que cierta enfermedad del gusano de seda (mal di segno), que había hecho su aparición en Lombardía, se debía a un hongo (Botrytis bassiana). Cuatro años más tarde J.L. Schönlein descubrió la asociación de un hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la escuela fisiológica de Johannes Müller, planteó la teoría de que las enfermedades infecciosas están causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmación de estas ideas tuvo que esperar a que la intervención de Pasteur demostrara la existencia de microorganismos específicos responsables de enfermedades. Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenzó a diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando finalmente a China y Japón. A instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur aceptó el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se había enfrentado con un problema de patología. Es más que probable que Pasteur viera aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones podían tener una extensión hacia los procesos fisiológicos del hombre y de los animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extraño, creyendo durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiológicas.
- 28. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 28 Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extraídas, inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de medidas de control, ésta comienza a remitir de modo espectacular. La intervención de bacterias como agentes específicos en la producción de enfermedades fue descubierta a raíz de una serie de investigaciones sobre el carbunco o ántrax, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. C. Davaine, entre 1863 y 1868, encontró que en la sangre de vacas afectadas aparecían grandes cantidades de microorganismos a los que llamó bacteridios; además, logró inducir la enfermedad experimentalmente en vacas sanas, inoculándoles muestras de sangre infectada. En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en 1876, el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas, fijadas y teñidas con azul de metileno. Más tarde (1881), Koch y sus colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y más resistentes que éstos a una variedad de agentes. Pero más fundamental fue su demostración de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculándoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios líquidos. Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue llevado a una ulterior perfección en 1882, con la publicación de "Die Äthiologie der Tuberkulose", donde se comunica por primera vez la aplicación de los criterios que Henle había postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de Koch, son los siguientes: a) El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos. b) El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro. c) La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión. d) El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma experimental. Fue asimismo Koch quien demostró el principio de especificidad biológica del agente infeccioso: cada enfermedad infecciosa específica está causada por un tipo de bacteria diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiología Médica sobre firmes bases científicas. Durante las dos décadas siguientes la Microbiología experimentó una auténtica edad de oro, en la que se aislaron y caracterizaron muchas bacterias patógenas. La Alemania del Reich, que a la sazón se había convertido en una potencia política y militar, se
- 29. Ramirez - Balqui 29 decidió a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de Koch, dada su enorme importancia social y económica, creando un Instituto de investigación, siendo Koch su director en el Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se aislaron los agentes productores del cólera asiático (Koch, 1883), de la difteria (Loeffler, 1884), del tétanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato, 1889), de la neumonía (Fraenkel, 1886), de la meningitis (Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sífilis (Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron desentrañar los ciclos infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia colonial se encontró en ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del sueño (Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al inglés Bruce, 1895-1897), etc. 2.7. DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y NTIBIOTERAPIA. Los avances de las técnicas quirúrgicas hacia mediados del siglo XIX, impulsados por la introducción de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones post-operatorias derivadas de infecciones. Un joven médico británico, Joseph Lister (1827-1912), que había leído atentamente los trabajos de Pasteur, y que creía que estas infecciones se debían a gérmenes presentes en el aire, comprobó que la aplicación de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del instrumental quirúrgico, de las manos y de las heridas, disminuía notablemente la frecuencia de infecciones post-quirúrgicas y puerperales. Más tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que había venido empleando distintas sustancias para teñir células y microorganismos, y que conocía bien el efecto de tinción selectiva de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a células animales, concibió la posibilidad de que algunos de los compuestos de síntesis que la industria química estaba produciendo pudieran actuar como "balas mágicas" que fueran tóxicas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibió un programa racional de síntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de éstas en infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de Koch, probó sistemáticamente derivados del atoxilo (un compuesto que ya Thompson, en 1905, había mostrado como eficaz contra la tripanosomiasis), y en 1909 informó de que el compuesto 606 (salvarsán) era efectivo contra la sífilis. Aunque el salvarsán presentaba algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el único agente disponible contra enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvió para ilustrar brillantemente la validez del enfoque de la llamada quimioterapia (término acuñado por el mismo Ehrlich), de modo que encauzó toda la investigación posterior. En 1927 Gerhard Domagk, en conexión con la poderosa compañía química I.G. Farbenindustrie, inició un ambicioso proyecto de búsqueda de nuevos agentes quimioterápicos, siguiendo el esquema de Ehrlich; en 1932-1935 descubre la acción del rojo de prontosilo frente a neumococos hemolíticos dentro del hospedador, pero señala que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La explicación la suministra el matrimonio Tréfouël, del Instituto Pasteur, al descubrir que la actividad antibacteriana depende de la conversión por el hospedador en sulfanilamida. El mecanismo de acción de las sulfamidas (inhibición competitiva con el ácido para- aminobenzoico) fue dilucidado por el estadounidense Donald D. Woods. Las
- 30. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 30 investigaciones de éste encaminaron a la industria farmacéutica hacia la síntesis de análogos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque más racional frente a la época anterior, más empírica. En 1874, el médico inglés W. Roberts había descrito las propiedades antibióticas de ciertos cultivos de hongos (Penicillium glaucum) contra las bacterias, e introdujo en Microbiología el concepto de antagonismo. Otros investigadores de finales del siglo XIX realizaron observaciones similares, pero fue Fleming quien, en 1929, logró expresar ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia química concreta (la penicilina) la acción inhibidora sobre bacterias producida por el hongo Penicillium notatum. Fleming desarrolló un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados, pudiendo seguir su producción a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las dificultades técnicas para su extracción, junto al hecho de que el interés de la época aún estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificación de la penicilina, que no llegó hasta los trabajos de Chain y Florey (1940), comprobándose entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de Gram- positivas, y la ausencia de efectos tóxicos para el hospedador. Inmediatamente comenzó una búsqueda sistemática de microorganismos del suelo que mostraran actividades antibióticas. En 1944 A. Schatz y S. Waksman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de antibiótico de amplio espectro. Los diez años que siguieron al término de la segundad guerra mundial vieron la descripción de 96 antibióticos distintos producidos por 57 especies de microorganismos, principalmente Actinomicetos. En la década de los 60 se abrió una nueva fase en la era de los antibióticos al obtenerse compuestos semisintéticos por modificación química de antibióticos naturales, paliándose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que habían empezado a aparecer, disminuyéndose en muchos casos los efectos secundarios, y ampliándose el espectro de acción. Aparte de la revolución que supusieron en el campo de la aplicación clínica, los antibióticos ha permitido notables avances en el desentrañamiento de determinados aspectos de arquitectura y función moleculares de las células susceptibles (paredes celulares microbianas, ribosomas, síntesis proteica, etc.). 2.8. AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL. Gran parte de los avances en Microbiología descritos hasta ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas prácticos. Pero hacia finales del siglo XIX una serie de investigadores -algunos de ellos procedentes de áreas más clásicas de la Historia Natural- desarrollaron importantes estudios básicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metabólicas, así como su papel crucial en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos de nutrición vegetal, etc.
- 31. Ramirez - Balqui 31 El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbiólogo ruso Sergei Winogradsky (1856-1953), obligó a revisar los conceptos previos, procedentes de la Fisiología Vegetal, de que el crecimiento autotrófico dependía de la presencia de clorofila. Winogradsky había comenzado investigando las bacterias del hierro descubiertas por Cohn en 1875, observando que podían crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenían su energía de la oxidación de sales ferrosas a férricas (1888). En 1889, combinando técnicas de observación secuencial de cultivos microscópicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa, Thiothrix), infirió que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrógeno hasta azufre elemental (acumulando éste como gránulos), y luego hasta ácido sulfúrico, obteniendo de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofía llegó cuando al año siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energía obtenida de la oxidación del amonio o del nitrito era usada para fijar CO2 (1889-1890). Más tarde el mismo Winogradsky extendió la demostración a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de sílice. La explicación del proceso de oxidación de los compuestos de azufre no llegó hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades metabólicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que oxidan hidrógeno o metano (Söhngen, 1906). El químico Berthelot había señalado (1885) que los microorganismos del suelo podían incorporar nitrógeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrógeno atmosférico (Clostridium pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (1890), siendo el holandés Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria aerobia fijadora de vida libre (1901). Más tarde Beijerinck demostró por métodos químicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrógeno de la atmósfera mientras crece (1908). La importancia de la fijación de nitrógeno para la nutrición vegetal llegó con los estudios sobre bacterias formadoras de nódulos en las raíces de las leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, habían indicado que las leguminosas asimilaban nitrógeno de la atmósfera. En 1866 Voronin descubrió las bacterias de los nódulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostró que los nódulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y Ward (1887) usó bacterias procedentes de nódulos machacados para inocular semillas, logrando la producción de nódulos en suelo estéril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infección, con su producción de "hifas" (cordón de infección). Tras la introducción del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el primero en describir los nódulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estación Experimental de Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berlín, en 1886, y publicados en un artículo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus nódulos radicales, señalando que estos nódulos se inducían por microorganismos específicos; de este modo lograron una
- 32. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 32 brillante síntesis de las observaciones microbiológicas y químicas. El mismo año de 1888 Beijerinck logró el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautizó como Bacillus radicicola), observando que no reducían nitrógeno en vida libre; más tarde (1890) aportó la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiriéndose de esta forma la facultad de fijar nitrógeno en su asociación con la raíz de la planta. Irónicamente el nombre definitivo para las bacterias de los nódulos de leguminosas (Rhizobium) fue propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se había negado a reconocer los resultados de Hellriegel y Willfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijación de nitrógeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras nodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran gránulos de reserva (incluidas las que él mismo observó en plantas no leguminosas de los géneros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso cuando se convenció de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o mixomicetes), pensaba que éstas sólo estimulaban a que las plantas fijaran nitrógeno en sus hojas; su "conversión" (y aún así incompleta y con reticencias) no llegó hasta 1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relación entre su formación y la fijación de nitrógeno (Nobbe y Hiltner, 1893) completó esta primera oleada de investigación sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la Agronomía. Estos estudios están en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiología Agrícola, de modo que esta especialidad fue incorporada tempranamente a los laboratorios científicos y estaciones experimentales. Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Técnica de Delft, fue continuada por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este último el "padre" de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que formó a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructífera "colonia" en la ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continuó el trabajo emprendido junto a van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosintéticas, los tipos de organismos litotróficos, y profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiológicos de las bacterias recién descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensión de Kluyver (1961) "los hombres de la escuela de Delft de Microbiología General fueron pioneros en una época en la que la mayoría de los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosintéticos o fotosintéticos, o por aquellos que muestran fermentaciones inusuales...". Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de ciencia básica ha sido extraordinariamente fértil, y aparte de la profundización en la unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biológicas. 2.9. DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA.
- 33. Ramirez - Balqui 33 La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autónoma y madura, pero sus orígenes han estado estrechamente ligados a la Microbiología. Su objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasión por microorganismos o partículas extraños, aunque su interés se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no- propios, así como de su neutralización y degradación. Como tantas otras ciencias, la Inmunología presenta un prolongado período pre- científico, de observaciones y aproximaciones meramente empíricas. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigüedad; el historiador griego Tucídides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que éstos no volverían a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se había observado que las personas que en su niñez habían padecido la viruela no la adquirían más adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicación de estas observaciones que indicaban la inducción de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalación de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones posteriores. Una modificación fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaña por Lady Mary Wortley Montagu, esposa del embajador inglés en Constantinopla, tras una serie inicial de pruebas sobre "voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prácticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisión de otras enfermedades. El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el médico inglés Edward Jenner (1749-1823), tras su constatación de que los vaqueros que habían adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que sólo producía pústulas en las manos) no eran atacados por la grave y deformante viruela humana. En mayo de 1796 inoculó a un niño fluido procedente de las pústulas vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad. Jenner publicó sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicación de su método podría llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables. La falta de conocimiento, en aquella época, de las bases microbiológicas de las enfermedades infecciosas retrasó en casi un siglo la continuación de los estudios de Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878) lograron articular propuestas teóricas de cierto interés.
- 34. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 34 El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunológicos se debió, de nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (más tarde conocida como Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente Pasteur quien dio carta de naturaleza al término vacuna, en honor del trabajo pionero de Jenner. En los años siguientes Pasteur abordó la inmunización artificial para otras enfermedades; concretamente, estableció de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubación a 45ºC conferían inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunco. Una famosa demostración pública de la bondad del método de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gentío expectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. Años después, abordaría la inmunización contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el agente causal. Pasteur observó que éste perdía virulencia cuando se mantenían al aire durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos extractos se podían emplear eficazmente como vacunas. Realizó la primera vacunación antirrábica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el niño Joseph Meister, que había sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que valió a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su método de inmunización, que abría perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creación del Instituto Pasteur, que muy pronto reunió a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biológicas. A su vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los métodos serologicos de Pasteur, lo que les permitió producir y conservar más fácilmente sueros tipificados contra la peste porcina. A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el zoólogo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845- 1916), que había realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los fagocitos", tras estudiar fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de conejo y de humanos. Informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por medio de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explicó la inmunización como una "habituación" del hospedador a la fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los fagocitos segregan enzimas específicos, análogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo. Por otro lado, la escuela alemana de Koch hacía hincapié en la importancia de los mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (1856- 1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del tétanos y de la difteria,
- 35. Ramirez - Balqui 35 observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (más tarde conocidas como anticuerpos) que tendían a neutralizar las toxinas de forma específica, y evidenciaron que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervención de Ehrlich permitió obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una protección eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigió desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigación y Comprobación de Sueros, en Steglitz, cerca de Berlín, y, a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este último periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra científica, en la que va ahondando en la comprensión de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teoría de las cadenas laterales", en la que formula una explicación de la formación y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base química para la interacción de éstos con los antígenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reacción antígeno-anticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un suero inmune específico (Antisuero). En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente sérico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad. (Más tarde se impondría el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarrolló, en 1901, el primer sistema diagnóstico para la detección de anticuerpos, basado en la fijación del complemento, y que inició una larga andadura, que llega a nuestros días. La conciliación de las dos teorías se debió a Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagocítica de los leucocitos. El área de la inmunopatología inicia su andadura con la descripción del fenómeno de anafilaxia producido por introducción en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abriría la posibilidad de métodos de serodiagnóstico, con aplicaciones múltiples en Medicina, Zoología, y otras ciencias biológicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenómemo de hipersensibilidad) tiene relación directa con la producción de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el término de alergia para referirse a la reactividad inmunológica alterada. La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras décadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribución de importancia había sido la descripción, mediante reacciones de aglutinación, del sistema de antígenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboración con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisión hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avanzar en el desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la formación de anticuerpos. Landsteiner estudió sistemáticamente las características de inmunogenicidad y especificidad de reacción de antígenos con anticuerpos, valiéndose
- 36. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 36 de la modificación química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras. La cuestión de las reacciones antígeno-anticuerpo se convirtió en otra polémica entre escuelas hasta finales de los años 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que estas reacciones tienen una base puramente química, Bordet y sus discípulos las explicaban como fenómenos físicos de reacciones entre coloides. La resolución del debate debió aguardar hasta finales de los años 30, al incorporarse avances técnicos como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugación y el microscopio electrónico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociación de precipitados. Tiselius (1939) demostró que los anticuerpos constituyen la fracción gamma-globulínica del suero. Veinte años después R.R. Porter y G.M. Edelman establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante este lapso de tiempo se descubre que la síntesis de anticuerpos ocurre en las células plasmáticas, aunque éstas no son puestas en relación aún con los linfocitos; durante muchos años se siguió creyendo que los linfocitos eran células pasivas, sin función inmune. Por aquella época se describe, también, la diversidad de inmunoglobulinas, llegándose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los múltiples experimentos sobre timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de reconstitución de animales irradiados, con timocitos y células de la medula ósea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin. La utilización de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy. La inmunogenética nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisión hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, basándose en el análisis estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levène (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos sanguíneos, explicables según unos 300 alelos múltiples. Una contribución esencial a las ideas sobre el mecanismo de formación de los anticuerpos la realizó el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su teoría de la selección clonal; ésta argumenta que cada linfocito B sintetiza un único tipo de anticuerpo, específico para cada antígeno (determinante antigénico), de modo que la unión del antígeno causa la proliferación clonal del linfocito B, con la consecuente síntesis incrementada de anticuerpos específicos. Igualmente, Burnet lanzó una hipótesis sobre el mecanismo subyacente a la auto-tolerancia inmunológica, que fue
- 37. Ramirez - Balqui 37 confirmada experimentalmente por Peter Medawar. Más recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la selección clonal, proponiendo un modelo de regulación inmune conocido como teoría de las redes idiotípicas. Los avances en Inmunología durante los últimos años han sido espectaculares, consolidando a ésta como ciencia independiente, con su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiológico. Entre los hitos recientes hay que citar la técnica de producción de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por César Milstein y Georges Kohler en 1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentrañamiento de los fenómenos de reorganización genética responsables de la expresión de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa. 2.10. ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGÍA. La Virología ha sido la ciencia microbiológica de origen más tardío, habiendo surgido como resultado del hallazgo de enfermedades infecciosas en las que la demostración de implicación de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se vivía en los ámbitos científicos y médicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias patógenas, se plasmó en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se debía a una técnica inapropiada o mal aplicada. El botánico ruso Dimitri Iwanovski había observado (1892) que la enfermedad del mosaico del tabaco podía ser reproducida experimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandonó la investigación. Pocos años más tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del trabajo de Iwanovski, Beijerink realizó experimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrentándose a los conceptos de la época, avanzó la idea de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, según su expresión), debía de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducción. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio "virus filtrables", quedando más tarde su denominación simplemente como virus. Aquel mismo año de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901 Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su técnica de multiplicación de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous aísla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911). Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no alcanzó la elegancia y claridad del desarrollado poco más tarde por el canadiense Félix d'Hérelle (1917); fue éste quien acuñó el término bacteriófago, y supuso correctamente que el fenómeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicación de los fagos como elementos
- 38. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 38 bactericidas para uso médico no pudo satisfacerse, la contribución de los virus bacterianos al avance de la genética y biología moleculares ha sido decisiva: de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicación virásica se realizaron sobre fagos de Escherichia coli, lo que suministró modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el fenómeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisogénico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de André Lwoff (1950). La primera visualización de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacteriólogo inglés Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera fotografía de un virus a microscopio electrónico. Pero los avances más significativos en el estudio de la composición y estructura de los virus se inician con la purificación y cristalización, por Wendell M. Stanley, del virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935), aplicando procedimientos típicos de la cristalización de enzimas. Inicialmente Stanley comprobó que el TMV contenía gran proporción de proteína, pero poco más tarde detecta, además, la presencia de ácido nucleico. A partir de aquí, la Virología entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y genetistas, en un esfuerzo interdisciplinario que da origen a la moderna Biología Molecular. Un importante avance metodológico para el estudio de los virus animales se debió a Enders, Weller y Robbins (1949), al desarrollar por primera vez un método para la multiplicación virásica sobre cultivos de tejidos de mamíferos, técnica que fue perfeccionada más tarde por el equipo de Renato Dulbecco. Los recientes progresos en las numerosas técnicas de biología molecular han propiciado una auténtica explosión de descubrimientos sobre la biología de los virus y de sus células hospedadoras; baste citar la replicación del genomio de ARN de los retrovirus por reversotranscripción a ADN, los fenómenos de transformación oncogénica virásica y su aplicación a los estudios generales del cáncer, el diseño de vacunas recombinantes por manipulación in vitro de genomios virásicos, la próxima aplicación clínica de la primeras terapias génicas en humanos recurriendo a vectores virásicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología existente ha permitido la rápida identificación y caracterización del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se está traduciendo en una intensa y racional búsqueda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de SIDA. En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvirásicas: T.O. Diener describió en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos en plantas, a los que llamó viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas aparentemente desprovistas de material genético, a las que bautizó como priones. 2.11. RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS BIOLÓGICAS. El auge de la microbiología desde finales del siglo XIX se plasmó, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que
- 39. Ramirez - Balqui 39 suministró un enorme volumen de nuevo material biológico sobre el que trabajar, aplicándose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales más antiguas; así, había que crear un marco taxonómico (con sus normas de nomenclatura) para encuadrar a los organismos recién descubiertos, era factible desarrollar trabajos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y herencia, evolución, ecología, etc. De este modo la joven Microbiología fue objeto, en pocos años, de la utilización, a un ritmo acelerado, de los métodos taxonómicos y experimentales que habían ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los ámbitos de la "Historia Natural" clásica. Los avances de Taxonomía Microbiana, vale la pena reseñar aquí los esfuerzos tempranos para lograr un clasificación bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula (1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfológicos. Pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres bioquímicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfológicos, bioquímicos, patogénicos y de tinción (Buchanan, 1915). El sistema de taxonomía bacteriana adquirió un nuevo impulso a partir de la 1ª edición del "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel ("Prospects for a natural system of classification of bacteria", 1936). En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta 1958 en que cuajó un Código Internacional de Nomenclatura Bacteriológica, aunque ya se venía aplicando desde hacía tiempo el procedimiento tipológico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Zoología y la Botánica. El establecimiento de relaciones taxonómicas precisó el recurso a métodos cada vez más amplios y afinados de análisis genético, estructural o fisiológico. En un apartado anterior ya vimos las conexiones tempranas entre la Bioquímica y la Microbiología a propósito del descubrimiento de la base enzimática de las fermentaciones, lo cual abrió el camino para dilucidar el metabolismo energético microbiano, y para demostrar su similitud química con rutas metabólicas de organismos superiores. Otro paso importante en la percepción de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas (término acuñado por Funk en 1911), al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosintéticos de coenzimas del metabolismo celular. Así pues, este tipo de investigaciones sentó claramente la idea de la unidad química de los seres vivos, independientemente de su encuadre taxonómico, y encauzó una buena parte de los trabajos bioquímicos hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio. En cuanto a las conexiones de la Microbiología con la Genética, ya Beijerink, en 1900, tras analizar la teoría de la mutación de De Vries, había predicho que los microoganismos podrían convertirse en objetos de investigación más adecuados que los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo XX, de determinar la
- 40. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 40 sexualidad de los hongos con fines taxonómicos. En 1905 Maire demostró la existencia de meiosis en la formación de ascosporas, y Claussen (1907) evidenció fusión de núcleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los años 30 había recogido un gran volumen de información sobre procesos sexuales en Basidiomicetos. El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografías genéticas en cromosomas de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este último, propugnador de la "teoría de los genes" (1926), confiaba desde hacía años en ampliar sus éxitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la genética microbiana. En 1941, otros dos discípulos de Morgan, Beadle y Tatum, aíslan mutantes auxotróficos de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la herencia, y convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta línea de investigación. Las estrategias diseñadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrück (1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparición de mutaciones espontáneas resientes a fagos o estreptomicina. La conexión de estos experimentos con las observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformación del neumococo, llevó a Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el "principio transformante" portador de la información genética es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioquímicamente la transmisión genética mediante ADN en Escherichia coli, y en 1952 Alfred Hershey y Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colofón a la confirmación de la función del ADN, con lo que se derribaba el antiguo y asentado "paradigma de las proteínas" que hasta mediados de siglo intentaba explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiología experimental se sitúa en pleno centro del nacimiento de la Genética molecular, de la mano de los avances paralelos en Bioquímica (análisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN, etc.), dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la "edad de oro" de la Biología Molecular. III. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA. El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados: objeto material y objeto formal. 3.1. OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS La Microbiología es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado pequeños para poder ser observados a simple vista, y cuya visualización requiere el empleo del microscopio. Esta definición implica que el objeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. De esta manera la Microbiología se distingue de otras disciplinas (como la Zoología y la Botánica) que se centran en grupos de seres vivos definidos por conceptos biológicos homogéneos, ya que su objeto de indagación se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin más
- 41. Ramirez - Balqui 41 relación en común que su pequeño tamaño, y a excluir a diversos organismos macroscópicos muy emparentados con otros microscópicos. A pesar de esto (o incluso debido a ello), la Microbiología permanece como una disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del tipo de metodologías ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamaño se sitúa por debajo del límite de resolución del ojo humano, aportando un conjunto específico de conceptos que han enriquecido la moderna Biología. Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscópico dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, bien sea acelular o celular, y en este último caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciación en tejidos u órganos, y que necesitan para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Bajo esta denominación se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares. 3.1.1. MICROORGANISMOS CELULARES. Comprenden todos los procariotas y los microorganismos eucarióticos (los protozoos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microscópicas). 3.1.2. VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS. Otro tipo de objetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biológica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia. Los virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente inferior al del más pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electrónico para su visualización. Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporación al protoplasma vivo para que su material genético sea replicado por medio de su asociación más o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una célula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola clase de ácido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimáticas, mientras que otras son estructurales, disponiéndose éstas en cada partícula virásica (virión) alrededor del material genético formando una estructura regular (cápsida); en algunos virus existe, además, una envuelta externa de tipo membranoso, derivada en parte de la célula en la que se desarrolló el virión (bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virásico (proteínas). En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicación de su ácido nucleico y de obtención de energía. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario
- 42. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 42 intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virión pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material genético, que al superponer su información a la de la célula hospedadora, logra ser expresado y replicado, produciéndose eventualmente la formación de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo. Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirásicas, descubiertas en 1967 por T.O. Diener en plantas. Están constituidos exclusivamente por una pequeña molécula circular de ARN de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un extenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homología interna. Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los intrones autocatalíticos de clase I, por lo que podrían representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles de su modo de multiplicación, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma, existiendo pruebas de la implicación de la ARN polimerasa II en su replicación, por un modelo de círculo rodante que genera concatémeros lineares. Esta replicación parece requerir secuencias conservadas hacia la porción central del viroide. Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patológicas. El mecanismo de patogenia no está aclarado, pero se sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quizá podrían interferir; sin embargo, no existen indicios de que alteren la expresión génica (una de las hipótesis sugeridas); cada molécula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia. En 1986 se descubrió que el agente de la hepatitis delta humana posee un genomio de ARN de tipo viroide, aunque requiere para su transmisión (pero no para su replicación) la colaboración del virus de la hepatitis B, empaquetándose en partículas similares a las de este virus. A diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas proteínas. Los ARNs satélites son pequeñas moléculas de tamaño similar al de los viroides de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cápsidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologías). Se replican sólo en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos patógenos de éste. Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satélites no infectivos, presentes en el interior de la cápsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los viroides, replicándose exclusivamente junto a su virus colaborador. Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por ejemplo, el "scrapie" o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los humanos (kuru, síndrome de Gerstmann-Straüssler, enfermedad de Creutzfeldt-
- 43. Ramirez - Balqui 43 Jakob). Se definen como pequeñas partículas proteicas infectivas que resisten la inactivación por agentes que modifican ácidos nucleicos, y que contienen como componente mayoritario (si no único) una isoforma anómala de una proteína celular. Tanto la versión celular normal (PrPC) como la patógena (PrPSc en el caso del "scrapie") son glicoproteínas codificadas por el mismo gen cromosómico, teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las características distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosacáridos que adquieren por procesamiento post-traduccional. A diferencia de los virus, los priones no contienen ácido nucleico y están codificados por un gen celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva síntesis poseen moléculas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la molécula del PrP que causó la infección previa. Se desconoce su mecanismo de multiplicación, y para discernir entre las diversas hipótesis propuestas quizá haya que dilucidar la función del producto normal y su posible conversión a la isoforma patógena infectiva. Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de las enfermedades por priones son simultáneamente infectivas y genéticas, una situación insólita en la Patología humana, habiéndose demostrado una relación entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prión (Prn-p) está ligado genéticamente a un gen autosómico (Prn-i) que condiciona en parte los largos tiempos de incubación hasta el desarrollo del síndrome. 3.2. OBJETO FORMAL. Todos los aspectos y enfoques desde los que se pueden estudiar los microorganismos conforman lo que denominamos objeto formal de la Microbiología: características estructurales, fisiológicas, bioquímicas, genéticas, taxonómicas, ecológicas, etc., que conforman el núcleo general o cuerpo básico de conocimientos de esta ciencia. Por otro lado, la Microbiología también se ocupa de las distintas actividades microbianas en relación con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales (y en este caso estudia los nichos ecológicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota patógena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así como los métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las que reportan beneficios (ocupándose del estudio de los procesos microbianos que suponen la obtención de materias primas o elaboradas, y de su modificación y mejora racional con vistas a su imbricación en los flujos productivos de las sociedades). Finalmente, la Microbiología ha de ocuparse de todas las técnicas y metodologías destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia empírica.
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- 45. Ramirez - Balqui 45 CAPITULO II MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y TAXONOMIA BACTERIANA. Miicrrobiiollogíía Médiica Miicrroscopíía Taxonomíía bactterriiana.. Cattegorríías ttaxonómiicas Cepas o cllones.. Biiottiipos Nomencllatturra de llas bactterriias Pattogeniiciidad y Viirrullenciia Méttodos iinmunollógiicos en miicrrobiiollogíía cllííniica Méttodos mollecullarres en miicrrobiiollogíía cllííniica Bactterriias de iintterrés médiico ((cllasiiffiicaciión según Berrgey)) Bactterriias de iintterrés iindusttrriiall
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- 47. Ramirez - Balqui 47 MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y TAXONOMIA BACTERIANA I. MICROBIOLOGIA En general, las bacterias son organismos unicelulares, desprovistos de clorofila que pueden vivir libres o bien agruparse. Su tamaño varia entre 0.2 y 3 micras de diámetro. Aunque son verdaderas células, su estructura presenta rasgos especiales: a) Por ser procarióticas carecen de núcleo diferenciado. El citiplasma presenta un solo cromosoma en forma de anillo (ADN circular). b) Una pared rígida (pared bacteriana) rodea la membrana plasmática. La composición química de la pared bacteriana varía en los distintos grupos de bacterias y se refleja en la capacidad de retener o no determinados colorantes. Según esto, las bacterias se clasifican en grampositivas o gramnegativas. Además, ciertas bacterias presentan una capa viscosa formada por azúcares complejos sobre la pared bacteriana que es lo que llamamos cápsula. c) Algunas bacterias son inmóviles; otras se desplazan mediante la utilización de cilios o flegelos. d) No presentan mitocondrias, aunque por tratarse de seres vivos, también respiran. Según su forma o morfología reciben distintos nombres bacilos, con forma de bastón; vibrio, semejantes a una coma; o parecidos a un sacacorchos, como los espirilos. Por último, los cocos son de forma redondeada y pueden agruparse por parejas (diplococos), en cadena (estreptococos) o de modo irregular (estafilococos). En el mundo de las bacterias, las formas de alimentación son muy variadas. Algunas viven en el suelo y, partiendo de sustancias inorgánicas, son capaces de sintetizar su propio alimento; presentan, por tanto, nutrición autótrofa.
- 48. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 48 Dentro de este grupo podemos distinguir las que realizan la fotosíntesis, si bien se trata de un proceso algo distinto del que tiene lugar en las plantas; poseen variedades únicas de clorofila (bacterioclorofila), y las que aprovechan la energía de ciertas reacciones químicas (y no la del sol) para construir sus propias sustancias. Entre ésta última, llamadas quimiotrofas, se encuentran: Las bacterias sulfurosas, que adsorben azúcar (o ácido sulfhídrico) y lo combinan con oxígeno. Las bacterias ferricas, que viven en aguas dulces o saladas en las que existe hierro en disolución; absorben estos compuestos y los combina con el oxígeno. Las bacterias hidrógenas, que combinan hidrógeno y oxígeno dando agua como subproducto de su actividad. Las bacterias nitrificantes, que oxidan ciertos compuestos nitrogenados. Estos cuatros tipos de bacterias aprovechan la energía que se libera en las reacciones descritas. Sin embargo, la mayoría de las bacterias dependen de otros seres vivos para alimentarse. Estas bacterias, heterótrofas, pueden ser saprofitas y vivir a expensas de la materia orgánica en descomposición, los parásitos si viven sobre o dentro de animales o vegetales vivos, o simbióticas cuando se asocian a otros organismos para obtener ambos un beneficio mutuo. Las bacterias viven en todo tipo de medios: en el agua, en la tierra y en los seres vivos. En este último caso pueden tener efectos benéficos para el organismo en el que se encuentran, como sucede por ejemplo con unas bacterias del intestino del hombre, que producen una sustancia muy importante: la vitamina K.. En muchos casos las bacterias producen enfermedades cuando se hallan presentes en los animales y en las plantas. En tal caso reciben el nombre de bacterias patógenas. Las "insignificantes" bacterias han producido grandes epidemias a lo largo de la historia, como lo es el caso de la peste o el cólera. Pero también son responsables de enfermedades muy comunes entre nosotros, tales como el canto o las anginas. La reproducción más típica en las bacterias es la asexual, multiplicándose por simple escisión o bipartición. Este proceso es enormemente eficaz porque, en condiciones apropiadas, pueden llegar a dividirse cada veinte minutos. A las seis o sietes horas, una sólo bacteria puede dar lugar a un millón de descendiente. No cabe duda, que son los organismos vivos más abundantes sobre la tierra. Por su simplicidad ante organismos más complejos, las bacterias son muy utilizadas en la investigación bioquímica y genética. Algunos bacilos tienen la propiedad de formar estructuras de resistencia o esporas cuando las condiciones se vuelven adversas.
- 49. Ramirez - Balqui 49 Los mecanismos parasexuales mediante los cuales realizan intercambios de material genético son: La conjugación: hay una bacteria donadora y otra receptora. La transducción; el agente transmisor es un virus que transporta fragmentos de la última bacteria que ha parasitado. La transformación: una bacteria introduce fragmentos de ADN que hay libres en el medio. En la conjugación, una célula donadora emite un apéndice tubular llamado pili o fimbria que comunica su citoplasma con el de la célula receptora. Por esto puente puede pasar una porción del cromosoma donador. II. MICROSCOPIA. Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final. 2.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800. Compuestos por: Fuente luminosa que ilumina la muestra. Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra. Platina sobre la cual se coloca la muestra. Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra. Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo.
- 50. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 50 La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este no produce un nivel útil de contraste. Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llega hasta la retina del ojo y las hacen visibles. La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis. Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración
- 51. Ramirez - Balqui 51 inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados. Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico. Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen. Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada célula. Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia.
- 52. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 52 Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares. 2.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA. Dentro de los microscopios electrónicos tenemos el de barrido y el de transmisión. La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución. Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible. Este microscopio se basa en los siguientes principios: Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo). Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones. Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz. El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las lentes de vidrio de un microscopio óptico. El condensador forma el haz y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final se visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales pesados durante la preparación del espécimen aparecen oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla. Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero requieren métodos más finos. Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para el microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios electrónicos la calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la estructura subcelular debe ser la mejor posible. La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un buffer y de una fijación con tetróxido de osmio.
- 53. Ramirez - Balqui 53 Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido no mayores de 1 mm3. El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica. El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante. Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50- 400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados. Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de transmisión se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agrega densidad a la membrana. A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con microscopio electrónico de transmisión. La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de membranas. El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados centígrados. Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio electrónico de transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las características estructurales del mineral.
- 54. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 54 Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en una televisión. Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de la superficie y los electrones de Auger emitidos en la superficie. Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con sonda electrónica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar. III. TAXONOMIA BACTERIANA. CATEGORIAS TAXONOMICAS. En el caso de las bacterias, el concepto de especie, un grupo de organismos que pueden reproducirse entre ellos y dar descendencia fértil, no es apropiado, pues su reproducción es asexual. En microbiología se dice que una especie está formada por un conjunto de poblaciones clonales, o cepas, que se parecen mucho entre ellas y se pueden diferenciar de otros grupos de bacterias. La clasificación, de las bacterias se hace principalmente basándose en propiedades bioquímicas, fisiológicas y ecológicas, como por ejemplo ser aeróbicas, anaeróbicas o aerobias facultativas. Para clasificar una bacteria, primero hay que aislarla para obtener un cultivo puro. Esto se consigue distribuyendo la muestra, de manera que al sembrar las bacterias se desarrollen separadamente y se pueda aislar un clon en concreto. Después este se ha de sembrar en diferentes medios de cultivo, convenientemente preparados para realizar diferentes pruebas y observar el tipo de crecimiento que se produce en ellos, por ejemplo ver si puede degradar la lactosa o no, etc. Niveles Taxonómicos: Taxonomía.- Conjunto de técnicas y procedimientos para ordenar y agrupar a los seres vivos en grupos afines o taxones. Sistemática.- Se encarga de agrupar a los seres vivos de acuerdo a criterios de semejanzas y diferencias y relaciones evolutivas. Establece árboles genealógicos:
- 55. Ramirez - Balqui 55 Reino Phylum Clase Orden Familia Género Especie Reino.- Conjunto de phyla Phylum.- Conjunto de clase Clase.- Conjunto de órdenes similares. Orden.- Conjunto de familias relacionadas Familia.- Reúne a los géneros con grandes semejanzas. Género.- Conjunto de especies muy cercanas entre sí. Especie.- Es la unidad fundamental de clasificación y se define como conjunto de organismos que poseen antepasados comunes anatómicos o fisiológicos similares. Robert Whittaker, biólogo estadounidense, propuso que los seres vivos se pueden clasificar en cinco reinos: Reino mineral, incluye a organismos unicelulares, procariontes, algunos de ellos forman colonias, su reproducción es por bipartición, habitan en todos los lugares conocidos. La mayoría son heterótrofos aunque algunos utilicen luz solar o bien energía que prende durante los procesos de descomposición de compuestos orgánicos o inorgánicos. Bacterias (importancia) a) cocos Estafilococos:- Estreptococos: b) Bacilos lactobacilos c) Espirilos Existen así mismo bacterias que son importantes para todos los seres vivos llamadas que son fijadoras del N2 nitrógeno. IV. CEPAS O CLONES V. NOMENCLATURA. VI. BACTERIAS DE INTERES MEDICO
- 56. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 56 VII. MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSRIAL. 7.1. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo característico del hombre su afán por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de ordenamiento surge la Taxonomía como la ciencia de la clasificación, nomenclatura e identificación. La Clasificación es algo creado por el hombre. Consecuencia de esta artificialidad es la controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenzó con Linneo siendo una sencilla división de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido haciéndose cada vez más complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros días con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no será la última, ya que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, así como las posibilidades de aumentar esos conocimientos. Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, ordenó a todos los seres vivos en dos Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos móviles y heterótrofos; y el Reino Plantae que incluía a los vegetales, individuos inmóviles, autótrofos y fotosintéticos. Según el esquema de los dos reinos, los protozoos se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae. Sin embargo, esta clasificación encontró pronto dificultades ya que existían numerosos microorganismos que poseían características intermedias que no permitían su clara adscripción a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organización biológica sencilla ya fueran unicelulares, cenocíticos o multicelulares, pero todos ellos carentes de especialización tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las funciones propias y específicas que los tejidos de organismos superiores, animales y plantas, tenían encomendadas. Según Haeckel, el Reino Protista incluiría bacterias, algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fué cuestionada a medida que se obtenía más información acerca de la estructura interna de los microorganismos debido a los avances en microscopía electrónica. En 1937 Chatton dividió el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos según tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron así los términos eucariota para definir organismos con células nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los animales y plantas; y procariota para agrupar células sin membrana nuclear, como es el caso de las bacterias. La dicotomía eucariota-procariota fue utilizada por los taxónomos como una característica filogenética de primera magnitud. Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos procariotas constituyeron un grupo taxonómico filogenéticamente independiente. El más aceptado de todos ellos fue el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de clasificación de los seres vivos basado en los dos niveles de organización celular y las
- 57. Ramirez - Balqui 57 tres formas principales de nutrición (fotosíntesis, absorción e ingestión) que dieron lugar a los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas fotosintéticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluidos en los Reinos Monera (bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras). Hasta este momento se utilizaron características morfológicas y fisiológicas hasta que el desarrollo de la biología molecular permitió utilizar los constituyentes moleculares como nuevos criterios clasificatorios. Así, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprobó que, a través de la secuenciación de esta molécula, los procariotas quedaban divididos en dos grupos. El primero de ellos incluye las bacterias más comunes, aisladas en su mayoría del cuerpo, suelo y agua denominándose eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias que producen metano (metanógenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en ambientes muy ácidos y calientes (termófilas extremas) y bacterias que viven en ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias. En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxón superior a Reino que denominó Dominio (Dominio → Reino → División → Clase → Orden → Familia → Género → Especie). Todos los seres vivos se agruparían en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los cuales, dos son exclusivamente microbianos y están compuestos únicamente por células procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero (Eukarya), formado por eucariotas, incluiría entre otros los Reinos Protista, Plantae, Animalia y Fungi. 7.2. CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES. Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos. Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar
- 58. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 58 disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar. 7.3. DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES. Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros métodos. a). Levaduras Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos. b). Hongos filamentosos. Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos
- 59. Ramirez - Balqui 59 (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas. c). Bacterias. Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra mojada se debe a compuestos volátiles (geosmina) producido por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
- 60. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 60
- 61. Ramirez - Balqui 61 CAPITULO III INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA Concepttos básiicos.. Cllases de nuttrriienttes.. Mediios de cullttiivo.. Mettabolliismo enerrgéttiico Capttaciión de enerrgíía en llas bactterriias quiimiiottrroffas.. Capttaciión de enerrgíía en llas bactterriias ffottottrroffas:: Fottoffosfforriillaciión.. Obttenciión de enerrgíía en Hallobactterriium.. Ell oxíígeno y ell mettabolliismo bactterriiano..
- 62. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 62
- 63. Ramirez - Balqui 63 CAPITULO IV ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO Concepttos básiicos.. Cllases de nuttrriienttes.. Mediios de cullttiivo.. Mettabolliismo enerrgéttiico Capttaciión de enerrgíía en llas bactterriias quiimiiottrroffas.. Capttaciión de enerrgíía en llas bactterriias ffottottrroffas:: Fottoffosfforriillaciión.. Obttenciión de enerrgíía en Hallobactterriium.. Ell oxíígeno y ell mettabolliismo bactterriiano..
- 64. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 64
- 65. Ramirez - Balqui 65 ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO I. NUTRICION BACTERIANA. CONCEPTOS BÁSICOS La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos objetivos: fines energéticos (reacciones de mantenimiento); fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo). Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. En el capítulo anterior vimos los principales modos de captación y obtención de energía existentes en las bacterias. El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la Ecofisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana, que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos en el laboratorio. Es importante tener claros desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos "clasificaciones" de tipos de nutrición: Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en: litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2 S0, NH3, NO2-, Fe, etc.). organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, alcoholes...). Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en: autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO2. heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica).
- 66. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 66 Otros conceptos: autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono. Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo (obtienen energía de compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético. Sean autotrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como: macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...) En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono. A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy distintos, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa. En los heterótrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente a: metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas); metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular). Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautotrofos (o quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas
- 67. Ramirez - Balqui 67 sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar de los medios ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas. II. CLASES DE NUTRIENTES Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías: universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales; particulares; factores de crecimiento. 2.1. NUTRIENTES UNIVERSALES. El agua Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es: el principal constituyente del protoplasto bacteriano; el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas; un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas). Las fuentes de agua pueden ser: endógena: procedente de procesos de oxido-reducción; exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas. Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria: Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben (respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria. Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo. La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como w s w P P a Donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es la presión parcial de vapor del agua destilada. ¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al
- 68. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 68 valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aW = humedad relativa/100). Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99. Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1. Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995. Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980. Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950. En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas: bacterias halófilas extremas, como la arqueobacteria Halobacterium, que habita lagunas hipersalinas; bacterias (y sobre todo, ciertos microorganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares El CO2 El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias: Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos). Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía: CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O (D G'0<0) Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas. El origen del CO2 puede ser: endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono; exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas. Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aíslan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.
- 69. Ramirez - Balqui 69 Fósforo Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánico o inorgánico. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram- negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y en proteínas. Sales minerales Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl--) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++. El ión potasio (K+): interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la síntesis de proteínas. En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared. El ión magnesio (Mg++): estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos; como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera. Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas. El ión calcio (Ca++): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas. El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamtas y enterobactina). El hierro participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S); interviene como cofactor en ciertas enzimas. Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos traza. El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++. El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).
- 70. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 70 El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN- polimerasas. El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico. El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2. 2.2. NUTRIENTES PARTICULARES. Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades biosintéticas. Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido: el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas); el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA. ¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias? La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada: como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito- reductasas asimilatorias. como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S. Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida: de N inorgánico: amonio (NH4+) de S inorgánico: sulfuros (S=, SH-) de N orgánico: aminoácidos, péptidos de S orgánico: cisteína. Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden usar nitratos. 2.2.1. FIJACIÓN DE NITRÓGENO. La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N2), que procede de microorganismos desnitrificantes. Sin embargo, esta gran reserva sólo puede servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos y ciertos eucariotas).
- 71. Ramirez - Balqui 71 La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en amoniaco, según la siguiente ecuación: N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP → 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi) Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes: Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S9-homocitrato) Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína). Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior: Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (N = N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones. Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro", pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático. Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina, que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa- reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (componente I), y le transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la evolución ha "inventado" distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en fijadores aerobios. Debido a lo "caro" que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos): la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado; ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif). La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (N = C-) y
- 72. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 72 acetileno (HC = CH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa. 2.3. FACTORES DE CRECIMIENTO. Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o toda de una ruta biosintética. Ejemplos: las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico. Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos. En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas bacterias: Factor o vitamina Funciones principales p-aminobenzoico (PABA) Precursor del ácido fólico Acido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos metilo. Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2 Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de desoxirribosa Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en reacciones redox Riboflavina Precursor de FAD y FMN Ácido pantoténico Precursor de la CoA Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas. Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas, menaquinonas, etc.) I. MEDIOS DE CULTIVO El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo.
- 73. Ramirez - Balqui 73 Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos: 1). Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos: Ejemplos: Digeridos crudos de extracto de carne Digeridos de extracto de levadura Digeridos de peptona de carne o de soja Digeridos de caseína (de la leche). Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes. 2). Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. 3). En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores, denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas. Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de "versiones", según su estado aparente: medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla) medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución. En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.
- 74. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 74 El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas. Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice. Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas: Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas. Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio. Ejemplos: en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de carbono. El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias. Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales. P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en la segunda tanda de prácticas. Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal. Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.
- 75. Ramirez - Balqui 75 En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo. II. METABOLISMO ENERGÉTICO. El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que permiten el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El metabolismo de la célula comprende dos grandes tipos de reacciones: 1. reacciones de mantenimiento, que suministran a. energía b. poder reductor c. precursores metabólicos 2. reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de las reacciones de mantenimiento. Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en procesos de: biosíntesis (anabolismo) transporte activo translocación de proteínas a través de la membrana citoplásmica movimiento flagelar bioluminiscencia En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre principalmente por medio de la síntesis de ATP: ADP3- + H+ + PO4H2- → ATP4- + H2O La hidrólisis de ATP hasta ADP y P genera una variación de energía libre ΔGo'= -31 kJ (-7,3 kcal). La síntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una ΔGo' de +31 kJ. Los métodos usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente: fosforilación a nivel de sustrato; fosforilación oxidativa; fotofosforilación (durante la fotosíntesis). Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergónicas, pero la manera en que esas reacciones exergónicas se acoplan a la síntesis de ATP varía entre la fosforilación a nivel de sustrato y las otras dos.
- 76. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 76 En esta reacción se libera energía libre, cuyo valor viene expresado por la fórmula: ΔG0'= - n · F · ΔE0' n = nº de electrones transferidos F = constante de Faraday = 96,6 kJ·volt-1·equivalentes--1 ΔE0' es la diferencia entre los potenciales de reducción del donador (pareja D/DH2) y del aceptor (pareja A/AH2). Una reacción redox exergónica de este tipo se puede acoplar a la consecución de trabajo útil: formación de un compuesto rico en energía; formación de un gradiente de concentración y/o de carga eléctrica a ambos lados de una membrana. Ambos tipos de trabajo se pueden usar en la síntesis de ATP. Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energética (principalmente ATP), han de captar alguna fuente de energía externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cuáles son los tipos de energía que captan las bacterias y los correspondientes tipos de metabolismos energéticos: 1. Si la energía procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser: a. fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas; b. fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas. 2. Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser: a. quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas; b. quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas. Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilación a nivel de sustrato respecto de la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación: A) La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP. Las fosforilaciones a nivel de sustrato se caracterizan por lo siguiente: son procesos escalares (es decir, no influye su situación espacial dentro de la célula); son series de reacciones bioquímicas en las que la transferencia de un grupo químico (ej., el fosfato) se cataliza por enzimas solubles (en el citoplasma); existen intermediarios metabólicos (antes de llegar al ATP) en los que el fosfato está unido covalentemente.
- 77. Ramirez - Balqui 77 B) En cambio, tanto la fosforilación oxidativa como la fotofosforilación son procesos caracterizados por: ser vectoriales (orientados en el espacio); estar ligados a membrana; implicar una secuencia ordenada de transportadores de electrones que sufren oxidaciones y reducciones reversibles (cadena transportadora de electrones, c.t.e.). no hay intermediarios covalentes ricos en energía, sino que la transferencia de energía se realiza por medio de un gradiente electroquímico de protones (y, en algunos casos, de cationes). Este gradiente de protones se puede emplear a su vez para: o síntesis de ATP, o transporte de nutrientes, o translocación de proteínas fuera del protoplasto, o movimiento flagelar. III. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS. En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en quimiolitotrofos) con una reducción concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP, que se convierte en ATP. 3.1. FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES. Recordemos aquí lo dicho anteriormente: La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP. gliceraldehido-3-P → 1,3-difosfoglicérico → 3-fosfoglicérico La fosforilación a nivel de sustrato está acoplada a un proceso metabólico denominado fermentación. Durante la fermentación, el sustrato orgánico reducido (DH2) es catabolizado, de modo que como acabamos de ver, se produce ATP. Este catabolismo genera, además: equivalentes de reducción (en forma de NADH y otros cofactores reducidos), e intermediarios oxidados de la ruta catabólica. Pues bien, es característico de las fermentaciones que los equivalentes de reducción reaccionen con uno de esos intermediarios (A), que de este modo se reduce a AH2 (producto de la fermentación), regenerándose el cofactor en forma oxidada (NAD+) para el siguiente ciclo.
- 78. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 78 El rendimiento de las fermentaciones, expresado como variación de energía libre, es bajo. En la fermentación homoláctica se producen 2 moles de ATP por cada mol de glucosa consumido (frente a los 28 moles de ATP/mol de glucosa en la respiración aerobia). Esto significa que para que el microorganismo crezca en estas condiciones, degrada grandes cantidades de sustrato fermentable. Las fermentaciones se dan en determinados microorganismos quimiorganotrofos, que pueden ser anaerobios obligados o anaerobios facultativos (cuando crecen en ausencia de O2). Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios productos de fermentación característicos. Algunos ejemplos: Fermentación láctica Lactato Fermentación alcohólica etanol, CO2 Fermentación ácida-mixta etanol, succinato, acetato, formiato, lactato, CO2, H2 Fermentación butilénglicólica butilénglicol, CO2 Fermentación aceto-butírica acetato, acetona, butirato, butanol, etanol, CO2, H2 3.2. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES. Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos orgánicos (en quimiorganotrofas) o inorgánicos (quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej., NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones. Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia; Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia. En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa. Esquema y balance de la fosforilación oxidativa Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes). Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles: DH2 + A → AH2 + D
- 79. Ramirez - Balqui 79 El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes de las c.t.e. respiratorias flavoproteínas (Fp), dotadas de grupos FAD o FMN proteínas no hémicas de Fe-S quinonas: o ubiquinona (UQ) o menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas. citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado). Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea, protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones. La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido determinado), de modo que los H salen hacia afuera y los electrones tienden a entrar al interior. Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e. (llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica (concretamente, en los puntos donde confluyen un transportador de H y otro de electrones). Es decir, existe una translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en la c.t.e. Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente. Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente osmótico de esos iones H+ (ΔpH) y un gradiente de carga eléctrica (Δ). Este gradiente es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo. El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es: Δp = Δ –Z · ΔH (expresado en milivoltios, mV), Donde Z = 2,3 R · T/F, siendo R = constante de los gases, T = temperatura absoluta, F = constante de Faraday Como ya dijimos, esta Δp (f.p.m.) es capaz de realizar trabajo, bajo la forma de: transporte activo alimentar el motor flagelar síntesis de ATP. Veamos, pues, cómo se produce esta síntesis de ATP a partir del gradiente de protones: La síntesis de ATP ocurre gracias al complejo ATP-asa, funcionando como ATP- sintetasa. Este complejo consta de varios polipéptidos que conforman dos porciones:
- 80. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 80 la hidrofóbica BF0, inserta en la membrana citoplásmica, y la BF1 a modo de tallo que se proyecta hacia el interior celular. La porción BF0 forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H+ desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera. La porción BF1 es la parte enzimáticamente activa del complejo. Esencialmente, el mecanismo consiste en que la disipación del gradiente de protones a través de BF0 suministra la energía para la síntesis de ATP por parte de la BF1. La reacción se puede expresar así: 2H+ (ext) + ADP (int) + P (int) → 2H+ (int) + ATP (int) + H2O (ext) El balance final del funcionamiento de la c.t.e. es: DH2(int) + A(int) + ADP(int) + P(int) → D(int) + AH2 + ATP(int) + H2O (ext) El esquema anterior hace referencia al funcionamiento de una cadena transportadora con un solo bucle translocador de protones. Pero en la realidad las c.t.e. suelen poseer más de uno de estos bucles. Véase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de ATP. Véase también la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O2 como aceptor final de electrones. En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas bacterianas: En los quimiolitotrofos, la c.t.e. respiratoria funciona en los dos sentidos: en su sentido "normal", ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede electrones, que llegan a la c.t.e., que crea un gradiente de protones, cuya disipación a través de ATP-asa genera ATP; pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH2O]. Este NADPH lo logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la c.t.e., usando para ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal. Cadenas de electrones ramificadas: Muchas cadenas respiratorias aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para minimizar los efectos nocivos de otros. Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno, usa una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el
- 81. Ramirez - Balqui 81 rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que entre oxígeno al citoplasma, con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno. Mecanismo de la ATP-sintasa dependiente de protones En los años recientes se está avanzando en el mecanismo de la ATP-sintasa (con concesión de premio Nobel de Química 1997 a tres biólogos que han contribuido en este aspecto): F0 es un complejo integral de membrana, que transloca los protones. Está compuesto de {a, b2, c10}. F1 constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios catalíticos. Su composición se puede expresar como {3, 3, , , ). Ambas porciones están unidas entre sí por enlaces iónicos e hidrófobos. Al parecer, la translocación de unos 4 protones a través de F0 está acoplada, por medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en las subunidades de la F1, por un notable mecanismo de catálisis rotacional: El que los 4 protones entren por F0 parece que induce un cambio conformacional en la subunidad de F1, que a su vez obliga a girar al F1, con una síntesis de ATP. Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis, es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e interconvertibles de energía celular. Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus procesos de fermentación, y a su vez, parte del ATP lo convierten, por las ATP-asas hidrolíticas, en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para alimentar al motor flagelar. Respiraciones anaeróbicas Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos reducidos (A → AH2) son: NO3-- → N2 SO42- → SH2 fumarato → succinato CO2 → CH4 Fe3+ → Fe2+ Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja O2/H2O es más oxidante que las otras. El uso de nitratos, sulfatos y CO2 como aceptores finales de electrones (y no como material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo (o
- 82. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 82 desasimilativo). Para distinguirlo del asimilativo. El producto reducido se excreta al ambiente de la bacteria. El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación: NO3-- → NO2- (nitrito) → NO (óxido nítrico) → N2O (óx. nitroso) → N2 (dinitrógeno) Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno de la atmósfera procedía de estos procesos desnitrificantes. El uso de sulfato como aceptor de electrones sólo lo hacen las bacterias sulfatorredutoras, por una ruta especial en la que el sulfato primero tiene que activarse con ATP (formando la adenosina-fosfo-sulfato, APS). La mayoría son quimiorganotrofos, pero algunos pueden usar H2 donador de electrones (quimiolitotrofos). Las arqueobacterias metanogénicas son los únicos seres vivos capaces de obtener energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO2 como aceptor de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos): 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O Tipos de quimiolitotrofos Insistamos en el hecho de que la capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos de procariotas. Cada grupo fisiológico usa un tipo de donador inorgánico: bacterias de hidrógeno (H2) bacterias del hierro (Fe2+) bacterias del azufre (S2-, S0). bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes: las oxidadoras de amoniaco (llamadas nitrosas) y las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas). En general, el mecanismo de generación de ATP es similar al de quimioorganotrofas respiradoras. Los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico) pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final, que suele ser el oxígeno. Pero a excepción del H2, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un potencial de oxidación E0' menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del gradiente electroquímico creado se emplea en hacer que electrones viajen por la c.t.e. (o una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD.
- 83. Ramirez - Balqui 83 IV. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN Los organismos fotosintéticos usan energía de la luz para convertir el CO2 en material celular, según la fórmula general: 2 H2A + CO2 energía de luz (hv) [CH2O] + H2O + 2 A En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto, al oxidarse se genera O2. En Anoxifotobacterias el reductor exógeno ("H2A") puede ser H2, S=, S2O3 -, etc. Tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Como veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica. En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de agente oxidante externo. Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.), que a su vez puede convertirse en ATP. No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO2. En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H2A) servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO2 hasta materia orgánica. Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP. 4.1. COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO. Fotosistemas: Catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están constituidos por complejo antena y centro de reacción. Cadenas transportadoras de electrones: Estas cadenas están ligadas de forma estrecha al centro de reacción, y crean una f.p.m. Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente las principales moléculas implicadas: A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg++ pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción. Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a proteínas, de modo que en este estado actúan como "trampas" para los cuantos de luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0 ' negativo, por lo que entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.
- 84. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 84 B) Carotenoides. Forman parte del complejo antena. Sus funciones son: protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la interacción entre la luz y el oxígeno; como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros). C) En las Oxifotobacterias, existe, además un conjunto de ficobiliproteínas, organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas, dispuestos (como ya vimos en el tema 8) en la superficie de los tilacoides. Las principales ficobiliproteínas son ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina, y constituyen el complejo antena en las Cianobacterias. D) Feofitinas y bacteriofeofitinas. Son similares a las respectivas (bacteria) clorofilas, excepto que no están queladas con Mg++. Actúan como aceptores inmediatos del electrón que pierde cada (bacterio) clorofila del centro de reacción. E) Otros componentes. En el mismo centro de reacción se encuentran los primeros componentes de la c.t.e. fotosintética: quinonas especiales acomplejadas con Fe. Por lo demás, las c.t.e. fotosintéticas contienen moléculas de tipos parecidos a las ya estudiadas en las c.t.e. respiratorias: quinonas, citocromos y ferroproteínas no hémicas. 4.2. FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA. Para estudiar el funcionamiento, hagámonos una idea de cómo están organizados los principales componentes que acabamos de citar dentro del aparato fotosintético: Complejo antena Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran número (desde unos 50 hasta miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energía de unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenómeno conocido como resonancia inductiva. El complejo antena actúa como un "embudo", captando energía lumínica, y canalizándola hacia el centro de reacción, donde como veremos enseguida, esta energía podrá ser convertida a una forma útil. Centro de reacción (C.R.). Para hacernos una idea concreta de un centro de reacción, mostraremos uno de los mejor estudiados: el de la anoxifotobacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis (el primero en desentrañarse a nivel molecular, en el año 1985, mediante técnicas de difracción de rayos X). posee 4 bacterioclorofilas, de las cuales dos (denominadas P870) son las fotoquímicamente activas, debido a su asociación con tres proteínas del centro de reacción (denominadas L, M y H). Todo el conjunto se encuentra en la bicapa lipídica. 2 bacteriofeofitinas 2 ubiquinonas y un Fe, que constituyen el complejo Q·Fe.
- 85. Ramirez - Balqui 85 Antes de dar una visión más detallada, veamos un pequeño resumen del modo de funcionamiento del centro de reacción: Llega un cuanto de luz al par de bacterioclorofilas especiales. La bacterioclorofila (Bcfla.) se excita (Bclfla*); la Bclfla* excitada se oxida (pierde un electrón) → Bclfla+; el electrón es captado rápidamente por el aceptor inmediato (la bacteriofeofitina), que a su vez lo pasa a la quinona cercana. En todo este proceso se va produciendo una separación de cargas, porque el electrón va quedando cada vez más separado de la Bclfla+ oxidada. El electrón pasará a otra quinona situada fuera del C.R., convirtiéndose en un electrón de alta energía. Veamos en detalle la secuencia de transferencias en el centro de reacción. 1. Cada Bclfla. especial (P870 en el ejemplo que estamos estudiando), tras excitarse (pasar Bclfla*), se oxida (pierde electrón), pasando a Bclfla+. 2. El electrón pasa a una Blcfla. "normal" (P800, no asociada a proteínas). 3. El electrón original de cada una de las dos Blcflas. especiales es recogido por las bacteriofeofitinas. 4. Los dos electrones (uno por feofitina) pasan a una ubiquinona (QA) estrechamente ligada al centro de reacción (la quinona se reduce: QAH). Observar que se ha originado una separación de cargas, de modo que se ha formado una especie de "agujero" cargado positivamente: las bacterioclorofilas con carga positiva tienen ahora una alta afinidad por electrones. 5. La Bclfla+. captura un electrón de un citocromo cercano (cit c2, ligado al centro de reacción). Normalmente este citocromo es un donador débil de electrones, pero ahora los cede, debido al intenso "agujero" de carga positiva representado por las Bclflas+. 6. Mientras tanto, el electrón de la QA pasa a una segunda ubiquinona del centro de reacción (QB). 7. El electrón abandona el centro de reacción y pasa a otra quinona, que se encuentra libre en la bicapa lipídica. Esta quinona, una vez reducida, es un buen reductor (donador de electrones). El electrón pasa a la c.t.e. (con citocromos b-c). 8. El funcionamiento de esta c.t.e. provoca una translocación de protones fuera de la membrana, o sea, un potencial electroquímico de protones o f.p.m., cuya disipación a favor de las ATP-asas se traduce en producción de ATP (fotofosforilación). 4.3. TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN. Fotofosforilación cíclica En la FFC, la (bacterio) clorofila del centro de reacción (fotosistema I) sirve tanto como donador primario de electrones como aceptor final de electrones procedentes de una c.t.e. Los electrones no pueden salir del ciclo. Cuando los electrones pasan por la confluencia entre una quinona y un complejo de citocromos se produce translocación de protones al exterior, lo que supone Δp, que a su vez se puede convertir en ATP.
- 86. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 86 Como los electrones no pueden salir del ciclo, no se crea poder reductor. Por lo tanto, este poder reductor ha de venir de otra fuente, y no del funcionamiento del fotosistema. (Fuente química, que permite un flujo invertido de electrones). Fotofosforilación acíclica En Anoxifotobacterias: FFA anoxigénica El fotosistema I (FSI) se excita y la Bclfla. Se oxida (Bclfla+). Los electrones cedidos por el C.R. sirven para reducir (junto con protones) al NAD (P)+ hasta NAD (P)H + H+ (es decir, se crea poder reductor). Ahora bien, ¿cómo se regenera la bacterioclorofila, es decir, cómo se reduce la Bclfla+ oxidada? En la FFA existe un donador exógeno de electrones distinto del H2O: SH2, S0, H2, ciertos compuestos orgánicos. Dicho donador cede electrones al C.R. a través de una c.t.e., que como es habitual, crea un potencial Δp (f.p.m.) convertible en ATP. En Oxifotobacterias, al igual que en algas verdes y plantas superiores: FFA oxigénica Estos organismos usan H2O como donador exógeno de electrones; la FFA es más compleja, ya que el H2O requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle los electrones, y el FSI no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar electrones directamente del agua. La manera de resolver este problema es acoplar un fotosistema adicional (FSII), dotado de un E0' más alto que el FSI, y que funciona en paralelo con éste. El FSI se activa y se oxida por la luz, transfiriendo los electrones a una ferredoxina, que a su vez los cede al NADP+, para generar poder reductor (NADPH + H+). Ahora bien, como hemos dicho, el FSI+ no puede regenerarse directamente por el agua, sino que recibe los electrones desde el FSII, a través de una c.t.e. (por supuesto, con creación de Δp y por lo tanto, ATP). Esta c.t.e. consta de la serie de transportadores siguiente: PQ (plastoquinona) ─ citocromo b·f ─ PC (plastocianina) El FSII se excita por la luz (y como acabamos de decir, envía los electrones al FSI vía c.t.e.). Este FSII+ sí puede regenerarse extrayendo los electrones del H2O, desprendiéndose O2. En resumen, el FSI+ actúa como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. A su vez, el FSII+ (oxidado) se reduce directamente por el agua (merced a un complejo enzimático que contiene Mn, llamado complejo lítico del agua o "reloj oxidante del agua"). V. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM. Algunas arqueobacterias halófilas (p. ej., Halobacterium) presentan una capacidad de síntesis de ATP mediada por la luz, pero sin implicación de clorofilas ni fijación de CO2. Cuando estas bacterias se encuentran en condiciones de baja aireación (bajas tensiones de O2), sintetizan
- 87. Ramirez - Balqui 87 una cromoproteína especial llamada bacteriorrodopsina, que forma "parches" de color púrpura en sus membranas citoplásmicas. La bacteriorrodopsina consta de: porción proteica: bacteriopsina, que forma 7 hélices atravesando la membrana; grupo cromóforo: retinal (el mismo de la rodopsina retiniana de los vertebrados). El retinal es un carotenoide C20 que puede absorber la luz y catalizar la transferencia de protones a través de la membrana. Se encuentra unido como una base de Schiff a una determinada lisina de la bacteriopsina. El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuración 13- cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de = 565 nm, de lo que resulta un bombeo de un protón fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra anterior pasa conformación todo-trans, capta un protón y pasa a la forma protonada 13-cis. El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipación a favor de ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsérvese que funciona como una bomba de protones, que saca H+ al exterior. VI. EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO BACTERIANO. 6.1. REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS. Aparte de las bacterias que usan O2 como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e. respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O2, dando inevitablemente peróxido de hidrógeno (H2O2), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radical superóxido (O2 -). Por lo tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para detoxificar estas sustancias: Protección respecto de los peróxidos: En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa: H2O2 catalasa H2O + 2 O2 Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua: H2O2 + NADH + H+ peroxidasa 2 H2O + NAD+ Protección respecto del superóxido: El radical superóxido se produce por: acción de oxidasas;
- 88. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 88 autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas. Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se destruye por los mecanismos que acabamos de ver: 2 O2 - + 2 H+ SOD O2 + H2O2 6.2. RELACIONES DE LAS BACTERIAS CON EL OXÍGENO. Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas). Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales). Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes (aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes. Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.
- 89. Ramirez - Balqui 89 CAPITULO V EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS BACTERIAS I Inttrroducciión:: Effectto de llos ffacttorres ambiienttalles sobrre llas bactterriias.. Effectto de lla Temperratturra.. Liioffiilliizaciión Desecaciión Effectto de llas rradiiaciiones sobrre llas bactterriias Effectto de llas ondas sonorras Effecttos de lla prresiión hiidrrosttáttiica Effecttos de lla prresiión osmóttiica Effecttos dell pH
- 90. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 90
- 91. Ramirez - Balqui 91 ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO I. INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LAS BACTERIAS. Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las células procarióticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, las bacterias han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida "normal", encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo a pH muy ácidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y a grandes presiones...En este capítulo y en el siguiente veremos algunas de estas notables adaptaciones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su fondo genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales (óptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que 1. modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2. condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitat naturales; 3. permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para: a. la mutagénesis, b. la esterilización y desinfección, c. la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de reproducción. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: AGENTES FÍSICOS AGENTES QUÍMICOS
- 92. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 92 Temperatura Desinfectantes y antisépticos. Desecación Quimioterápicos de síntesis Radiaciones Antibióticos Ondas sonoras Presión hidrostática Presión osmótica II. EFECTO DE LA TEMPERATURA 2.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienen constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales: Temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento. Temperatura máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento. Temperatura óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo). El margen entre la temperatura mínima y la máxima se suele llamar margen de crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados. La temperatura mínima se puede explicar en función de: un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de protones; un aumento de la viscosidad del citoplasma; un debilitamiento de los enlaces hidrófobos de las proteínas (debido a cambios físicos en la estructura del agua de solvatación) que provoca inactivación de enzimas alostéricos y de actividad funcional de los ribosomas. En muchos casos los polisomas no se ensamblan. Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su máxima tasa posible. A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura máxima. Dicha temperatura refleja: desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales; colapsamiento de la membrana citoplásmica; lisis térmica de la bacteria.
- 93. Ramirez - Balqui 93 Obsérvese en el gráfico que la temperatura óptima está más cerca de la máxima que de la mínima. Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura máxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera. Según el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales: 1. psicrófilas o criófilas: crecen a partir de entre -5 a 5oC. a. Las llamadas psicrófilas obligadas tienen t0 óptima a 15-18oC y t0 máxima a19-22oC, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antártida es lo que pudiéramos llamar un psicrófilo extremo: tiene su óptimo de crecimiento en 4ºC, y es incapaz de crecer a 14ºC. b. Las psicrófilas facultativas (también llamadas psicrotrofas) presentan t0 óptima en torno a los 20-30oC y máximas a los 35oC. 2. Las mesófilas presentan t0 mínimas a los 10-15oC, óptimas a los 25-40oC y máximas entre 35 y 47oC. La mayor parte de las bacterias (incluyendo las patógenas) pertenecen a esta categoría. 3. Las termófilas presentan mínimos a 25oC, óptimos a 50-75oC y máximos entre 80 y 105oC. Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas (hipertermófilas), que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100oC, y que taxonómicamente pertenecen al dominio de las Archaea. a. Las termófilas estrictas (o estenotermófilas), con óptimos por encima de los 80ºC son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (Ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su óptimo nada menos que a 105ºC y puede llegar a aguantar 113ºC, y parece detiene su metabolismo (por "frío") a la "agradable" temperatura de 90ºC (!) b. Las termófilas facultativas (o euritermófilas) pueden crecer a menos de 37oC, como p. Ej. Thermus aquaticus. Veamos brevemente unos cuantos casos de bacterias (y algún microorganismo eucariótico) adaptado a medios con temperaturas extremas, y sus respectivas adaptaciones a dichas condiciones: Ejemplos de medios permanentemente fríos son la mayor parte de las aguas oceánicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan sólo 1-2oC por encima de cero) y las áreas permanentemente heladas del Ártico y de la Antártida.
- 94. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 94 En los medios helados existen pequeñas bolsas o microcavidades de agua líquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy característico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaña a mitad de la estación estival. Los psicrotrofos (psicrófilos facultativos) son más abundantes, ya que están adaptados a soportar grandes oscilaciones térmicas, y en verano pueden crecer a unos 30oC-40ºC. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y hortalizas) que se guardan en frigoríficos, alterando las cualidades organolépticas e incluso, echándolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido). Las principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos exhibidas por estos microorganismos son: enzimas más resistentes al frío; sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas; los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitándose su congelación. Los hábitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50oC) están restringidas a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenómenos volcánicos: fuentes termales volcánicas terrestres (en zonas de EE UU, Japón, Nueva Zelanda e Islandia); fuentes termales submarinas: los llamados "humeros" (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales oceánicas); fumarolas. Como ejemplo "clásico", muy conocido por documentales de divulgación, recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentración mundial de fuentes volcánicas, con géiseres que emiten a más de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones de +/- 1 ó 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullición. El riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. Allí fue donde T.D. Brock descubrió la eubacteria termófila Thermus aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente empleada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Recientemente se está recurriendo a usar la polimerasa de una arquea hipertermófila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100ºC.
- 95. Ramirez - Balqui 95 Si confeccionamos una tabla donde se agrupen distintos seres vivos en función de las temperaturas máximas a las que pueden vivir comprobaremos (Fig.1) que los procariotas, como conjunto aguantan más que los eucariotas. Dentro de los procariotas, las bacterias no fotosintéticas crecen a mayores temperaturas que las fotosintéticas. Obsérvese que existen bacterias con óptimos a 55, 70 e incluso 100oC (el asombroso Pyrodictium crece a 110oC). Como ya dijimos, el "récord" de termofilia lo tienen ciertas arqueobacterias (como la que acabamos de citar), y crecen a esas temperaturas a gran velocidad (tiempos de generación g del orden de 1-7 horas). Se han aislado bacterias termófilas en medios artificiales, como calentadores de agua domésticos e industriales. Las principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en células vegetativas bacterianas son: enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrófobo; ribosomas termorresistentes; membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos más fuertes. En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse en ésteres de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es más resistente). Algunas, además, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse "cola con cola" dos C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales. 2.2. EFECTO LETAL DEL CALOR. Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idóneo. La muerte por calor es una función exponencial de primer orden: - K . N dt dN T O sea, y como se puede constatar en el gráfico adjunto, la acción del calor supone la muerte de una fracción constante (KT) de la población sobreviviente en cada momento. La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana).
- 96. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 96 En la práctica podemos encontrarnos con gráficos distintos al anterior, debidos a desviaciones respecto de esta cinética: ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? Aquí algunos parámetros utilizados: tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura; tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D); punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min.). Ejemplos punto térmico mortal Especies 55oC Escherichia coli 60oC Mycobacterium tuberculosis 120oC Endosporas de especies muy resistentes de Bacillus. Estos tres parámetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de fabricación de conservas, centrales lecheras, etc. Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremos inactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una fracción de células viables) o bien esterilización (inactivación total). En general, entendemos por esterilización todo tratamiento de un material con un agente físico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o químico (como veremos en el capítulo 19) que acarrea la eliminación de toda forma de vida en él. Una vez estéril, el material sigue estéril indefinidamente con tal de que esté encerrado en un compartimiento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. Centrándonos de nuevo en el calor, la inactivación parcial o la esterilización se pueden lograr por calor húmedo o por calor seco. La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles, sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos C = O y H2-N . Estos enlaces se rompen más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.
- 97. Ramirez - Balqui 97 2.2.1. Calor húmedo Por lo tanto, la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de inactivación total por calor húmedo: Microorganismo Condiciones La mayoría de células vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos 80oC, 5-10 min. bacilo tuberculoso 58oC, 30 min. bacilo tuberculoso 59oC, 20 min. bacilo tuberculoso 65oC, 2 min. Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC, 60 min. La mayoría de esporas de bacterias patógenas 100oC, pocos min. esporas del patógeno Clostridium botulinum 100oC, 5,5 horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC, muchas horas esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC, 15 minutos Veamos los métodos principales de lograr esterilización de materiales por calor húmedo: Autoclave (introducido por Chamberland en 1884).- Es un aparato que permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un compartimiento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. (El funcionamiento del autoclave será oportunamente explicado en clases prácticas). Los parámetros de esterilización suelen ser: temperatura 121oC y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parámetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver última línea de la tabla anterior), que son las formas de vida que más aguantan el calor sin perder viabilidad. (Hay que tener en cuenta que, en la práctica, a veces hay que emplear condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volúmenes de líquido, habrá que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min., ya que el centro del recipiente donde va el líquido tarda más en alcanzar la temperatura de esterilización. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo también es mayor: 30 min). La acción rápida del calor húmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del agua (540 cal·g-1); ello hace que los objetos más fríos (como las muestras a esterilizar) se calienten rápidamente por condensación de agua en su superficie. Tindalización (nombre en honor de John Tyndall).- Es un método de esterilización fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100oC.
- 98. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 98 Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases sucesivas cada uno: a. en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100oC, durante 1 ó 2 horas; b. en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37oC durante 24 horas. Durante las fases de tipo a) mueren todas las células vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se produce la germinación de las esporas activadas en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirán las células vegetativas procedentes de la germinación en la fase anterior; y así sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningún microorganismo en la muestra. Como se puede ver, este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que en los últimos años ha sido reemplazado por otro método de esterilización, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilización por filtración. Consiste de hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diámetro de poro =0,22 mm). Aplicaciones principales del calor húmedo: 1. En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de medios de cultivo y soluciones. 2. En la esterilización de material quirúrgico. 3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados). En la industria conservera se emplean los parámetros ya estudiados de punto térmico mortal y tiempo térmico mortal; este último permite elegir la temperatura que altera menos las cualidades del material a conservar. El tiempo térmico mortal varía según: el tipo de material: normalmente, los materiales ácidos (tomates, frutas) requieren menos tiempo que los neutros (como el maíz o las alubias). la concentración de azúcares, proteínas o grasas: una mayor concentración de este tipo de sustancias supone emplear más temperatura y/o más tiempo. la concentración de sales: puede obligar a aumentar o disminuir los valores de tiempo y temperatura, dependiendo del tipo de microorganismos. En la industria láctea se emplean como métodos de esterilización el autoclave o la llamada uperización. La uperización consiste en un tratamiento de calor húmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. Ej.: 135-150oC durante
- 99. Ramirez - Balqui 99 1-2 seg.).- Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla, y que son más sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. Con esta inactivación parcial de la población microbiana de la leche logramos que ésta se conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y nutricionales. He aquí los procedimientos más habituales para conseguir esto: La pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y envasa rápidamente.- La pasteurización instantánea (también conocida por sus siglas en inglés HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72oC durante sólo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rápidamente. Esta técnica es la más usada actualmente, ya que: mata más rápidamente; mata mejor organismos más resistentes; altera menos el sabor; actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche). Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc.) son eliminados fácilmente. La pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor. 2.2.2. Calor seco: Como ya dijimos, la esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de electrolitos. Aplicaciones del calor seco: 1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170oC durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metálico, aceites y jaleas, etc. 2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metálicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias. 3. Incineración de materiales de desecho. 2.3. EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS. Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles para la esterilización, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación (p.
- 100. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 100 ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo, bacteriostático, sin contar aquellos organismos psicrófilos o psicrotrofos. Los efectos de someter una suspensión bacteriana a temperaturas menores de 0oC dependen de: el medio donde están suspendidas las bacterias; el modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación. 2.3.1. Congelación de la suspensión en un medio habitual. Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelación del medio, el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) entre -1 y -10oC. Pero como la tensión de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser: por pérdida de agua de la célula (cuando la congelación se efectúa lentamente), o bien por cristalización de agua en el interior (cuando la congelación se realiza rápidamente). En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la solución del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitación de sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentración de electrolitos provocan la desnaturalización de proteínas y daños a la membrana, de modo que pueden salir componentes del citoplasma (fosfato, ribosa, péptidos y nucleótidos, procedentes de la actuación de ribonucleasas y peptidasas latentes). Otro efecto de menor importancia es el daño mecánico a la pared celular y a la membrana provocada por los cristales de hielo. En general, el enfriamiento rápido es más lesivo que el lento, existiendo una velocidad óptima. Cuando una bacteria se enfría rápidamente a -35oC se producen cristales de hielo que provocan daños cuando la muestra se descongela. Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelación, y el número de ciclos de congelación-descongelación. La descongelación lenta es más letal que la rápida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo. El grado de muerte por congelación se puede desglosar en dos componentes: 1. El efecto inmediato: muertes que ocurren al congelarse la muestra; 2. El efecto de almacenamiento, consistente en la lenta pérdida de viabilidad debida al tiempo que permanecen las bacterias sobrevivientes en estado congelado, y que depende de la temperatura a la que se mantenga la muestra. Aplicaciones de la congelación:
- 101. Ramirez - Balqui 101 La congelación se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo se efectúa tanto la descongelación como la descongelación. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutéctico. en nieve carbónica (CO2 sólido), a -78oC; en nitrógeno líquido, a -180oC. Por ello, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbónica o nitrógeno líquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay métodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo. 2.3.2. Congelación en presencia de sustancias que evitan daños a las bacterias. Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir a la suspensión ciertas sustancias, como por ejemplo: Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificación amorfa y vítrea, en lugar de la cristalización, evitando así la formación de zonas intracelulares con alta concentración de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfóxido (DMSO). Materiales ricos en proteína: leche, suero, extracto de carne. Proteínas purificadas (p. Ej., la albúmina). Determinadas macromoléculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos. La suspensión bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas sustancias a -25 a -30oC, en congelador. III. LIOFILIZACION. La liofilización es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada. Aplicada a bacterias, es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidad bacteriana (varios años). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (véase epígrafe anterior), se congela sobre nieve carbónica (-78oC), y se conecta a una bomba de vacío, que provoca la desecación. La eliminación de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos años después. IV. EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas bacterianas, pero no a las endosporas. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz), de ahí que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.
- 102. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 102 En cambio, el vibrión colérico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de sólo dos horas. Las causas de la muerte son, principalmente: el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y desnaturalizantes de proteínas; daños por oxidación. La mayor eficacia de la desecación al aire se logra con 50% de humedad relativa. V. EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS. 5.1. CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLÉCULAS. Se puede definir la radiación como la propagación de energía por el espacio. Los principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son: radiación electromagnética (longitudes de onda, en nm) Radiación infrarroja (IR) 800-106 Radiación visible 380-800 Ultravioleta (UV) 13,6-380 Rayos x 0.14-13.6 Rayos 0.001-0.14 Rayos cósmicos < 0.001 La radiación particulada, con carga y masa consiste en: rayos (núcleos de He). rayos (electrones). Como se recordará, la radiación electromagnética presenta un doble aspecto: ondulatorio y cuántico (paquetes discretos de energía, cuantos o quanta). Cuando una molécula absorbe la energía de un cuanto de radiación electromagnética, se pueden producir una serie de cambios en los niveles energéticos de algunos de sus átomos. La energía de un cuanto (E) está inversamente relacionada con su longitud de onda ( , en nm), según la ecuación de Planck: λ c E h . Siendo h = constante de Planck (6.62·10-27 erg·seg-1) y c = velocidad de la luz (2.99·1017 nm·seg-1) Teniendo en cuenta los valores de las constantes y la equivalencia 1 eV =1.59·10-12 erg, la ecuación de Planck se puede expresar como:
- 103. Ramirez - Balqui 103 λ 1240 E (En eV) Sustituyendo por sus valores concretos correspondientes a distintos tipos de radiaciones electromagnéticas, se calculan fácilmente los respectivos rangos de energía: Rayos x: 9000-91 eV Luz UV: 91-3.3 eV Visible: 3.3-1.5 eV Fuentes de radiaciones: Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la luz solar (visible + UV) y los rayos cósmicos. Sin embargo, la capa de ozono de la alta atmósfera sirve de pantalla, evitando que lleguen a la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de menos de 190 nm, que son las más energéticas. Los UV generados artificialmente son apantallados por material de vidrio. Los rayos cósmicos tampoco llegan a la superficie terrestre. Las principales fuentes artificiales de radiaciones (aparte de las visibles) son: máquinas de rayos X; radioisótopos (como el Co-60); reactores nucleares; aceleradores de partículas. 5.2. CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES. El número de cuantos absorbidos por un sistema biológico es proporcional al producto de: duración de la radiación por la intensidad de la radiación y por el coeficiente de absorción del material. Los efectos derivados de la absorción de esa radiación dependen de: la energía de la radiación absorbida; la naturaleza del material. Hagamos un tratamiento del tema en función de que la radiación provoque o no ionizaciones en el material, lo cual depende de la energía de los cuantos: 1) Si la energía es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los rayos .. El fotón de gran energía incide sobre el átomo, provocando la expulsión de un electrón de gran energía (fotoelectrón), y quedando el átomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrón expulsado suele tener energía suficiente para originar una nueva ionización, de la cual surge otro electrón de alta energía, etc. produciéndose una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energía, hasta que ésta se disipa en el material: el último electrón de la cadena es captado por otro átomo o
- 104. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 104 molécula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones (uno positivo y otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrónicas ulteriores, que dan pie a cambios químicos en el sistema que se había sometido a la irradiación. 2) Si la energía es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del átomo o molécula pasan transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energético superior (entonces se habla de que el átomo o molécula están excitados), pero enseguida dicho electrón vuelve al estado energético inicial. En su regreso a su nivel energético previo, el electrón puede dar origen a una variedad de fenómenos: fluorescencia: emisión de energía a una longitud de onda mayor que la del fotón incidente; fotosensibilización: la energía se transfiere a otra molécula; reacciones fotoquímicas: se origina un cambio químico; emisión de calor: la energía simplemente se disipa en colisiones entre moléculas. La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoquímicas, aparte de calor. Pero la radiación infrarroja sólo conduce a disipación de calor, si bien ciertas bacterias fotosintéticas anoxigénicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosíntesis. 5.3. EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES. Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposición, o sea, de la cantidad de radiación a que se somete un material. Se suele medir en unidades Roentgen (R): 1 R = energía de absorción de 83 erg·g-1 de aire. Por otro lado, la dosis de absorción es la fracción de la dosis de exposición que realmente se absorbe por el sistema biológico (es decir, es la dosis biológicamente efectiva). Se suele medir en rads: 1 rad = energía de absorción de 100 erg·g-1 de aire. En la práctica, la unidad que se emplea en Biología es el megarad (Mrad), equivalente a un millón de rads, y que es el rango de la dosis requerida para esterilizaciones. También se emplea el Gray (1Gy equivale a 100 rads). En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reducción decimal (D10) para las endosporas de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las células vegetativas de la bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre específico) es de 2.200 Gy. Otras especies más "normales" poseen una dosis de reducción decimal en torno a 200-600 Gy. Compare estos datos con el valor de sólo 10 Gy como dosis letal para humanos.
- 105. Ramirez - Balqui 105 Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos x, los rayos y los radioisótopos, como el Co60 o el Cs137. Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación, mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis. 1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre alguna molécula esencial para la vida. Los estudios cuantitativos demuestran que debe de existir una molécula vital única que, al ser alterada, provoca la muerte (teoría del golpe único). Esta molécula debe ser el ADN (ya que obviamente es absolutamente esencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos), y no las proteínas, de las que existen muchas copias en la célula, y que podrían regenerarse. Los daños al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse. 2. Efecto mutagénico: deriva de la producción de daños menores al ADN que pueden repararse por mecanismos propensos a error. 3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la radiolisis del agua que provoca la aparición de radicales hidroxilo (OH-) e hidrógeno naciente (H+). El hidrógeno naciente o radical H libre es un potente reductor, y el radical hidroxilo es un potente oxidante. El radical hidroxilo reacciona fácilmente con macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y epóxidos, asimismo letales: H + O2 → HO2 2 HO2- → H2O2 + O2 Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de: material farmacéutico; material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc.); alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento). La dosis de esterilización por radiación se suele establecer en 12 veces la dosis de reducción decimal (12 D10) requerida frente a las endosporas de Clostridium botulinum. Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener unas normas y controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo y revisiones periódicas de los manipuladores.
- 106. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 106 5.4. EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA. La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda. Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas moléculas biológicas: Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm, debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptídicos. El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases púricas y pirimidínicas. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se pueden volver a sintetizar. En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm). 5.4.1. FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV. Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina): a. dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano) b. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina) c. hidratos de pirimidina. Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también se producen T-C y C-C. Se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración. A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños reviste menos significación biológica.
- 107. Ramirez - Balqui 107 El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el capítulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes. Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de transiciones T = A a C = G. 5.4.2. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS. Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así: 1. Mecanismos prerreplicativos: a. reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación directa del daño en sí. b. reparación por escisión y resíntesis. 2. Mecanismos posreplicativos: a. reparación por recombinación. b. reparación inducible de emergencia (SOS). A) Reparación fotoenzimática Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos): flavina reducida (FADH2) una pterina. Mecanismo 1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzima-sustrato [E-S]. 2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( = 300- 500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar. Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, no está claro cuál es su papel exacto. No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparación está muy extendida entre eucariotas.
- 108. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 108 B) Reparación por escisión-resíntesis. La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN. Mecanismo: 1. Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hélice. 2. Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero. 3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster "a la izquierda" del dímero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º enlace fosfodiéster "a la derecha" (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes. 4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que se había generado en la fase anterior. 5. Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración del enlace fosfodiéster del lado 5'). C) Reparación por recombinación. Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y "salta" unos 1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una recombinación con la hebra parental homóloga intacta. Mecanismo: 1. Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
- 109. Ramirez - Balqui 109 2. La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena "hermana" intacta. 3. Se produce un intercambio recíproco de cadenas. 4. El extremo 3'-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hélice "hermana") sirve de cebador a la ADN- polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena complementaria intacta del dúplex. 5. Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada "estructura de Holliday", una figura en "X" donde hay dos sobrecruzamientos ("crossing-over") que mantienen unidos entre sí a los dos duplex. 6. Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contiene ADN de nueva síntesis. Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no repara por sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el dímero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser reparado por algún otro mecanismo, como el de escisión-resíntesis. D) Reparación de emergencia (SOS) propensa a error. Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados agentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error). El sistema SOS en realidad consiste en una serie de funciones "de emergencia" ante estrés, una de las cuales es este tipo de reparación de ADN propenso a error. Otras funciones del sistema SOS son: Inducción de varios profagos (lo veremos en la sección de Virología, al tratar el fago l). Retraso en la formación del tabique transversal, por lo que las células se alargan anormalmente. (El significado adaptativo de esta respuesta de inhibición de la septación parece ser el impedir la segregación de ADN sin reparar a la célula hija, lo que podría ocasionarle la muerte). Desconexión de la respiración. Incremento de la degradación de proteínas. Descripción del sistema en una célula normal (no sometida a daños al ADN):
- 110. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 110 El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión no es total, sino que se da un nivel basal de producción de los polipéptidos correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN. Descripción del sistema en una célula severamente dañada: Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica (para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína RecA* (activada como proteasa) induce la proteólisis del represor LexA (rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula). Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes (llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que: Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparación por recombinación; Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone mejorar la reparación por escisión-resíntesis; Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagénesis. Pero) por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error). Hay dos hipótesis principales sobre este respecto: 1. Los genes umuD,C codificarían una nueva polimerasa de emergencia con menor fiabilidad de copia que las polimerasas habituales; 2. O bien, los productos de umuDC modificarían alguna polimerasa normal (como la ADN-Pol-III) de manera que ésta "relajaría" su capacidad correctora de pruebas (exonucleasa 3' → 5'), de modo que ante ausencia de molde, o ante un molde afectado por el daño colocaría nucleótidos "al azar", lo que sería la base de las frecuentes mutaciones. Hay pruebas que favorecen a esta segunda hipótesis. De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación "límite", pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones.
- 111. Ramirez - Balqui 111 5.4.3. APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV. La luz UV se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercurio de baja presión, que emiten el 90% de su radiación a 254 nm. La unidad de energía de radiación se mide en watts / (seg·cm2). Por ejemplo, una lámpara de 15 watios emite una energía de 38m watts·cm-2seg.- 1, a una muestra situada a 1 metro de la lámpara. La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis letal para células vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 watt·cm-2, pero las endosporas requieren 10 veces más dosis. El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases genéticas). 5.5. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE. A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos no tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, que este tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización fotodinámica. 5.5.1. Sensibilización fotodinámica natural. La luz visible de fuerte intensidad (p. Ej., exposición a pleno sol) es capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10- 6-10-8 seg., tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando fotooxidaciones en residuos His y Trp de las proteínas y en las bases de los ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete (1O2), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez. Así pues, en la práctica de laboratorio habitual, no es conveniente exponer las bacterias en cultivo a la luz, sino que habrán de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias fototrofas). Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno singlete y la reenvían al estado basal, no excitado).
- 112. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 112 5.5.2. Sensibilización fotodinámica artificial: Si a una suspensión de bacterias añadimos ciertos pigmentos artificiales fluorescentes (colorantes), como el rosa de Bengala, el azul de metileno, la eosina, etc., la energía del visible absorbida por dichos pigmentos no la reemiten como fluorescencia, sino que provoca cambios en proteínas y ácidos nucleicos. Esto conduce a efectos de esterilización, sobre todo por desnaturalización de proteínas. VI. EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS. Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitúan las ondas supersónicas (hasta los 200 Kc/seg.) y las ultrasónicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg.). Estos tipos de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las ultrasónicas) tienen el efecto de desintegrar las células. El fundamento de esta acción es el siguiente: el paso del sonido a través de un líquido produce cambios de presión alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m de diámetro (fenómeno de cavitación). Dichas cavidades van aumentando de tamaño y terminan colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000 atmósferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son: la célula se desintegra; si existe oxígeno en el líquido de suspensión, se forman peróxidos (como el H2O2); despolimerización de macromoléculas; cortes en ambas hebras del ADN. Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En general, son más sensibles las Gram-negativas y más resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan algunos individuos, por lo que este método no tiene utilidad para la esterilización. El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada "sonicación" o disrupción ultrasónica de células para obtener extractos celulares, en investigaciones bioquímicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de ultrasonidos o "sonicador", que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg. VII. EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA. La mayor parte de las especies bacterianas de hábitats continentales no pueden crecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los siguientes efectos adversos: aumento de la viscosidad del citoplasma; disminución de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos; (posiblemente) interferencia en procesos de transporte a nivel de membrana; (posiblemente) interferencia en la biosíntesis de proteínas;
- 113. Ramirez - Balqui 113 interferencia en la división celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin producción de tabique transversal (crecimiento sin división celular). Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones (barotolerantes y barófilas, respectivamente): Bacterias barotolerantes: Crecen a la presión atmosférica, pero aguantan hasta unas 500 atmósferas. Su hábitat son las aguas oceánicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad. Bacterias barófilas: Crecen óptimamente a más de 400 atmósferas. Podemos distinguir entre barófilas moderadas (facultativas) y barófilas extremas (obligadas): Las barófilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presión atmosférica, aunque su óptimo está a unas 400 atmósferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros. Las barófilas extremas presentan óptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de 600-700 atmósferas), y son incapaces de crecer a presión atmosférica. Se han llegado a aislar a más de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del agua es de sólo 2-3oC, suelen ser simultáneamente criófilas. Este tipo de bacterias está empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cámaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren. Aplicación práctica de las altas presiones a bacterias barosensibles: La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como prensa francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca descompresiones, lo que logra la rotura mecánica de las bacterias, con objeto (al igual que la sonicación) de obtener extractos libres de células. VIII. EFECTOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA. Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en medios tanto hipotónicos como hipertónicos, debido a la protección de una pared celular rígida y a la membrana citoplásmica semipermeable. Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presión de turgor es relativamente constante porque la membrana citoplásmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presión de turgor permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentración de solutos en su entorno (dentro de ciertos límites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos responder a continuación): ¿cómo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos cambios exteriores?.
- 114. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 114 A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva. Recordemos que las bacterias Gram-negativas poseen dos compartimentos acuosos: el citoplasma y el periplasma. Como se dijo oportunamente, en el periplasma existe un oligosacárido especial, derivado de la membrana (el MDO, consistente en 6-10 unidades de -D-glucosa unidas por enlaces (1 → 2), y con residuos de fosforilcolina y fosfatidil- etanolamina), que interviene en regular la osmolaridad. Sus grupos negativos están contrarrestados por contraiones positivos, que igualmente colaboran en la regulación osmótica. En un medio con baja osmolaridad (p. Ej., aguas fecales) aumenta la concentración del MDO, lo cual supone un aumento de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el peptidoglucano. De esta manera la presión de turgor del protoplasto se transmite al periplasma y de él al peptidoglucano, que es la estructura más resistente. B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos: bombeando iones al interior; sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa; bombeando sustancias osmoprotectoras. 1. En el caso de los iones, el ión bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema de antiporte K+/H+. Ahora bien, para que no se desequilibre la fuerza iónica, la entrada de K+ suele ir en paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser poliaminas (como la putrescina). Se ha propuesto que existe un sistema de antiporte K+/putrescina que en ciertas bacterias tiende a mantener la fuerza iónica mientras aumenta la tonicidad interior, como sistema para compensar la alta tonicidad del medio. La señal que desencadena el transporte de iones potasio es directamente la presión de turgor de la membrana y no la osmolaridad externa. 2. Como ejemplos de síntesis de solutos orgánicos compatibles y osmóticamente activos tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa. Muchas bacterias Gram-negativas sintetizan glutamato ante grandes concentraciones extracelulares de iones Na+. El mecanismo es el siguiente: al añadir grandes cantidades de Na+, se produce un eflujo (salida) de H+ al exterior de la célula, lo que supone la alcalinización del citoplasma. En estas condiciones se activa la enzima glutamato- deshidrogenasa (GDH), que sintetiza grandes cantidades de glutamato, que funciona como soluto compatible que equilibra la osmolaridad del medio.
- 115. Ramirez - Balqui 115 En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibición del uso metabólico del glutamato, por lo que este se acumula. Igualmente se da una acumulación de trehalosa por inducción de una ruta biosintética e inhibición de la ruta catabólica. La ectoína es un derivado cíclico de la prolina, sintetizado como soluto compatible por ciertas anoxifotobacterias purpúreas. Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retracción de la membrana citoplásmica. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo que conlleva la detención del crecimiento. En Gram-positivas se produce una plasmolisis auténtica (retracción de la membrana citoplásmica respecto de la pared rígida suprayacente) En Gram-negativas no existe auténtica plasmolisis, ya que la pared celular y la membrana citoplásmica se retraen al mismo tiempo. Las bacterias entéricas crecen lentamente por encima de 0.65M de NaCl. 3. Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la máxima teórica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores. La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usándolos como solutos compatibles. Ejemplos de osmoprotectores: Prolina (p. ej. en Salmonella typhimurium y Staphilococcus aureus) Betaína (glicínbetaína), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y en algunas Gram-positivas). Colina (en Escherichia coli). Ectoína en enterobacterias. Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al medio se añade 1mM de prolina. Un método normal de aislar S.aureus es comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en presencia de prolina. Algunas bacterias han desarrollado evolutivamente sistemas inducibles de transporte de estas sustancias, muy eficaces para garantizar su utilización como solutos compatibles. Es el caso de la colina en E. coli, que una vez introducida se metaboliza hasta el auténtico soluto compatible, la glicínbetaína. Algunas bacterias patógenas, al destruir tejidos de su hospedador, provocan la liberación de sustancias, algunas de las cuales les sirven como osmoprotectores ante la alta osmolaridad de los fluidos corporales. Otro mecanismo de control ante variaciones de presión osmótica presente en algunas bacterias Gram-negativas, es la variación en la proporción de porinas de membrana externa.
- 116. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 116 Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los halófilos. Uno de los ejemplos de microorganismos sacarófilos no es una bacteria, sino las levaduras, que viven en jugos vegetales, néctares, zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc. Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos extremos o hiperhalófilos. Halófilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5% de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos moderados tienen requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar, así como concentraciones determinadas de iones Na+. El papel jugado por este Na+ es: mantenimiento de los sistemas de membrana citoplásmica y transporte; estabilización de la pared celular; requerimiento por parte de muchas enzimas. Halófilos extremos (hiperhalófilos), representados paradigmáticamente por las arqueas de la familia Halobacteriaceae (halobacterias), que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K+, concentrándolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma queda prácticamente saturado con él (4 a 7 M). Esta gran concentración de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas concentraciones de cloruro sódico. Dejando aparte las bacterias halófilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por ejemplo, S. aureus), pero la inmensa mayoría de los procariotas viven a valores de actividad de agua de 0.98. Por ello, un método que ya se conocía empíricamente en la antigüedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o añadirles grandes cantidades de azúcar (como en las mermeladas). IX. EFECTO DEL pH. La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar en: Neutrófilas, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8. Acidófilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5. Alcalófilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
- 117. Ramirez - Balqui 117 La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminación de aminoácidos. Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico cae rápidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pH interior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH ácidos, el interior celular puede quedar en principio más alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer una fuerza protón motriz que les suministre energía. Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas celadoras) para corregir las proteínas desnaturalizadas. Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilos extremos u obligados): Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas del género Sulfolobus tienen su óptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta ácido sulfúrico. (Sulfolobus es un notable ejemplo de procariota extremófilo: su hábitat son fuentes termales ácidas y solfataras: es un termoacidófilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo, Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregoryi).
- 118. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 118
- 119. Ramirez - Balqui 119 CAPITULO VI ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS BACTERIAS Concepttos generralles.. Desiinffecttanttes y anttiisépttiicos.. Tiipos de desiinffecttanttes.. Quiimiiotterrápiicos de síínttesiis y anttiibiióttiicos.. IInttrroducciión.. Quiimiiotterrápiicos de síínttesiis Anttiibiióttiicos Resiisttenciia bacttrriiana a llos anttiibiióttiicos Bases genéttiicas de lla rresiisttenciia Mecaniismos biioquíímiicos iimplliicados en lla rresiisttenciia a anttiibiióttiicos
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- 121. Ramirez - Balqui 121 ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS BACTERIAS I. CONCEPTOS GENERALES Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano; bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias. En general, si no sólo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa. ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está "muerto"? El único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando técnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no crecen en medios sólidos adecuados). (Pero ni siquiera esto es garantía de que una bacteria "no viable" está "muerta": hay bacterias viables pero no cultivables. Como se ve, demostrar que una bacteria está "muerta" es algo bastante complicado). Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento y/o la viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas. Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su "muerte" o pérdida irreversible de su viabilidad). (También existen agentes físicos esterilizantes, como ya vimos en los dos capítulos anteriores). Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes. Agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Quimioterápicos son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del organismo.
- 122. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 122 II. DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS Como se recordará cuando tratamos el tema del calor como agentes esterilizante, la muerte de una población bacteriana se podía representar como una curva exponencial, expresión de la cinética de primer orden. Este tipo de cinética también es aplicable a la muerte microbiana cuando se aplica un agente químico a una concentración suficientemente alta: Sin embargo, cuando se aplican menores concentraciones del agente, se pueden encontrar cinéticas diferentes, expresables como curvas sigmoidales: Como se ve, hay un margen en el que la curva sigue una cinética de primer orden, pero dicha cinética no se puede extrapolar: obsérvese que a tiempos prolongados la curva se hace casi paralela al eje de abscisas, lo cual indica que queda una fracción de células viables. 2.1. FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE Concentración del agente y tiempo de actuación La concentración para obtener un determinado efecto, así como el rango de concentraciones en que se puede demostrar un determinado efecto, dependen de: tipo químico del desinfectante, tipo de microorganismos a eliminar, método de ensayo del efecto. Existe una estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario para matar una determinada fracción de la población bacteriana, según la siguiente expresión: c . t K n Donde C es la concentración del agente, n es el coeficiente de dilución (una constante), y t es el tiempo de actuación. Esta ecuación nos dice qué relación existe entre la variación de la concentración del agente y el tiempo para matar una fracción de la población microbiana. Por ejemplo: los fenoles poseen un coeficiente de dilución n = 5 ó 6; ello implica que aun pequeños cambios en la concentración provocan cambios muy acentuados en el tiempo para lograr un mismo efecto: así, si reducimos la concentración de fenol desde un valor dado a su mitad, necesitamos emplear 64 veces más de tiempo para conseguir matar una misma proporción de bacterias. En cambio, los hipocloritos (constituyentes de las lejías) tienen coeficiente n = 1, lo que se refleja en que pequeños cambios en la concentración requieren pequeños cambios en el tiempo de aplicación. Finalmente, y refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren al mismo tiempo, ni siquiera cuando se aplica un exceso del agente (repásense los gráficos anteriores).
- 123. Ramirez - Balqui 123 pH. El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionización del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a través de las membranas biológicas, y por lo tanto son más efectivos. los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH ácidos; los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos. Temperatura Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. Pero con el fenol, la subida de 10 grados representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia. Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población microbiana Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias; Según la fase de cultivo; Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más resistencia); Número de microorganismos iniciales. Presencia de materiales extraños La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante. Los principales mecanismos por los que se pierde actividad son: adsorción (o sea, absorción superficial) del desinfectante a coloides de proteínas; formación de complejos inertes o poco activos; unión de grupos activos del desinfectante a proteínas extrañas. Ejemplos: los agentes mercuriales se inhiben por sustancias que lleven grupos sulfhidrilo (-SH). las sales cuaternarias de amonio se inhiben en presencia de jabones y lípidos. Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este factor, determinando previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica. 2.2. DETERMINACION (EVALUACION) DE LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE. La determinación de la actividad desinfectante de un determinado agente es necesaria para conocer su posible eficacia. El método primario que se viene empleando desde hace muchos años es comparar la potencia del compuesto a ensayar con la de un desinfectante-tipo o estándar, que por motivos históricos es el fenol.
- 124. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 124 Coeficiente fenol o coeficiente fenólico: consiste en la siguiente relación. máxima dilución del fenol que mata a ese microorganismo en 10 min, pero no en 5 min. máxima dilución del desinfectante que mata a un microorganismo en 10 min, pero no en 5 min. En los EEUU, la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos (F.D.A.= Food and Drug Administration) emplea un test oficial para desinfectantes en condiciones normalizadas, usando una serie de cepas bacterianas concretas, cuya susceptibilidad al fenol se conoce exactamente: una cepa concreta de Salmonella typhimurium una cepa de Staphylococcus aureus una cepa de Pseudomonas aeruginosa El método consiste, en esencia, en lo siguiente: 1. un cultivo de una de estas cepas se diluye 10 veces (1/10) en sucesivas diluciones del desinfectante problema, y se dejan a 20 minutos; 2. de cada una de las diluciones se siembran alícuotas, a los 5 y a los 10 minutos, en placas de Petri provista con un medio de cultivo adecuado; 3. se determina el coeficiente fenol según la fórmula que hemos expuesto; 4. una vez determinado, se recomienda usar concentraciones 5 veces superiores a las indicadas por el coeficiente fenol. Limitaciones de este método: El coeficiente fenol sólo es indicativo cuantitativamente en desinfectantes químicamente similares al fenol, y que tengan coeficientes de dilución (n) parecidos. Aun cuando conozcamos el coeficiente fenol de un compuesto, su valor indicativo se limita a las diluciones que se hayan empleado en la determinación. Hay que atender a las condiciones de valoración, ya que como dijimos antes, la presencia de materia orgánica supone una merma del poder real de desinfección. Para solucionar algunos de estos inconvenientes se han puesto a punto otros métodos de valoración: Prueba de la concentración equivalente Consiste en determinar la concentración del desinfectante a ensayar que ejerce el mismo efecto sobre la bacteria de referencia que otra concentración de un desinfectante-tipo (estándar). Determinación de la toxicidad del desinfectante Como se comentó anteriormente, no todos los agentes esterilizantes son aptos como desinfectantes de tejidos, ya que pueden presentar efectos tóxicos. Por ello, siempre que se intenta introducir el uso de un nuevo compuesto desinfectante, hay que evaluar su potencial tóxico, mediante el llamado índice de toxicidad, que es el cociente entre el poder desinfectante y el poder tóxico
- 125. Ramirez - Balqui 125 III. TIPOS DE DESINFECTANTES. Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción: A) AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA. 1). Detergentes. a). acatiónicos b). aniónicos c). no iónicos 2). Compuestos fenólicos. a). fenol b). cresoles c). difenilos halogenados d). alquilésteres del para-hidroxibenzoico e). aceites esenciales de plantas 3). Alcoholes. a). etanol b). isopropanol B) AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS. 1). Ácidos y bases fuertes 2). Ácidos orgánicos no disociables C) AGENTES MODIFICADORES DE GRUPOS FUNCIONALES. 1). Metales pesados a). mercuriales b). compuestos de plata c). compuestos de cobre 2). Agentes oxidantes a). halógenos b). agua oxigenada c). permanganato potásico d). ácido peracético 3). Colorantes a). derivados de la anilina b). derivados de la acridina (flavinas) 4). Agentes alquilantes a). formaldehido b). glutaraldehido c). óxido de etileno d). -propionil-lactona
- 126. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 126 3.1. AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA CELULAR. Los solventes orgánicos (fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos (detergentes) dañan la integridad estructural de la membrana (es decir, la disposición ordenada de lípidos y proteínas), de modo que interfieren con su función, ejerciendo un efecto neto de Interferencia con procesos de transporte y metabolismo energético; Salida de pequeñas moléculas de la célula. 3.1.1. Detergentes (desinfectantes tensioactivos o surfactantes). Los detergentes sintéticos, al igual que los jabones, contienen una porción hidrofóbica (normalmente una larga cadena lipófila) y una porción hidrófila (un grupo polar), lo cual les permite formar micelas en solución acuosa, así como formar capas que cubren y solubilizan moléculas hidrófobas. Según sea la porción hidrófila, los detergentes se pueden clasificar en: Detergentes iónicos: detergentes catiónicos (grupo activo con carga positiva) detergentes aniónicos (grupo activo con carga negativa) Detergentes no iónicos (no suelen tener actividad antimicrobiana). 3.1.1.1. Detergentes catiónicos. Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad desinfectante, siendo activos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los principales son los llamados compuestos de amonio cuaternario: Sales de amonio cuaternario, sobre todo aquellas que van como cloruros o bromuros. Su fórmula general se puede representar así: Los cuatro sustituyentes (R1 a R4) del N son cadenas de hidrocarburos variados. Las sales de amonio cuaternario más activas son aquellas que tienen tres grupos alquílicos cortos y un grupo alquílico largo: cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio. Mecanismo de acción: La porción hidrófoba penetra en las membranas, mientras que el grupo polar catiónico se asocia con los fosfatos de los fosfolípidos, provocando alteraciones en dichas membranas, reflejadas en la pérdida de su semipermeabilidad, con salida de metabolitos de N y P desde el citosol. Es entonces cuando el detergente puede entrar al interior celular, con un efecto secundario de desnaturalización de proteínas. Su actividad se mejora a pH alcalino. Son rápidamente bactericidas a concentraciones muy bajas (del orden de una parte por millón, 1 ppm), siempre que en el material a tratar no exista materia orgánica.
- 127. Ramirez - Balqui 127 Usos, ventajas e inconvenientes: Tienen baja toxicidad, por lo que se pueden emplear como desinfectantes y antisépticos de la piel. Se emplean igualmente en la desinfección de material de industrias alimentarias.Su actividad se ve neutralizada por jabones y fosfolípidos, precipitando en su presencia. 3.1.1.2. Detergentes aniónicos. Con grupos carboxilo como porción hidrófila: jabones saponinas sales biliares ácidos grasos disociables Con grupos sulfato como porción hidrófila: dodecilsulfato sódico (SDS), también llamado laurilsulfato sódico sulfonato de alquilbenceno Mecanismo: Provocan una gran disrupción de membranas, con efectos de lisis. Son activos sobre todo a pH ácido, preferentemente sobre bacterias Gram-positivas, pero poco sobre Gram-negativas, ya que éstas quedan más protegidas por la barrera del lipopolisacárido de la membrana externa. Usos: Cuando los detergentes aniónicos se combinan con ácidos, se logran desinfectantes sanitarios muy potentes (debido al efecto sinérgico de ambos componentes) y de rápida actuación (unos 30 segundos). 3.1.1.3. Detergentes no iónicos. No tienen actividad antimicrobiana, pero algunos tienen empleo en otros campos de la Microbiología: los ésteres del ácido oleico (bajo nombres comerciales como CarbowaxJ, Tween-80J) pueden adicionarse a medios de cultivo para evitar la formación de grumos y favorecer el crecimiento disperso de ciertas bacterias (como Mycobacterium tuberculosis); además el oleico puede estimular el crecimiento. 3.1.2. Fenoles. Son rápidamente bactericidas a bajas concentraciones, causando: daños a membranas, con pérdida de constituyentes citoplásmicos; inactivación irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana; desnaturalización de proteínas. Tienen baja solubilidad en agua, por lo que se emplean en fórmulas que incluyen agentes emulsificadores (jabones) que, además, aumentan su actividad.
- 128. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 128 3.1.2.1. Fenol. El fenol o ácido carbólico, históricamente uno de los primeros desinfectantes en usarse, sólo se emplea en la actualidad como patrón para ensayar el poder desinfectante de otros compuestos. A partir del fenol se pueden lograr desinfectantes con mayor actividad antibacteriana y con menor toxicidad sustituyendo hidrógenos del anillo bencénico por radicales alquílicos o por halógenos. Hé aquí algunos ejemplos: 3.1.2.2. Cresoles. Son los alquil-fenoles. El radical alquílico puede estar en posición orto, meta o para, dando respectivamente el orto-cresol, el meta-cresol y el para- cresol. Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada tricresol. Se obtienen por destilación del alquiltrán de carbón, y se emplean como emulsiones de jabón verde bajo los nombres comerciales de Lysol J y Creolín J. Se usan como desinfectantes de material de desecho bacteriológico y como desinfectantes de la piel. 3.1.2.3. Difenilos halogenados. El hexaclorofeno (hexacloro-orto-difenilmetano) es bacteriostático a bajas concentraciones (sobre todo contra cocos Gram-positivos), incluso incorporado en jabones, pasta de dientes y cosméticos. Algunas marcas comerciales incluían hace unos años este compuesto, hasta que se comprobó que su absorción por la piel, sobre todo inflamada, puede causar neurotoxicidad e incluso, toxicidad sistémica, por lo que en la actualidad ha dejado de usarse. 3.1.2.4. Alquilésteres del para-hidroxibenzoico. Actúan de forma similar a los alquilfenoles, pero no son tóxicos, debido a que al ser ingeridos, se hidrolizan rápidamente, dando el inocuo para- hidroxibenzoato. Se emplean como conservantes de alimentos y de productos farmacéuticos. 3.1.2.5. Ciertos aceites esenciales de origen vegetal. Desde la antigüedad, y de modo empírico, se vienen usando algunos aceites esenciales de plantas aromáticas como conservantes y antisépticos, ya que como se ha podido comprobar, contienen varios compuestos fenólicos:
- 129. Ramirez - Balqui 129 el timol (de Thymus, los tomillos); el eugenol se emplea en odontología como antiséptico. 3.1.3. Alcoholes. Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región hidrocarbonada de los lípidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son esterilizantes. Su acción desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la cadena alifática de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 átomos de carbono (C8-C10), ya que los alcoholes de cadenas más largas de C10 tienen una baja solubilidad en agua. 3.1.3.1. Etanol (CH3-CH2OH). Se emplea en desinfección de la piel antes de inyecciones cutáneas, así como en desinfección de los termómetros clínicos, siempre que se deje el tiempo suficiente de contacto. Es más efectivo en soluciones acuosas entre 50-70%, ya que para su mejor acción se implica la intervención del agua. A 100% de pureza es poco efectivo. 3.1.3.2. Isopropanol. Es menos volátil y más efectivo que el etanol. Se emplea igualmente en desinfección de termómetros. Sin embargo, su efecto tóxico (narcótico) es mayor y más duradero que aquel. 3.2. AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS. 3.2.1. Ácidos y álcalis fuertes. Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OH- disociados, respectivamente. En principio, su actividad es proporcional al grado de disociación, pero algunos hidróxidos son más potentes de lo sugerido por su mero grado de disociación, debido a la acción tóxica directa que puede ejercer el catión metálico. Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien la acción de bases fuertes. Tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha para aislarlo y purificarlo: se licúa un esputo de enfermo sospechoso en una solución 1M de sosa (NaOH) y se deja 30 minutos antes de sembrar. Bajo estas condiciones, prácticamente sólo sobrevive el Mycobacterium tuberculosis. 3.2.2. Ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos, que son poco disociables, ejercen sus efectos en cuanto a moléculas intactas (sin disociar), que penetran a la célula. El ácido benzoico y el ácido sórbico se usan ampliamente como conservantes alimentarios. Ciertos ácidos (como el acético, láctico, propiónico) aparecen en alimentos fermentados, actuando como conservantes naturales. Estos mismos, así como el
- 130. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 130 cítrico se pueden añadir a otros tipos de alimentos, para prolongar el periodo de posible almacenamiento de los productos. 3.2.3. El ácido bórico se ha usado como conservante (a veces ilegal) de alimentos, así como en oftalmología. 3.3. AGENTES MODIFICANTES DE GRUPOS FUNCIONALES DE PROTEINAS Y DE ACIDOS NUCLEICOS. Esta amplia clase de agentes se caracteriza, en general, por los siguientes efectos: alteran grupos que forman parte de los centros activos de enzimas y otras proteínas; alteran grupos funcionales de ácidos nucleicos, componentes de pared y de membrana. Como ya vimos en la clasificación de agentes desinfectantes, dentro de este grupo se distinguen a su vez: 1. metales pesados 2. agentes oxidantes 3. tinturas de colorantes 4. agentes alquilantes 3.3.1. Metales pesados. Las sales solubles de Hg, As, Ag, Cu, etc., "envenenan" la actividad enzimática formando mercáptidos con los grupos -SH de la cisteína. También interaccionan con -NH2, -COOH y radicales fosfato. Los más efectivos son los derivados del mercurio y de la plata (actúan a menos de 1 ppm). 3.3.1.1. Mercuriales. Se vienen usando desde antiguo en Medicina. Cloruro de mercurio (HgCl2). En solución al 0,1% fue muy usado como desinfectante potente, pero es muy tóxico, y apenas se emplea en la actualidad. Compuestos orgánicos de mercurio (como el Mercurocromo, la Mercromina, el Mertiolato): No son totalmente fiables como desinfectantes y presentan cierta (aunque baja) toxicidad, pero se emplean mucho como antisépticos de la piel y de heridas. Sales de fenilmercurio. Son potentes inhibidores no sólo de bacterias, sino de levaduras, hongos y algas. Se usan especialmente en el control de posibles contaminantes microbianos (p. ej., bacterias oportunistas del género Pseudomonas) en productos farmacéuticos, cosméticos y oftalmológicos.
- 131. Ramirez - Balqui 131 3.3.1.2. Compuestos de plata. Bien sea en forma de sales solubles, o en preparaciones coloidales, los compuestos de plata se usan ampliamente como antisépticos, aunque están restringidos, al tener efectos irritantes y cáusticos. Nitrato de plata (AgNO3). Es muy bactericida frente al gonococo (Neisseria gonorrhoeae), y por ello se usa habitualmente para prevenir la oftalmia gonocócica del recién nacido. Coloides orgánicos de plata. En ellos los iones Ag+ se van liberando lentamente. Tienen efectos bacteriostáticos, y encuentran su principal aplicación en oftalmología. Cremas de nitrato de plata y sulfodiazina de plata. Usadas para el tratamiento de quemaduras, han reducido notablemente la mortalidad derivada de las grandes quemaduras. 3.3.1.3. Sales y compuestos de cobre. No tienen aplicación en Bacteriología Médica, pero se emplean en Agricultura para el control de hongos y algas. 3.3.2. Agentes oxidantes. Los efectos de los agentes oxidantes que se tratan a continuación son la inactivación de proteínas enzimáticas (convirtiendo los radicales -SH en disulfuros -S-S-). Además, los más potentes también atacan radicales amino, el grupo indol (presente en el triptófano), y la tirosina. 3.3.2.1. Halógenos. Son bactericidas muy útiles y muy potentes. El iodo no tiene parangón como desinfectante de la piel, y el cloro no tiene igual en el tratamiento de aguas. Yodo: Aparte de su efecto oxidante, se combina irreversiblemente con residuos de tirosina de las proteínas. Sus principales presentaciones son la tintura de iodo y los iodóforos. Tintura de iodo: es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en alcohol de 70%. Su máximo efecto bactericida lo tiene a pH<6. Es un magnífico antiséptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un efecto doloroso y cáustico en heridas abiertas. Iodóforos: son mezclas de iodo con agentes tensioactivos (detergentes), en los que éstos actúan como portadores del iodo, al que van liberando lentamente, sin provocar irritación. También se emplean en desinfección de instalaciones de industrias alimentarias.
- 132. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 132 Cloro. El cloro fue uno de los primeros antisépticos en usarse (antes de conocerse su mecanismo, e incluso antes de que se supiera el auténtico papel de los microorganismos en las enfermedades infecciosas). Holmes (Boston, 1835) y Semmelweiss (Viena, 1847) lo introdujeron en la práctica de los médicos y matronas para impedir la transmisión de la sepsis puerperal, que era contagiada de mujer a mujer por las manos de los doctores y de las parteras, y que era una notable causa de mortalidad de mujeres durante muchos siglos. El cloro se presenta bajo las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberación de cloro libre (Cl2); a su vez, el Cl2 reacciona con el agua para dar ácido hipocloroso, que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte: Cl2 + H2O → ClOH + H+ + Cl- (ClO)2Ca + H2O → Ca++ + H2O + 2 ClO- (ClO)2Ca + 2H2O → Ca(OH)2 + 2 ClOH La disociación del ácido hipocloroso depende del pH (se realiza a pH<7) ClOH → H+ + ClO- Cloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloración de aguas para bebida y de aguas de piscinas. Su actividad se ve muy influida (mermada) por la presencia de materia orgánica; por ello, se suele determinar la demanda de cloro del agua a tratar. Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso mata rápidamente (15-30 segundos) a sólo 1 ppm. Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de litio. A 200 ppm de cloro se usan ampliamente, ya como líquidos (lejías), o en polvo, en industrias alimentarias y lácteas (para desinfectar el equipamiento y maquinaria que ha de entrar en contacto con los alimentos a procesar), en restaurantes, hoteles, hospitales, etc. 3.3.2.2. Agua oxigenada. El peróxido de hidrógeno (H2O2), en solución al 3%, se usó en otro tiempo como desinfectante, pero está actualmente en desuso, debido a que algunas bacterias son resistentes, por la posesión de catalasas y peroxidasas. Además, en desinfección de heridas abiertas su efecto es muy pobre, porque el agua oxigenada es descompuesta por la catalasa tisular. Se emplea en la desinfección de lentillas blandas, dejando tiempo suficiente de actuación. También, en desinfección de superficies inertes y equipos quirúrgicos.
- 133. Ramirez - Balqui 133 3.3.2.3. Permanganato potásico (K3MnO4). Al 1%, se usa como antiséptico uretral. 3.3.2.4. Acido peracético (CH3-CO-O-OH). Es un fuerte agente oxidante. En forma de vapor se usa en la esterilización de cámaras de cría de animales libres de gérmenes. 3.3.3. Tinturas de colorantes básicos. Algunos colorantes derivados de la destilación del alquitrán de carbón, sobre todo los trifenilmetanos y las acridinas, no sólo tiñen las bacterias (recuérdense las prácticas), sino que también actúan como antibacterianos, incluso a pequeñas concentraciones. Los colorantes básicos son los más efectivos. En general, su mecanismo depende de su afinidad hacia los grupos fosfato (ácidos) presentes en las nucleoproteínas. Encuentran su uso como antisépticos de lesiones dermatológicas, infecciones de la piel y pequeñas heridas. Su principal inconveniente es que muchos de ellos se inactivan en presencia de suero y otras proteínas. 3.3.3.1. Colorantes de trifenilmetano: Son derivados de la anilina. Entre ellos se encuentran el verde brillante, el verde malaquita, el violeta de genciana, el violeta cristal y la fuchsina básica. Son muy selectivos hacia bacterias Gram-positivas, sobre las que son efectivos a sólo 0,2-2 ppm. En cambio, las Gram-negativas suelen ser resistentes, debido a su membrana externa. El efecto antibacteriano se debe a la pseudobase, que es más lipófila que el respectivo catión, y bajo esa forma accede al interior celular, donde se une a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos. 3.3.3.2. Colorantes derivados de la acridina (llamados flavinas, por su color amarillento -Lat: flavus-). Los ejemplos típicos son la acriflavina, la proflavina y la tripoflavina. Interfieren en la biosíntesis de ácidos nucleicos (intercalándose en la doble hélice del ADN) y proteínas. Son bactericidas y bacteriostáticos sobre una gran diversidad de bacterias. A diferencia de las anilinas, ejercen su acción también en presencia de materiales como suero, pus, etc. Su uso principal es la antisepsia de heridas.
- 134. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 134 3.3.4. Agentes alquilantes. Son agentes esterilizantes, activos tanto sobre células vegetativas como sobre esporas, que ejercen su efecto letal por su acción alquilante de proteínas y ácidos nucleicos. 3.3.4.1. Formaldehido (HCHO). La alquilación la produce reemplazando hidrógenos lábiles de ciertos grupos químicos (-NH2, -OH, -COOH y -SH), produciendo: hidroximetilaciones condensaciones (entrecruzamientos). Usos comerciales: como gas, en la descontaminación de habitaciones; como formalina (solución acuosa al 35%); como paraformaldehido (polímero sólido de 91-99% de pureza). La formalina se emplea para preservar tejidos, en líquidos de embalsamamiento, y al 0,2-0,4% en la preparación de vacunas de virus. 3.3.4.2. Glutaraldehído. Es menos tóxico y más potente que el formaldehído, y no se afecta por materiales con proteínas. Cada vez se emplea más como esterilizante frío de instrumental quirúrgico. Es el único recomendado para esterilizar equipamiento de terapia respiratoria. 3.3.4.3. Oxido de etileno. Tiene un efecto similar al del formaldehído: Sustituciones y entrecruzamientos irreversibles en grupos amino, sulfhidrilo, etc., de proteínas. También reacciona con grupos fosfato y anillos nitrogenados de los ácidos nucleicos. Es un agente empleado como esterilizante gaseoso, aunque es de acción lenta. Se emplea cuando no se puede recurrir a la esterilización por calor: esterilización de material de plástico, drogas, ciertos productos biológicos, equipamiento electrónico. La operación se realiza en cámaras parecidas al autoclave. Sin embargo, es un método caro y exhibe ciertos riesgos: presenta acción vesicante y toxicidad para el hombre (mutágeno y carcinógeno). 3.3.4.4. -propionil-lactona. Es 25 veces más activa que el formaldehído. Actúa como gas en presencia de 80-90% de humedad relativa, aunque es poco penetrante. IV. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS Y ANTIBIÓTICOS. INTRODUCCIÓN Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un
- 135. Ramirez - Balqui 135 organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los tejidos. Recordemos aquí esta página notable de la historia de la Microbiología: 1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de síntesis como "balas mágicas" selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es efectivo contra la sífilis. Acuña el término "quimioterapia". 1932-35 Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo. 1940 Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas. Estamos en plena "Edad de oro de la Quimioterapia de síntesis". 1929 Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacéutica se muestra "indiferente". 1940 Chain y Florey purifican la penicilina. 1944 Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una búsqueda de microorganismos productores de antibióticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos. V. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS 5.1. INHIBIDORES EN LA RUTA DE BIOSINTESIS DEL TETRAHIDROFOLATO (THF). La ruta biosintética del ácido tetrahidrofólico está ilustrada en la Fig.1. El THF es lo que se denomina habitualmente "donador de unidades de 1 átomo de carbono", y los seres vivos lo requieren en ciertas rutas biosintéticas: biosíntesis de los aminoácidos Met, Gly. Además, las Eubacterias lo necesitan para el grupo formilo del fMet-ARNt (el ARN transferente que incorpora la formil-metionina al comienzo de la proteína). Biosíntesis de las purinas y pirimidinas, y sobre todo del dTMP. Biosíntesis del pantoténico. Como veremos a continuación, sobre algunos pasos de esta ruta actúa una serie de agentes quimioterápicos, muchos de ellos con gran importancia clínica. 5.1.1. SULFAMIDAS (SULFONAMIDAS). Como ya hemos comentado, su descubrimiento y la comprobación de su acción quimioterápica, marcaron el comienzo de la Quimioterapia con criterios racionales. Despertaron gran interés cuando se mostró que su mecanismo de acción depende del hecho de que funcionan como análogos de metabolitos, actuando como inhibidores competitivos respecto de cierta enzima.
- 136. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 136 Domagk (1935), siguiendo la estela de Ehrlich, descubre que el Rojo de Prontosilo confiere protección a ratones inoculados experimentalmente con estreptococos. Sin embargo, se vio que este mismo compuesto no inhibía a los mismos estreptococos in vitro, es decir, en tubo de ensayo o en placas de Petri. ¿Cuál era la razón de este disimilar comportamiento de esta sustancia in vivo e in vitro? La explicación la encontró el matrimonio Tréfouël (que a la sazón trabajaba en el Instituto Pasteur): el metabolismo de los ratones rompe el Rojo de Prontosilo, que por sí mismo es inactivo contra las bacterias, generando el compuesto activo (con actividad antibacteriana): la sulfanilamida (para-aminobencenosulfonamida). A partir de la sulfanilamida se sintetizaron desde entonces gran número de derivados por sustitución de uno de los hidrógenos del grupo sulfonamida, formando estos derivados la llamada familia de las sulfamidas. Ejemplos: sulfapiridina (por unión del grupo piridina) sulfatiazol (con el grupo tiazol) sulfadiazina (con el grupo pirimidina) sulfaguanidina. Lo que tienen en común las sulfamidas con actividad antibacteriana es: tener libre el grupo amino en para (o, como le ocurre al rojo de Prontosilo, que quede libre en el organismo hospedador como consecuencia de algún procesamiento metabólico); grupo sulfona (-SO2-) unido al anillo bencénico; La sustitución del grupo amido unido a la sulfona, aunque no modifica sustancialmente la actividad antibacteriana, puede suponer una serie de ventajas de tipo farmacológico: disminuir la toxicidad hacia el organismo hospedador; aumentar su solubilidad en agua; mejorar la absorción del compuesto por el intestino (lo que permite administración vía oral); mayor persistencia de la sulfamida en el organismo (excreción más lenta), lo que permite dar menos dosis para lograr el mismo efecto. La introducción de las sulfamidas en los años 40 supuso un gran éxito en el tratamiento de enfermedades provocadas por cocos Gram-positivos (infecciones estreptocócicas y neumonías por el neumococo). Aunque la "época dorada de las sulfamidas" ya ha pasado (debido sobre todo al ulterior descubrimiento de antibióticos naturales), hoy día siguen empleándose en el tratamiento de infecciones de las vías urinarias, algunas formas de meningitis, y en Veterinaria.
- 137. Ramirez - Balqui 137 Mecanismo de acción de las sulfamidas (descubierto por Woods y cols. en 1940): Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se debe al hecho de que funcionan como análogos estructurales del ácido para- aminobenzoico (PABA), inhibiendo competitivamente por el acceso a la enzima dihidropteroil-sintetasa. Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la condensación del PABA con el 2-amino,4-hidroxi, 6-hidroximetil dihidropteroil-pirofosfato, que lleva a la síntesis de ácido dihidropteroico (una de las fases intermedias de la síntesis del tetrahidrofólico -THF). En la figura se puede apreciar que el PABA y las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida es usada por la enzima como un sustrato alternativo al PABA. En este caso, la enzima cataliza una reacción que genera un producto que no puede actuar como intermediario en los siguientes pasos de la ruta de síntesis del THF. Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus necesidades de THF las han de satisfacer sintetizándolo a partir de PABA usando la ruta de la que estamos hablando. Sin embargo, los animales son resistentes, debido a que carecen de esta ruta, y en cambio, se aprovisionan de fólico directamente en su dieta. Pero áun más: en teoría el ácido fólico de la dieta del organismo hospedador podría anular el efecto terapéutico si fuera captado por la bacteria, pero en la realidad esto no ocurre, porque el fólico no puede entra a la célula bacteriana. El notable éxito terapéutico de las sulfamidas, junto con el desentrañamiento de su mecanismo de acción, condujo durante los años 40 y 50 a una gran línea de investigación consistente en sintetizar compuestos que fueran análogos de factores bacterianos de crecimiento, con la esperanza de "diseñar" racionalmente nuevos quimioterápicos. Sin embargo, el gran esfuerzo de búsqueda no rindió apenas frutos. Y la razón hay que buscarla de nuevo en la excepcional confluencia de hechos que acabamos de citar para las sulfamidas y que hacen que las sulfamidas funcionan tan bien: inhibición competitiva, presencia de la ruta en bacterias pero ausencia en animales, la no entrada del fólico en bacterias pero sí en las células animales. Esta "suerte" no ha acompañado cuando se ha investigado el posible potencial de análogos de otros metabolitos. 5.1.2. SULFONAS. Son derivados de la dapsona (4,4'-diamino-difenilsulfona). Aunque no se usa contra infecciones normales, ha encontrado una importante aplicación en el tratamiento de la lepra (producida por Mycobacterium leprae); de hecho es el quimioterápico de elección para esta enfermedad. Probablemente su mecanismo de acción esté basado en actuar como competidor del PABA. 5.1.3. PARA-AMINOSALICILICO (PAS). Es uno de los agentes que se emplean para el tratamiento de la tuberculosis (provocada por Mycobacterium tuberculosis). Alcanza el interior de los monocitos
- 138. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 138 y macrófagos, que son las células donde penetra el bacilo tuberculoso (que es un parásito intracelular) Al igual que el PAS, las sulfonas parecen actuar como competidores del PABA, pero se desconoce la razón por la que estos dos compuestos sean tan específicos de las especies patógenas de Mycobacterium. 5.1.4. INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO-REDUCTASA (DHFR). El último paso en la síntesis del THF es la reducción del dihidrofólico (DHF), catalizado por la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Esta reacción es inhibida por dos quimioterápicos: el metotrexato, que al ser tóxico no encuentra aplicación clínica; el trimetoprím, que tiene un uso clínico, sobre todo en terapia sinérgica junto con el sulfometoxazol (una sulfamida). Este doble quimioterápico se emplea contra infecciones urinarias recurrentes, bronquitis crónicas por neumococos, y algunas infecciones de Salmonella y Shigella. Tienen efectos bactericidas, con alta afinidad hacia la enzima DHFR bacteriana, pero baja hacia la DHTR de animales. Esto deriva del hecho de que, aunque la mayor parte de los seres vivos tienen DHFR, la enzima bacteriana difiere en estructura respecto de la de mamíferos. Existen inhibidores específicos de las versiones de la DHFR de ciertos protozoos parásitos: así por ejemplo, la pirimetamina y el proguanil se usan contra Plasmodium, el agente de la malaria. Incluso el metotrexato se puede emplear en el tratamiento de ciertos cánceres. 5.2. ISONIAZIDA. Es la hidrazida del ácido isonicotínico (también conocida por sus iniciales inglesas, INH). Como se puede ver, es un análogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el piridoxal. e incluso intracelularmente, lo que permite su empleo contra las especies patógenas de Mycobacterium, y en general contra bacterias ácido-alcohol resistentes (Nocardia, Corynebacterium). Mecanismo de acción: Ejerce varios efectos, probablemente debido a mecanismos pleiotrópicos (relacionados entre sí): interferencia -por mecanismo aún desconocido- con la biosíntesis de la pared celular de las bacterias AAR, que conduce a desorganizar los ácidos micólicos; actuación como antimetabolito de nicotinamida y piridoxal; activación de la NAD-asa, lo que conduce a reducir el "pool" de NAD.
- 139. Ramirez - Balqui 139 5.3. QUINOLONAS. El ácido nalidíxico (4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetizó en 1962, y encontró su aplicación en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se concentra. Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas, como por ejemplo el ciprofloxacín. Presentan 600 veces más actividad que el nalidíxico, y actualmente se recetan frecuentemente como quimioterápicos de amplio espectro. Mecanismo de acción: Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos subunidades de tipo A y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía para la reacción. El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la fase en que el ADN está unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria. En la sección 3.5 de este capítulo (sobre antibióticos que inhiben el metabolismo de los ácidos nucleicos) veremos algunos que actúan sobre las subunidades de tipo A. 5.4. NITROFURANOS. Los nitrofuranos, como por ejemplo la nitrofurantoína, tienen efecto contra Gram-positivas y Gram-negativas, sobre todo en la orina, siendo poco efectivos en otros fluidos corporales. 5.5. 5-FLUOROCITOSINA (FLUCITOSINA, 5FC). Es un análogo estructural de la citosina, interfiriendo con la síntesis de ADN y ARN. Su aplicación es como antifúngico, sobre todo contra infecciones por algunas levaduras. VI. ANTIBIÓTICOS. Los antibióticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibióticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibióticos semisintéticos), que a pequeñas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostáticos), tras ser administrados por vía adecuada a un organismo receptor. La mayor parte de los antibióticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium, Cephalosporium, etc.). Se conocen unos 5 000 antibióticos distintos, y cada año se descubre unos 300 nuevos. Su importancia económica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 TM de antibióticos producidas al año, por un valor equivalente a 400.000 millones de pesetas.
- 140. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 140 La mayor parte de los antibióticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de etiología bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad antitumoral. Desde el punto de vista químico, se clasifican en grandes familias: antibióticos que contienen carbohidratos; lactonas macrocíclicas; quinonas y compuestos relacionados; antibióticos peptídicos y con aminoácidos; heterociclos del N; heterociclos del O; aromáticos; alifáticos; etc. La mayoría de los antibióticos son moléculas complejas, con regiones hidrofóbicas que facilitan el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la interacción de la molécula con su diana macromolecular. Para estudiarlos es más útil agrupar a los antibióticos no por clases según su naturaleza química, sino en función de las "dianas" sobre las que actúan y con las que interfieren: A) antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular B) antibióticos que actúan sobre la membrana celular C) antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas D) antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos. Los antibióticos más abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosíntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la función del ribosoma. 6.1. INHIBIDORES DE LA BIOSINTESIS DE LA PARED CELULAR BACTERIANA. 6.1.1. FOSFOMICINA (FOSFONOMICINA). Este antibiótico de estructura muy simple está producido por Streptomyces fradiae. Su acción inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reacción de la síntesis del PG, a saber, impidiendo la condensación reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello lo logra uniéndose con la enzima transferasa correspondiente, inactivándola. Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado aplicación en la clínica (se empleó en España, pero no está admitido en los EE UU). 6.1.2. CICLOSERINA. Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibiótico muestra cierto parecido estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que actúa como inhibidor competitivo de las dos reacciones secuenciales de la síntesis del PG donde aparece la D-ala:
- 141. Ramirez - Balqui 141 inhibe la racemasa que cataliza la conversión de L-ala en D-ala; inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el dipéptido D-ala-D-ala). La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos enzimas. Es un antibiótico de amplio espectro, pero apenas se emplea clínicamente, debido a su neurotoxicidad. Se recurre a él sólo para tratar ciertos casos de tuberculosis, en combinación con otros antibióticos. 6.1.3. VANCOMICINA. Es un glucopéptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rápida e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapéptido del precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidación. Es un antibiótico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias Gram-positivas. Recientemente se está usando frente a infecciones severas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus pneumoniae que sean resistentes a otros antibióticos. Es la droga de elección ante colitis asociadas a antibióticos ocasionadas por Clostridium difficile. 6.1.4. RISTOCETINA. Es un antibiótico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual que la vancomicina inhibe la transglucosidación, siendo activo frente a Gram- positivas. 6.1.5. BACITRACINA-A. Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ahí su nombre), es un antibiótico polipeptídico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos Gram-positivos así como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado tóxico (sobre todo nefrotóxico) como para ser administrado sistémicamente, pero tiene uso tópico (p. ej., en cirugía del colon). Su mecanismo de acción estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-P- P, e impide su regeneración hasta undecaprenil-P por la fosfatasa específica; por lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosintético del PG. 6.1.6. ANTIBIOTICOS -LACTAMICOS. Todos los antibióticos de este grupo contienen un anillo característico: el anillo - lactámico. Todos los subgrupos de -lactámicos se pueden considerar derivados de un núcleo químico en el que, además del anillo lactámico puede existir un heterociclo conjugado:
- 142. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 142 Núcleo Ejemplos Penám Penicilinas Cefén Cefalosporinas Carbapenem Tienamicina Oxacefén Moxalactam Clavám Clavulánico Monobactam aztreonám PENICILINAS Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibióticos naturales en descubrirse, pero en general, todos los ß-lactámicos tienen el mismo mecanismo de acción. Nos concentraremos en estudiar las penicilinas. El grupo común a todas las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que en realidad es un dipéptido ciclado por condensación de L-cys y D-val, que genera el anillo ß-lactámico (anillo A) y el anillo tiazolidínico (anillo B). Las penicilinas se pueden considerar derivadas del 6-APA, sustituyendo el hidroxilo (- OH) del grupo carboxilo por un radical acilo (R). Este radical acilo es variable de unas penicilinas a otras. La variación se puede lograr de dos maneras principales: modificando el medio de cultivo donde se hace crecer la cepa del hongo Penicillium. por transformaciones químicas "in vitro", lo que genera las llamadas penicilinas semisintéticas. La penicilina natural, purificada por primera vez en los años 40, es la penicilina-G (o benzil-penicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (fenilacético). Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes: tiene un espectro estrecho: actúa frente a estreptococos del grupo A y otros cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayoría de bacterias Gram- negativas. Es sensible a ácidos, por lo que no puede ser administrada vía oral (se inactiva a su paso por el estómago). Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas bacterias. Se elimina rápidamente por la orina (no permanece mucho tiempo en el organismo receptor). En algunos individuos puede provocar respuestas de hipersensibilidad (alergia a la penicilina). Para solventar estos problemas se fueron "creando" variantes de esta penicilina que mejoraban algunas de sus cualidades. Por ejemplo, manipulando el medio de cultivo del hongo se pudo lograr la llamada penicilina-V (fenoximetil-penicilina), que es más resistente a bajos pH. Sin embargo, las más recientes generaciones de penicilinas son semisintéticas. Para obtenerlas se partir del núcleo del 6-APA.
- 143. Ramirez - Balqui 143 El 6-APA se puede obtener de dos modos distintos: cultivando el hongo en medio carente de ácidos grasos (lo que evita la adición de radical acilo); o bien partiendo de penicilina G, y digiriéndola con amidasas específicas que producen el 6-APA. Una vez obtenido el 6-APA, éste se hace reaccionar químicamente con un compuesto carboxílico. Dependiendo del compuesto en cuestión, se obtiene una amplia variedad de penicilinas semisintéticas, con propiedades mejoradas: con más amplio espectro de acción; con más tiempo de permanencia en suero y fluidos corporales; con resistencia a penicilinasas y en general -lactamasas; resistentes pH ácido, y por lo tanto susceptibles de ser administradas vía oral. Estas penicilinas semisintéticas se pueden englobar en tres grupos principales: 1). resistentes a penicilinasas.Se usan sobre todo frente a cocos Gram- positivos (Staphylococcus aureus, S. epidermidis). 2). De espectro ampliado. Permiten un uso efectivo frente a muchas bacterias Gram-negativas (Haemophilus influenzae, E. coli, Proteus, Salmonella, Shigella, etc.). Dentro de este grupo, destacamos las "aminopenicilinas", como la ampicilina, o la amoxicilina: el grupo -NH2 del radical acilo permite que estas penicilinas puedan atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Resisten los ácidos, pero desgraciadamente sólo tienen la mitad de actividad contra Gram-positivas, y algunas son inactivadas por -lactamasas. 3). Penicilinas anti-Pseudomonas. La carbenicilina y la piperacilina se usan frente a Pseudomonas, un patógeno oportunista muy peligroso cuando coloniza grandes quemaduras, heridas quirúrgicas, etc. Mecanismo de acción de las penicilinas y otros antibióticos -lactámicos: Todas las penicilinas (incluidas las semisintéticas), son bactericidas sobre bacterias en crecimiento, y poseen el mismo mecanismo: Inhiben el sistema enzimático implicado en la reacción de transpeptidación del peptidoglucano naciente, o sea que impiden los entrecruzamientos entre cadenas de PG. Ello origina: acumulación de precursores del PG, sin ensamblar; activación de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan el PG maduro de la bacteria; si la bacteria se encuentra en un medio hipotónico, termina lisándose. En Gram-positivas, además, se produce desorganización de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos. (De hecho, parece que en este tipo de bacterias son estos ácidos los que regulan de algún modo a las autolisinas).
- 144. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 144 Por lo tanto, la acción bactericida y lítica de las penicilinas depende de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio hipotónico. Cuando la bacteria no está creciendo, no está haciendo renovación ("turnover") de su pared celular, lo que implica que la penicilina no tiene "diana" sobre la que actuar; por lo tanto, en estas condiciones la bacteria puede sobrevivir. Esta es la base de las "recaídas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado por terminado el tratamiento de un paciente con un antibiótico ß-lactámico. Una visión más en profundidad del mecanismo de acción: Las penicilinas tienen como dianas a una serie de autolisinas llamadas proteínas de unión a la penicilina (PBPs). Como ya vimos en el apartado 5 del capítulo 6, las PBPs son proteínas implicadas en las últimas fases de la síntesis y maduración del PG. Veamos en la siguiente tabla las funciones de las PBPs de E. coli, y los efectos sobre cada una al añadir penicilina. PBPs con actividad transglucosidasa y transpeptidasa: función natural acción penicilina PBP 1a y PBP 1b Elongación del cilindro celular lisis rápida PBP 2 Condiciona la forma de la célula la célula se redondea y muere PBP 3 Formación del septo transversal Filamentación y muerte PBPs con actividad D-D carboxipeptidasa (endopeptidasa) Función natural acción penicilina PBP 4, PBP 5, PBP 6 Eliminan la D-ala terminal delpentapéptido (maduración PG) no letal Así pues, las PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las penicilinas que explican la actividad bactericida. Se ha propuesto que el grupo -CO- N- del anillo ß-lactámico funciona como un análogo estructural del sustrato de las transpeptidasas implicadas en la reacción de entrecruzamiento (transpeptidación) entre el péptido del PG naciente y el del PG aceptor. La penicilina se combina con el sitio activo de la transpeptidasa, dando un complejo enzima-penicilina (peniciloil- transpeptidasa) inactivo y bastante estable. -LACTÁMICOS BASADOS EN EL NÚCLEO DEL ÁCIDO 7- AMINOCEFALOSPORÁNICO El núcleo cefém es el ácido 7-aminocefalosporánico. Existen dos tipos de - lactámicos naturales (y sus derivados semisintéticos) basados en este núcleo: cefalosporinas, producidas por hongos del género Cephalosporium;
- 145. Ramirez - Balqui 145 cefamicinas, producidas por ciertas especies del actinomiceto Streptomyces. Desde un punto de vista biosintético, derivan de los dos mismos aminoácidos que las penicilinas, pero aquí, uno de los metilos (-CH3) de la valina se incorpora al anillo en vez de quedar fuera, haciendo que el anillo B sea el anillo dihidrotiazina. La cefalosporina natural tiene poca actividad, pero sustituyendo artificialmente R1 y R2 se obtienen derivados semisintéticos muy activo. Como es habitual con muchos antibióticos de uso clínico, a lo largo de los años la industria farmacéutica ha ido "creando" sucesivas "generaciones" de estos compuestos, con aplicaciones y ventajas diferentes: Las cefalosporinas se introdujeron en principio para uso en pacientes alérgicos a las penicilinas. Algunas de ellas combinan la ventaja de tener un amplio espectro (incluyendo bacterias difíciles de tratar, como Haemophilus) y el de ser resistentes a las -lactamasas de muchas bacterias Gram-negativas. MONOBACTÁMICOS Tienen un núcleo monocíclico (sólo el anilo -lactámico). El derivado semisintético aztreonam se puede usar contra bacterias Gram-negativas aerobias (estrictas o facultativas) como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Enterobacterias. Su espectro de acción estrecho es útil, ya que su administración vía oral "respeta" mejor la flora intestinal autóctona del paciente. CARBEPÉNICOS Se basan en el núcleo del carbapeném. Ejemplos son las tienamicinas (como el imipeném). Poseen un espectro muy amplio, con actividad intensa contra casi todas las bacterias de interés médico, incluyendo resistentes a otros antibióticos ß- lactámicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacteroides, Haemophilus, Neisseria, etc. INHIBIDORES DE LA -LACTAMASA Un ejemplo típico es el ácido clavulánico (una oxa--lactama): tiene poca actividad como antibiótico, pero se une a las -lactamasas, inactivándolas irreversiblemente. Actualmente los médicos lo recetan con frecuencia en combinación con alguna ampicilina (una aminopenicilina, como vimos): la mezcla ampicilina + clavulánico tiene efectos sinérgicos (se potencian el uno al otro). El clavulánico pasa fácilmente a través de porinas al espacio periplásmico de muchas bacterias Gram-negativas, donde se acumula, y allí inactiva a las -lactamasas; mientras tanto, la ampicilina, "salvada" de la inactivación de las lactamasas, puede ejercer su efecto bactericida (por bloqueo de la transpeptidación del PG). 6.2. ANTIBIOTICOS QUE ACTUAN SOBRE LA MEMBRANA CELULAR. A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo
- 146. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 146 esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica. 6.2.1. ANTIBIOTICOS POLIPEPTIDICOS. Son antibióticos producidos por especies de Bacillus durante las primeras fases de la esporulación. Se trata de moléculas con aminoácidos en configuraciones L y D, y con presencia de ciertos aminoácidos "raros" (no proteinogenéticos). Algunos de estos antibióticos son polipéptidos cíclicos. Su síntesis no se realiza en los ribosomas, sino que se produce por una secuencia de reacciones enzimáticas que nada tienen que ver con el proceso de traducción de los mensajeros genéticos. Suelen ser antibióticos de efecto bactericida. Su mecanismo consiste en que se unen a la cara externa de la membrana citoplásmica (y, además, a la membrana externa de las bacterias Gram-negativas), alterando su estructura y su permeabilidad osmótica; ello condiciona la inhibición de procesos básicos de la membrana, así como la salida de metabolitos del citoplasma. POLIMIXINAS Producidas por Bacillus polymyxa, son decapéptidos cíclicos con aminoácidos en L y D, y con abundancia del "raro" L-diaminobutírico (L-DAB), y que llevan unido una cadena alifática C8 (el 6-metil-octanoico). Su actividad está restringida a Gram-negativas: el anillo peptídico, que está cargado positivamente, se une electrostáticamente con los grupos negativos de la membrana externa, desplazando a los cationes Mg++ y otros que estabilizan dicha membrana; al mismo tiempo, la "cola" hidrofóbica (la cadena alifática) del antibiótico se introduce entre las cadenas de ácidos grasos de la membrana. El efecto neto de todo ello es que se desorganiza la estructura y la función de la membrana externa. Presentan toxicidad para organismos superiores (sobre todo nefrotoxicidad), por lo que su empleo parenteral se reserva para infecciones severas de Pseudomonas. Pero es apto para uso tópico. TIROCIDINA-A Y GRAMICIDINA-S Producidas por Bacillus brevis, son antibióticos plenamente cíclicos, con efectos similares a la polimixina. 6.2.2. IONOFOROS. Los antibióticos ionóforos actúan aumentando grandemente la permeabilidad de la membrana hacia iones inorgánicos específicos. Forman canales que atraviesan la membrana, dejando un hueco central que permite el paso de cationes concretos, lo que se traduce en una disipación de los gradientes electroquímicos a ambos lados de la membrana (destruyendo, por tanto, la capacidad de obtención de energía de las bacterias).
- 147. Ramirez - Balqui 147 VALINOMICINA Es un depsipéptido cíclico, formado por la ciclación de tres unidades del siguiente módulo: D-hidroxibutírico-D-valina-Lactato-L-valina Como se puede comprobar, se trata de una cadena de -aminoácidos y - hidroxiácidos alternantes, conectados por enlaces peptídicos y enlaces éster. Las cadenas alifáticas se disponen hacia afuera del anillo, mientras que los grupos carboxilo se colocan hacia adentro, dejando un canal hidrófilo que permite el libre paso de K+, lo que desacopla los mecanismos de obtención de energía a nivel de membrana. GRAMICIDINA A Es un antibiótico a base de aminoácidos alternantes en configuraciones D y L, que forma una estructura helicoidal. Disipa iones K+, así como Na+ e H+. La configuración permite al antibiótico formar una especie de cilindro donde la cadena sigue una hélice que está estabilizada por puentes de H casi paralelos al eje del cilindro, dejando un canal central de 0.4 nm de diámetro, y con las cadenas laterales de los aminoácidos dirigidas hacia auera, formando una especie de vaina hidrófoba. Esto permite que la molécula se inserte a través de la membrana, dejando un canal por el que pueden pasar iones, con la consiguiente destrucción del gradiente electroquímico. 6.2.3. ANTIBIOTICOS POLIÉNICOS. Son de tipo macrólido (o sea, un gran anillo provisto un enlace lactónico); este tipo de antibióticos se caracteriza por poseer una porción flexible hidroxilada y otra porción más rígida, a base de dobles enlaces conjugados. La anfotericina B (producida por Streptomyces nodosus) y la nistatina (por S. nursei) contienen, además, el aminoazúcar llamado micosamina. Inhiben selectivamente las membranas que contienen esteroles: por lo tanto, actúan sobre microorganismos eucarióticos (hongos, levaduras), pero no sobre los procarióticos, a excepción de los micoplasmas. Parece que son bastante específicos hacia el ergosterol (muy abundante en hongos), pero debido al parecido de éste con el colesterol, tienen cierta toxicidad hacia los animales superiores (su margen de seguridad terapéutica es muy estrecho). Estos antibióticos tienen forma de bastón rígido (debido a la configuración todo - trans de los dobles enlaces conjugados). Una de las superficies de este cilindro es hidrófoba (la de los dobles enlaces), y la superficie opuesta es hidrófila (la que es rica en hidroxilos). En un extremo del bastón, la micosamina y el carboxilo forman una zona altamente polar. Los modelos fisicoquímicos revelan que 10 moléculas del antibiótico se agregan entre sí, con los ejes de sus respectivos bastones paralelos entre sí y perpendiculares a la membrana (atravesándola), de modo que
- 148. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 148 dejan un canal central de uno 0,7 nm de diámetro, y con los grupos polares hacia afuera. Esta estructura permite el paso libre de iones, así como el que se escapen metabolitos (como la glucosa) desde la célula al exterior. 6.3. ANTIBIOTICOS QUE INTERFIEREN EN LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS. Se recomienda al alumno repasar, siquiera sea en esquema, el proceso de síntesis de proteínas, con sus fases de iniciación, elongación y terminación). Los antibióticos que interfieren en la síntesis de proteínas son muy variados y abundantes, y la mayoría de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Nosotros vamos a detenernos principalmente en aquellos antibióticos que afectan a la elongación de la cadena naciente del polipéptido. Obviamente, los más útiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procarióticos, pero no sobre los 80S eucarióticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de la elongación de la cadena polipeptídica, podemos agruparlos según la fase concreta de la elongación sobre la que actúan: 1. inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del ribosoma; 2. introducción de errores en la lectura de los ARNm; 3. inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico; 4. inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P. 5. bloqueo de los factores de elongación. 6.3.1. INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA ELONGACION (O SEA, DEL RECONOCIMIENTO Y ENTRADA DEL aa-ARNt AL SITIO "A" DEL RIBOSOMA). TETRACICLINAS Son antibióticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram- negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies de Streptomyces. Actúan como bacteriostáticos, siempre y cuando las bacterias estén en crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son útiles incluso contra bacterias que viven como parásitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carácter hidrofóbico facilita su difusión a través de membranas. Mecanismo de acción: Provocan que la unión del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y esté distorsionada, con lo cual se evita la elongación de la cadena. In vitro actúan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, ¿por qué in vivo sólo inhiben a las bacterias? La explicación está en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma "suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad 30S, se une a las proteínas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el efecto que hemos descrito en el párrafo anterior. Efectos secundarios:
- 149. Ramirez - Balqui 149 Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la flora autóctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintéticas evitan este problema. Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daños a huesos y dientes, y tiñendo los dientes de amarillo en los niños. 6.3.2. INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA DEL ARNm. AMINOGLUCÓSIDOS. Es un grupo amplio y variado de antibióticos producidos por diversas especies de Streptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en común varios rasgos químicos: son muy polares, policatiónicos; presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con grupo amino); uno o más azúcares, incluyendo al menos un aminoazúcar (aparte del aminociclitol). Así, por ejemplo, la estreptomicina contiene como aminociclitol la llamada estreptidina, mientras que otros aminoglucósidos presentan la 2- desoxiestreptamina). Ejemplos de aminoglucósidos de uso clínico bacteria productora Estreptomicina Streptomyces griseus Kanamicina S. kanamyceticus Amikacinas (derivados semisintéticos de la kanamicina) Neomicina S. fradiae Gentamicina Micromonospora purpurea Los aminoglucósidos son antibióticos bactericidas de amplio espectro. Sus propiedades farmacocinéticas se deben al carácter polar del policatión: mala absorción vía oral (hay que administrarlos vía parenteral); penetran poco en el fluido cerebroespinal; se excretan rápidamente por la orina. Por otro lado, en algunos individuos pueden ocasionar reacciones adversas: parálisis neuromuscular, ototoxicidad (pueden llegar a provocar sorderas) y nefrotoxicidad. Su margen de dosis terapéutica es estrecho, por lo que su uso debe limitarse frente a infecciones ocasionadas por bacterias resistentes a otros antibióticos. Mecanismo de acción: Como veremos enseguida, su mecanismo no se limita a lo que dice el presente epígrafe (inducir errores en la lectura del mensajero), sino que tienen efectos pleiotrópicos (múltiples), que se influyen entre sí. El mecanismo lo podemos desglosar en varias fases: 1. Unas pocas moléculas del antibiótico entran a la bacteria, probablemente aprovechando pequeñas imperfecciones de la membrana en crecimiento;
- 150. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 150 2. estas moléculas se unen a los polisomas, es decir, los polirribosomas que están traduciendo el ARNm (p. ej., la estreptomicina se une al ARNr 16S de la subunidad 30S). Allí provocan errores en la lectura del ARNm, al distorsionar la estructura del ribosoma. Concretamente, el efecto aquí es que los codones del ARNm se emparejan con ARNt cargados "erróneos", en los que sólo 2 de las 3 bases del anticodón corresponden correctamente con las del codón. 3. Por lo tanto, la bacteria comienza a sintetizar proteínas defectuosas; algunas de ellas son proteínas de membrana, que al incorporarse a la bicapa lipídica, introducen imperfecciones en su funcionamiento y estructura. Se van formando cada vez más "canales", correspondientes a defectos en esa membrana; 4. a través de los nuevos "canales" e imperfecciones de la membrana, entran cada vez más moléculas del antibiótico, con lo cual todo el proceso se acelera y retroalimenta positivamente, de modo autocatalítico. El efecto final es bactericida: se detiene finalmente la síntesis de proteínas; se producen daños irreversibles a las membranas. Cada aminoglucósido se une a una zona distinta de la subunidad 30S del ribosoma, por lo que no suelen darse reacciones cruzadas de resistencia entre distintos antibióticos de este grupo. La mayoría de los aminoglucósidos se une a varios sitios a la vez, dentro de la subunidad 30S, por lo que la aparición espontánea de mutaciones de resistencia a ellos suele ser baja. Una excepción a esto es el caso de la estreptomicina. Efectos de la estreptomicina: Diana de la estreptomicina: La estreptomicina ejerce su efecto antibiótico uniéndose a una zona concreta del ARNr 16S del ribosoma eubacteriano. Mutación de resistencia a la estreptomicina: Con relativa frecuencia (10-- 9/célula y división) surge en la población bacteriana una mutación espontánea que convierte a la bacteria afectada en resistente a la estreptomicina (fenotipo StrR); esta mutación afecta al gen strA, que codifica la proteína S12 de la subunidad pequeña del ribosoma. El efecto de la mutación es alterar la proteína S12 de modo que el ribosoma que contenga esa proteína mutante evita la unión de la estreptomicina con el ARNr 16S (de algún modo, la S12 mutante "tapa" la vía de acceso del antibiótico a su diana molecular). Supresión fenotípica de mutaciones puntuales: Como veremos en la sección de Genética Bacteriana (cap.23), uno de los tipos de mutaciones se denomina puntual, porque transforma un par de bases en otro distinto; ello puede suponer alterar el sentido del codón afectado (el codón mutante puede codificar un aminoácido distinto al original, o incluso puede ser uno de los tres codones de parada de traducción), lo cual puede conducir a que la proteína mutante respectiva deje de ser funcional.
- 151. Ramirez - Balqui 151 Pues bien, cuando una bacteria que posee una mutación puntual que inactiva una determinada proteína (fenotipo mutante) se pone en un medio con estreptomicina u otro antibiótico aminoglucósido, con cierta frecuencia la lectura errónea del ARNm del gen mutante ("erróneo") conduce a que la proteína sea funcional, generándose un fenotipo silvestre. A este fenómeno se le denomina supresión fenotípica (en este caso inducida por estos antibióticos), para distinguirlo de la supresión genotípica, que como veremos oportunamente, regenera el fenotipo pero por medio de cambios en el genomio. Este efecto depende de la porción del anillo aminociclitol de la molécula del aminoglucósido, y su mecanismo es a nivel del sistema secundario de corrección de errores de lectura que tiene el ribosoma ("corrección de pruebas"). Mutantes dependendientes de la estreptomicina: Existe una mutación alélica de la StrR (es decir, que afecta al mismo gen), pero que en vez de dar fenotipo de resistencia al antibiótico produce un fenotipo por el que la bacteria depende de la estreptomicina para poder crecer (!). Esta mutación (denotada Strd) tiene unos efectos muy específicos de supresión fenotípica condicionada: la proteína ribosómica mutante S12, en ausencia de estreptomicina, hace que el ribosoma traduzca introduciendo frecuentes errores (hay ambigüedades en la lectura de los mensajeros); por lo tanto, en ausencia de este antibiótico, la bacteria no crece. Si a la bacteria se le suministra el antibiótico, éste compensa fenotípicamente el efecto de la mutación de la proteína S12, de modo que ahora los ribosomas pueden efectuar correctamente la traducción de los ARNm (se reactivan los ribosomas para su funcionalidad normal). 6.3.3. ANTIBIOTICOS INHIBIDORES DE LA FORMACION DEL ENLACE PEPTIDICO. Se trata de un grupo variado y heterogéneo de agentes antibacterianos que interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma. Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina) Antiguamente la industria lo obtenía a partir de Streptomyces venezuelae, pero actualmente es más barato fabricarlo por síntesis química. Es un bacteriostático de amplio espectro. Se absorbe bien vía oral y penetra bien en todos los tejidos, incluyendo cerebro y líquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, así como tratamiento de fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos. Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresión de médula ósea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en países de Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo. Mecanismo de acción: Se une a varios lugares de la subunidad 50S, entre los cuales el más importante es la proteína L16, que forma parte del centro peptidil-
- 152. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 152 transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A. El cloranfenicol ha sido muy útil en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los polisomas rápidamente. Lincomicina y clindamicina. La lincomicina está producida por Streptomyces lincolniensis, y la clindamicina es un derivado clorado del anterior, mucho más eficaz y con mejor absorción intestinal. Son útiles para tratar infecciones donde no pueda aplicarse penicilina, y contra anaerobios como Bacteroides. Mecanismo de acción: Se une a la subunidad 50S del ribosoma procariótico, bloqueando la formación del enlace peptídico. Parece que esto lo logra interfiriendo con la colocación adecuada del aa-ARNt en el sitio A, y del pp-ARNt en el sitio P. Hace que se desorganicen los polisomas, disociándose en sus subunidades 30S y 50S. Algunos macrólidos como la carbomicina La carbomicina (producida por Streptomyces halstedii) y otros macrólidos se unen a la proteína L4 de la subunidad 50S, inhibiendo la formación del enlace peptídico. 6.3.4. INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACION. El representante más típico es otro macrólido, la eritromicina. (Actualmente se usan mucho en clínica dos derivados semisintéticos de ella: la roxitromicina y la claritromicina). Producida por Streptomyces erithraeus), es un agente bacteriostático que se administra en infecciones de vías respiratorias ocasionadas por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila (legionelosis), Corynebacterium dyphteriae (difteria) y Bordetella pertussis (tosferina). Mecanismo de acción: Se une a la proteína L15, que forma parte del centro peptidil-transferasa. Bloquea el paso de translocación interfiriendo específicamente con la liberación del ARNt desacilado, es decir, impide que el ARNt "descargado" (una vez que ha cumplido su misión al transferirse el péptido naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo tanto, el pp-ARNt cargado y situado en el sitio A no puede translocarse al sitio P, y se produce la parada de la síntesis de proteinas. 6.3.5. INHIBIDORES DE LOS FACTORES DE ELONGACION. Tiostreptón Es un antibiótico policíclico muy grande, producido por ciertas especies de Streptomyces. Se une a la subunidad 50S, concretamente a la proteína L11 y a una zona concreta del ARNr 23S, impidiendo la unión de los factores de elongación EFTu y EFG.
- 153. Ramirez - Balqui 153 Ácido fusídico Es un derivado esteroideo producido por hongos del género Fusarium, usado contra estafilococos resistentes a -lactámicos. Se une al factor de elongación EFG, inhibiendo la liberación del complejo EFG-GDP, por lo que el pp-ARNt queda fijado en el sitio P, lo cual impide que se pueda unir el complejo ternario EFTu- GTP-ARNt. Kirromicina y pulvomicina Se unen al factor EFTu. La kirromicina bloquea la liberación del complejo binario EFTu-GDP; la pulvomicina bloquea la adición de aa-ARNt al EFTu para formar el complejo ternario. En resumen de este apartado, existen antibióticos que afectan prácticamente cualquier aspecto de la función del ribosoma. Muchos de ellos, aparte del interés clínico que puedan tener, han sido muy útiles para desentrañar diversos aspectos de la estructura y función del ribosoma. 6.4. ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS. 6.4.1. INHIBIDORES DE LA FUNCION DEL ADN. Pocos de los antibióticos que interfieren con las funciones del ADN son útiles en clínica, ya que no pueden discriminar entre ADN de procariotas y eucariotas. Sin embargo, han sido muy valiosos para estudiar diversos aspectos de la biología molecular del ADN Actinomicina-D (Dactinomicina) Observar en la figura que su grupo cromóforo tiene tres anillos y es planar; de cada anillo de los extremos sale una lactona pentapeptídica. Esta estructura es importante para entender su mecanismo de acción: El hecho de tener tres anillos conjugados en un plano le permite intercalarse entre pares de bases adyacentes de la doble hélice del ADN, mientras que las dos L-treoninas establecen puentes de H con guaninas del ADN adyacentes al sitio de intercalación del antibiótico. De esta forma inhibe la replicación del ADN y su transcripción a ARNm. Mitomicina C Al entrar a la célula es convertida a su forma hidroquinona, que es muy reactiva, funcionando como un agente alquilante bifuncional que origina entrecruzamientos entre las dos hebras del ADN. Las consecuencias de ello son: las dos hebras no pueden separarse durante el intento de replicación, por lo que ésta se detiene. A continuación el ADN entrecruzado es atacado y destruido por las nucleasas de la propia célula.
- 154. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 154 Novobiocina y coumermicina Se unen a la subunidad B de las ADN girasas bacterianas, impidiendo el superenrollamiento negativo del ADN al competir por el sitio de unión de esta subunidad al ATP. 6.4.2. INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION. Las ARN polimerasas de virus, de bacterias y de mamíferos difieren mucho entre sí, por lo que los tipo de antibióticos que las afecten suelen ser bastante selectivos. Recuérdese que las ARN polimerasas eubacterianas constan de un núcleo {a2'} y que requieren el factor para la iniciación de la transcripción. Rifampicinas Son antibióticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Se han usado en clínica moléculas naturales (como la rifampicina) así como derivados semisintéticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromóforo aromático atravesado por un largo puente de naturaleza alifática. Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción, uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la ARN polimerasa eubacteriana. Estreptolidigina Se une también a la subunidad ß de la ARN polimerasa, pero su efecto es inhibir la fase de elongación de la transcripción. VII. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIOTICOS La síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han supuesto en este siglo una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, la extrema versatilidad y adaptabilidad de los microorganismos ha impedido que la victoria humana sobre las bacterias patógenas haya sido total: muchas bacterias han ido desarrollando en los últimos decenios mecanismos que las protegen frente a muchos fármacos. Ya el mismo Paul Ehrlich, al introducir por primera vez la quimioterapia en protozoos, se dio cuenta (1907) de que algunas cepas desarrollaban resistencia a la droga durante el curso del tratamiento. Tras el optimismo inicial que acompañó a los éxitos de la introducción de las sulfamidas y penicilinas (años 40 y 50), se constató igualmente un fenómeno de surgimiento de resistencias bacterianas a estas drogas. Si bien la quimioterapia ha doblegado las grandes epidemias bacterianas del pasado, las enfermedades infecciosas siguen con nosotros, constituyendo un serio problema. De hecho, desde la introducción de la antibioterapia en todo el mundo, estamos realizando un gigantesco "experimento" de intervención genética en los seres vivos más abundantes del
- 155. Ramirez - Balqui 155 planeta: las bacterias. Estamos "sufriendo" la verdad de la supervivencia darwiniana de los más aptos, ya que la presión selectiva que representa la aplicación a gran escala de los quimioterápicos ha permitido la diseminación de cepas microbianas con mecanismos de resistencia que, en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico. Al cabo de 6 años de introducir la penicilina G, la frecuencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes en los hospitales ingleses pasó de menos del 10% a un 60%. Actualmente el valor ronda el 90%. Con los nuevos ß-lactámicos también han empezado a surgir cepas bacterianas resistentes, aunque aún con frecuencia relativamente baja. Actualmente existen problemas de tratamiento con las enterobacterias, e incluso con el gonococo y el meningococo, que tradicionalmente habían sido muy sensibles a las penicilinas. Recientemente se ha dado la voz de alarma por la diseminación de cepas de bacilo tuberculoso resistentes a los quimioterápicos de elección a los que eran sensibles. La capacidad de las bacterias de desarrollar resistencias constituye una seria amenaza al futuro uso de los antibióticos, y hace que se tengan que invertir grandes sumas de dinero y esfuerzos de investigación adicionales para intentar hacer frente al problema. Algunos autores han comparado este problema con el episodio de Alicia en el País de las Maravillas en el que la Reina Roja tenía que correr cada vez más deprisa para quedarse en el mismo sitio. Sin embargo, algunos quimioterápicos de última generación han vuelto a levantar esperanzas: las fluoroquinolonas están manteniendo e incluso incrementando su efectividad. Por otro lado, hay que pensar en un dato de tipo evolutivo: la mayor parte de las especies bacterianas han sido seleccionadas de modo natural con fenotipos sensibles a antibióticos; los cambios genéticos mutacionales que las convierten en resistentes puede que disminuyan su adaptación a otros factores ecológicos, de modo que probablemente la presión de los antibióticos en realidad conduzca en muchos casos a un equilibrio entre cepas sensibles y cepas resistentes. De hecho se ha comprobado un descenso en la frecuencia de cepas resistentes a los antibióticos que se introdujeron hace más tiempo, lo que quizá indique que para ellos se está alcanzando dicho equilibrio. Aclaraciones de nomenclatura: llamamos cepa insensible a aquella cuyo fenotipo silvestre le permite "resistir" de modo natural a un determinado antibiótico. La base de esta insensibilidad suele ser alguna estructura de la bacteria que actúa como barrera (como por ejemplo, la membrana externa de Gram-negativas, que dificulta el paso de muchos agentes antibacterianos). Llamamos cepa resistente a una variante surgida por cambios genéticos a partir de un fenotipo silvestre originalmente sensible. VIII. BASES GENÉTICAS DE LA RESISTENCIA Una de las aplicaciones prácticas más interesantes de los avances realizados en las últimas décadas en el campo de la Genética Bacteriana ha sido comprender los mecanismos genético- moleculares de la resistencia a antibióticos, lo que está permitiendo un "ataque" más racional a
- 156. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 156 este problema clínico. Una cepa bacteriana puede volverse resistente a un antibiótico por dos tipos principales de mecanismos: 1). mutación en un gen cromosómico; 2). introducción de un plásmido R de resistencia. Este segundo mecanismo supone el problema más serio, ya que: a. está muy extendido; b. puede conferir resistencia a varios antibióticos a la vez; c. a diferencia del mecanismo mutacional, no suele suponer una desventaja adaptativa (no disminuye la tasa de crecimiento de la bacteria ni le hace perder sus propiedades de virulencia). 8.1. SELECCION DE MUTANTES RESISTENTES. Las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del rango de 10--5 a 10--10 por célula y división. En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes. Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles, pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los más prevalentes. El conocimiento de la frecuencia de aparición de mutación a resistencia a un quimioterápico o antibiótico en una determinada especie bacteriana, así como el sitio de acción de dicho fármaco, son factores importantes para una aproximación racional a la quimioterapia. Así por ejemplo, el bacilo tuberculoso produce frecuentemente lesiones en el pulmón, donde se concentran enormes cantidades de la bacteria. Aquí, la quimioterapia con un solo agente no da éxito, ya que aunque ese agente mate a casi todos los individuos de esta especie bacteriana, no afectará a la pequeña subpoblación que posea el alelo resistente; estos pocos individuos sobrevivirían a este tratamiento, y recolonizarían el resto del pulmón, por lo que la infección persistiría. Así pues, en este tipo de casos hay que tratar con varios quimioterápicos simultáneamente (la probabilidad de resistencias múltiples basadas en mutaciones espontáneas equivale al producto de las probabilidades individuales). 8.2. RESISTENCIA POR INTERCAMBIO GENÉTICO. La principal amenaza al éxito de la quimioterapia está representada por la transmisión genética de plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R).
- 157. Ramirez - Balqui 157 Veamos un poco de historia: en los años 50, poco después de la introducción de los primeros antibióticos, se detectó en Japón un espectacular aumento de pacientes de disentería bacilar resistentes al tratamiento con varios de estos antibióticos. Las cepas de Shigella dysenteriae aisladas de estos pacientes poseían el fenotipo SuR, StrR, CmR, TetR. Se comprobó que los genes correspondientes a esas resistencias formaban parte de un gran plásmido. Los plásmidos de este tipo se denominan plásmidos R. Pero aún más: los mismos pacientes tenían en sus intestinos cepas de Escherichia coli (que como sabemos ya, es un simple comensal que forma parte de nuestra flora endógena) que eran igualmente resistentes a esos antibióticos. Ello sugería que este tipo de plásmidos se podía transferir de unas especies a otras. La explicación estribaba en un fenómeno de intercambio dependiente de contactos célula-célula, llamado conjugación. En resumidas cuentas, se descubrió que existen plásmidos R capaces de diseminarse por conjugación no sólo entre células de la misma especie, sino entre especies distintas, incluyendo bacterias patógenas. Al poco tiempo comenzaron a aparecer en Occidente cepas patógenas resistentes a uno o varios antibióticos. Actualmente las cepas con resistencias múltiples codificadas por plásmidos son muy abundantes en todo el mundo, lo que complica (y a veces desaconseja) la quimioterapia. Existen plásmidos R de distintos grupos de incompatibilidad. Son abundantes en Pseudomonas y en Enterobacterias, desde donde pueden ser transferidos a una amplia gama de bacterias Gram-negativas (plásmidos promiscuos). Aparte de los plásmidos R conjugativos existen otros no conjugativos, que sin embargo pueden ser transferidos entre distintas bacterias por otros medios: los plásmidos no conjugativos movilizables pueden ser transferidos por otro plásmido conjugativo compatible residente en la misma célula. por transducción (mediante bacteriófagos); por transformación (ADN desnudo del plásmido puede ser captado por una bacteria sensible receptora;). Ventajas adaptativas de los plásmidos R: Los plásmidos R han evolucionado en respuesta a presiones selectivas ambientales (antibióticos usados por los humanos o inhibidores presentes en los medios naturales de las bacterias). 1). Son capaces de conferir varias resistencias simultáneamente a las bacterias que los adquieran. 2). Tienen capacidad de diseminarse epidémicamente de modo "horizontal" (es decir, entre células distintas de la misma especie o -en el caso de los promiscuos- distintas especies). 3). Están constituidos por "módulos" móviles (transposones), de modo que tienen flexibilidad para adquirir nuevos módulos a partir de otras especies. 4). Economía: cuando no existe presión selectiva, pueden perderse de la mayor parte de las bacterias de una determinada población (curación espontánea), pero su modo de
- 158. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 158 transmisión "epidémica" los capacita para diseminarse rápidamente a la mayoría de la población cuando la ocasión lo requiere (cuando vuelve la presión selectiva). 5). No tienen apenas efectos negativos sobre los demás caracteres de la bacteria (incluyendo, en las patógenas, su poder virulento). 6). Muchos de ellos responden a mayores concentraciones del antibiótico aumentando su número de copias (amplificación del número de copias en los plásmidos de control relajado. Otro ejemplo de esta facultad de diseminación y evolución lo tenemos en que desde que los hospitales hacen uso frecuente de detergentes catiónicos como desinfectante, ha crecido la proporción de cepas de Staphylococcus resistentes a dichos agentes. Como se puede comprender, el estudio epidemiológico de los plásmidos R reviste actualmente un gran interés de cara a la salud pública. Este tipo de estudios recurre principalmente a dos tipos de enfoques: por detección de grupos de incompatibilidad (algo complejo); por análisis de restricción y comparación de mapas físicos (más fácil y rápido). IX. MECANISMOS BIOQUIMICOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS. Los principales mecanismos se pueden agrupar de la siguiente manera: 1. Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico. 2. Inactivación enzimática del antibiótico 3. Modificación química de la diana sobre la que actúa el antibiótico 4. Síntesis de una enzima resistente. 9.1. DISMINUCION DE LA PERMEABILIDAD CELULAR HACIA EL ANTIBIOTICO. Modificación de una barrera preexistente Como ya sabemos, la membrana externa de Gram-negativas supone una barrera natural que hace que muchas bacterias de este grupo sean insensibles a varios antibióticos (p. ej., la vancomicina y la bacitracina no pueden atravesar las porinas). No todas las bacterias Gram-negativas son igualmente impermeables a los mismos antibióticos: Entre las menos impermeables están Haemophilus y Neisseria, que dejan pasar a numerosos ß-lactámicos. Las Enterobacterias suelen ser intermedias. Las bacterias del gén. Pseudomonas son insensibles a la mayoría de antibióticos - lactámicos, porque no pueden pasar a través de la membrana externa. Se han aislado mutantes que se han vuelto resistentes a los -lactámicos de última generación: el cambio ha afectado a una determinada porina que ahora no deja pasar a estos nuevos antibióticos. En otros casos, la resistencia se debe a alteraciones en la cápsula: algunos neumococos resistentes a estreptomicina y eritromicina dependen de este tipo de mecanismo.
- 159. Ramirez - Balqui 159 Mecanismo de extrusión activa del antibiótico El ejemplo más típico estriba en la resistencia a las tetraciclinas desarrollada por muchas bacterias. Como sabemos, el efecto inhibidor de las tetraciclinas depende de la acumulación activa de este tipo de antibióticos por parte de las bacterias. Pues bien, ciertos plásmidos R poseen transposones (como el Tn10 o el Tn1721) que codifican un sistema para "bombear" tetraciclina desde el interior bacteriano hacia el exterior, en contra del gradiente de concentración. Igualmente se conocen resistencias a sulfamidas dependientes de un mecanismo específico de impermeabilidad. Alteración del mecanismo de transporte del antibiótico Cuando el antibiótico accede al interior bacteriano por algún mecanismo de transporte específico, una mutación que afecte a dicho sistema de transporte supondrá una mayor resistencia al antibiótico. Por ejemplo, en E. coli la cicloserina entra aprovechando el sistema de transporte de la valina o la glicocola. Determinados mutantes incapaces de transportar estos aminoácidos son resistentes a la cicloserina. 9.2. INACTIVACION ENZIMATICA DEL ANTIBIOTICO. Este tipo de mecanismo depende en muchos casos de plásmidos R. Los ejemplos típicos son las resistencias a -lactámicos, la resistencia al cloranfenicol y las resistencias a aminoglucósidos. Resistencia a -lactámicos por acción de -lactamasas Como ya sabemos, ciertas bacterias producen penicilinasa (-lactamasa), capaz de abrir el anillo -lactámico de la penicilina para dar ácido peniciloico, que carece de actividad antibacteriana. Lo mismo ocurre con las cefalosporinas, donde la -lactamasa (cefalosporinasa) genera un producto inestable inactivo que se descompone rápidamente. Sin embargo, la naturaleza de la cadena lateral (grupo acilo, R) influye notablemente en la susceptibilidad de rotura del anillo -lactámico por las lactamasas. -lactamasas codificadas por cromosoma y de bajo nivel (-lactamasas de tipo TEM). Están muy distribuidas entre bacterias Gram-negativas, y confieren resistencia a cefalosporinas y penicilinas. La base de la resistencia en muchos casos es la siguiente: cuando se expone la bacteria al -lactámico durante mucho tiempo, pueden seleccionarse determinadas mutaciones en genes cromosómicos que codifican proteínas parecidas de tipo PBP, de modo que adquieren un fuerte promotor que permite su expresión a alto nivel. Este tipo de -lactamasa es excretada al medio, donde inactiva al antibiótico. -lactamasas de origen plasmídico. En la Gram-positiva Staphylococcus aureus existen cuatro variantes, responsables del espectacular aumento de cepas resistentes de esta especie surgidas en los años 50. Se trata de enzimas inducibles: el gen que codifica la -lactamasa se induce por pequeñas cantidades de penicilina o cefalosporina, y se producen enormes cantidades del
- 160. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 160 antibiótico, que se excreta, de modo que inactiva al ß-lactámico en el entorno de la bacteria. El gen responsable es portado por plásmidos de tipo R (que llevan genes de resistencia para otros antibióticos). En las Gram-negativas se han descubierto unos 20 tipos de -lactamasas de codificación plasmídica. Suelen ser enzimas de síntesis constitutiva que se expresan a bajos niveles, y cuya localización es periplásmica; esta localización permite que el antibiótico sea inactivado antes de que llegue a la membrana citoplásmica, donde se localizan las proteínas diana de los -lactámicos. Algunas de ellas vienen codificadas por genes plasmídicos que forman parte de transposones (p. ej., el Tn1 o el Tn4). ¿Cuál es el origen de las -lactamasas? Aunque la prevalencia de cepas (sobre todo patógenas) resistentes a -lactámicos es un fenómeno que se "disparó" desde los años 50 con el uso masivo de estos antibióticos, está claro que la resistencia debía de existir previamente al uso humano de los antibióticos. La aplicación clínica a gran escala (incluyendo el abuso) de las penicilinas y cefalosporinas sólo ha permitido que veamos en acción un caso "acelarado" de evolución bacteriana, donde las cepas más aptas han sobrevivido y se han multiplicado, y en el que, merced a los procesos de intercambio genético y a la construcción "modular" (transposones) de muchos plásmidos R, las entidadess genéticas responsbles se han diseminado de unas especies bacterianas a otras. Se supone que en la Naturaleza (p. ej., en los suelos), ciertas cepas bacterianas, antes de la aparición de la Quimioterapia, poseían ya mecanismos para destruir los -lactámicos segregados por hongos con los que coexistían. Profundizando más en el tema, parece que las propias -lactamasas proceden evolutivamente (por mutaciones sucesivas) de alguno de los genes que originalmente codificaban algunas de las "autolisinas" (PBPs) que intervienen en la maduración del peptidoglucano. Es decir, las -lactamasas serían formas modificadas de las mismas dianas (p. ej., las transpeptidasas) sobre las que actúan los -lactámicos. Como sabemos, los -lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien, existen indicios de que las -lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en vez de formar complejos estables con los -lactámicos, se habrían especializado en cortar el anillo lactámico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa original. Resistencia al cloranfenicol La resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho antibiótico, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), que normalmente está codificada por genes plasmídicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas más estudiados forma parte del transposón Tn9. La CAT convierte el cloranfenicol en su derivado 3-acetoxi, usando el acetil-CoA; a continuación una reacción química (no catalizada por enzima) hace que el grupo acetoxi
- 161. Ramirez - Balqui 161 pase a la posición 1; finalmente ocurre una segunda acetilación catalizada enzimáticamente, que genera el producto final, 1,3-diacetoxi-cloranfenicol. Los derivados mono o diacetilados del cloranfenicol son inactivos como antibióticos. Resistencia a ciertos aminoglucósidos Como ya vimos en el capítulo anterior, los aminoglucósidos son un grupo amplio y abundante de antibióticos, por lo que no es sorprendente que las bacterias hayan evolucionado distintos mecanismos para inactivarlos; se pueden agrupar en tres tipos: Fosforilación Adenilación Acetilación Las fosforilaciones y adenilaciones se dan sobre grupos -OH susceptibles, mientras que las acetilaciones recaen sobre determinados grupos -NH2. La modificación enzimática de los aminoglucósidos ocurre en el espacio periplásmico o en la membrana citoplásmica, y produce un doble efecto: el antibiótico modificado covalentemente ya no puede usar el mecanismo de transporte facilitado a través de la membrana; por lo tanto, accede en menor cantidad al citoplasma; el compuesto modificado ya no puede afectar al ribosoma, por lo que no ejecuta acción inhibitoria sobre el crecimiento de la bacteria. 9.3. MODIFICACION QUIMICA DE LA DIANA DEL ANTIBIOTICO. Resistencia a la estreptomicina Este mecanismo ya fue comentado en la mutación cromosómica strA produce una proteína ribosómica S12 alterada que impide la unión de la estreptomicina. Resistencia a la eritromicina Ciertos plásmidos de cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus codifican una metilasa de ARN inducida por la presencia de eritromicina: esta enzima modifica por metilación un determinado nucleótido del ARNr 23S de la subunidad grande del ribosoma. Concretamente introduce dos metilos en el N de una determinada adenina, usando S-adenosilmetionina (SAM) como donador. Esto produce un cambio conformacional en el ribosoma que disminuye su afinidad hacia la eritromicina y hacia la lincomicina (resistencia cruzada a los dos antibióticos). El mecanismo genético subyacente al carácter inducible de la metilasa es muy interesante; en lugar de un mecanismo a nivel transcripcional, como es habitual en las bacterias, se trata de un mecanismo de regulación traduccional: en las bacterias en ausencia de eritromicina el ARNm de la enzima posee una estructura secundaria que evita su traducción por los ribosomas, pero en presencia de eritromicina este ARNm cambia de conformación y puede ser leído, produciéndose la metilasa que inactivará la diana del antibiótico.
- 162. Microbiología y Mediosde Cultivo – Práctica de Laboratorio 162 Resistencia a las rifampicinas Como ya sabemos por el cap. 20, las rifampicinas actúan uniéndose a la subunidad de la ARN polimerasa eubacteriana. La resistencia a estos antibióticos depende de una mutación cromosómica que altera dicha subunidad, haciéndola insensible a estos inhibidores. Resistencia a las quinolonas, novobiocina y coumermicina Las mutaciones cromosómicas que interesan a la subunidad A de la ADN-girasa bacteriana producen resistencia al ácido nalidíxico. Sin embargo, las quinolonas de última generación (fluoroquinolonas como el ciprofloxacino) no se ven afectadas, quizá debido a la enorme potencia de estos quimioterápicos. Las mutaciones cromosómicas que afectan a la subunidad B de la girasa rinden resistencia a la novobiocina y a la coumermicina 9.4. SINTESIS DE UNA NUEVA ENZIMA RESISTENTE. Resistencia a sulfamidas Determinados plásmidos R portan genes de resistencia a sulfamidas (SuR), que codifican una dihidropteroico sintetasa muy resistente a la acción de estos quimioterápicos, debido a que tienen una afinidad 10 000 veces menor que la enzima normal codificada por el cromosoma. Resistencia a trimetoprim Muchos plásmidos R llevan un gen que codifica una dihidrofolatorreductasa (DHFR) muy resistente al trimetoprim. Resistencia a meticilina En muchos hospitales medran cepas muy peligrosas de Staphylococcus aureus resistentes al -lactámico meticilina. Estas cepas producen una forma especial de proteína PBP2 (la llamada PBP2a) que posee una baja afinidad por los -lactámicos, incluyendo la meticilina. Parece que el gen codificador correspondiente reside en un transposón.
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