Manual practicas micalimentos

Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)

MICROBIOLOGÍA
DE ALIMENTOS
(Guión de Prácticas)

1° INGENIERO TÉCNICO AGRÍCOLA
INDUSTRIAS AGRARIAS Y ALIMENTARIAS
CURSO 2005-2006

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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS (PRÁCTICAS)

Profesor: Cristina Solano Goñi (Profesora Asociada)
e-mail: cristina.solano@unavarra.es
Tfno. Contacto: 948-168024
Dirección: Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales. UPNA/CSIC

Objetivo
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan:

.- las buenas prácticas de trabajo en el laboratorio de Microbiología
.- aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo
- familiarizarse con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la
manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad
.- familiarizarse con el manejo del microscopio óptico para la visualización de
microorganismos así como las tinciones más habituales en el laboratorio de
Microbiología
.- aprender otras técnicas como las de transformación bacteriana, infección de
bacterias con bacteriófagos, así como aprender a realizar un antibiograma
.- determinar el grado de contaminación microbiológica de los alimentos. Ejemplo:
contenido de gérmenes por gramo de alimento a 30 °C
.- verificación de las buenas prácticas de fabricación (BFP). Ejemplo: recuento de
indicadores en alimentos procesados (coliformes, enterobacterias, gérmenes totales,
etc.)
.- determinación de microorganismos testigos de falta de higiene.
.- comprobación de la salubridad de un alimento mediante la determinación de la
ausencia o presencia de gérmenes patógenos o toxinas que provocarían riesgos al
consumidor (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, toxina estafilocócica, etc).
.- descripción de técnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en
la producción de alimentos.

Metodología
Lecciones prácticas en el laboratorio de Microbiología (en grupos
reducidos). Cada grupo realizará las prácticas a lo largo de cuatro semanas (3 días
/semana; 2horas/día). La realización de las prácticas es obligatoria para aprobar la
asignatura.

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Prácticas de Microbiología General

Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios
de cultivo. Esterilización.
Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de
diferentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la
importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además también se
pretende que el alumno se familiarice con las técnicas empleadas en
Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en
condiciones de esterilidad.

Práctica 2: Obtención de cultivos puros.
Con esta práctica se pretende estudiar las diferentes técnicas de aislamiento
de un microorganismo a partir de una población mixta para obtener un cultivo
puro.

Práctica 3: Cultivo de bacterias anaerobias.
El objetivo de esta práctica es conocer el fundamento y la técnica más
comúnmente empleada en el aislamiento de bacterias anaerobias.

Práctica 4: Observación de bacterias teñidas. Tinción Simple y Tinción de
Gram.
Con esta práctica se pretende familiarizar al alumno con el manejo del
microscopio óptico para la visualización de microorganismos. Se observarán
preparaciones bacterianas bajo diferentes técnicas de tinción que permitan
establecer diferencias morfológicas y estructurales entre y dentro de los
microorganismos.

Práctica 5: Recuento del número de bacterias por mililitro de un cultivo líquido.
El objetivo de esta práctica es dar a conocer al alumno otra de las técnicas de
obtención de cultivo puros así como el aprendizaje para hacer diluciones y
recuentos bacterianos.

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Práctica 6: Antibiograma.
El objetivo de esta práctica es estudiar qué son los antibióticos y cómo se
realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto químico
(antibiótico) mediante la técnica de Kirby-Bauer.

Práctica 7: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano
El objetivo de esta práctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de
un cultivo bacteriano a altas temperaturas.

Práctica 8: Transformación bacteriana por resistencia a ampicilina.
En esta práctica se hablará de los fenómenos de transformación,
conjugación y transducción y se realizará un ensayo de transformación bacteriana por
adquisición de plásmidos resistentes al antibiótico ampicilina.

Práctica 9: Aislamiento y características de un bacteriófago (virus de bacterias)
El objetivo de esta práctica consiste en visualizar la presencia de
bacteriófagos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso sobre bacterias de
Staphylococcus aureus.

Práctica 10: Observación de levaduras.
El objetivo de esta práctica es el cultivo de diferentes levaduras y la
posterior identificación de las mismas de acuerdo a sus características morfológicas a
través de su observación al microscopio.

Práctica 11: Tinción de esporas.
En esta práctica se estudiará el género Bacillus por su capacidad para la
formación de endosporas y se procederá a la realización de la correspondiente tinción
diferencial para poder visualizar al microscopio dichas estructuras.

Práctica 12: Tinción de cápsula.
En esta práctica se estudiarán las cápsulas bacterianas y se procederá a
una tinción diferencial para la visualización de la misma al microscopio.

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Prácticas de Microbiología de Alimentos

La gran versatilidad metabólica de los microorganismos hace que los podamos
encontrar prácticamente en cualquier entorno. Los alimentos son fácilmente
colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el
procesamiento y la manipulación. La multiplicación de los microorganismos en el
alimento puede implicar desde una alteración inapreciable hasta su deterioro
completo y puede ser, en cualquier caso, una vía de transmisión de enfermedades.
Por el contrario, en otras ocasiones, la alteración resulta beneficiosa debido a la
adquisición de nuevas propiedades fisicoquímicas de interés organoléptico o de
conservación (que impidan la colonización por otros microorganismos).
Las siguientes prácticas se centran en la detección de microorganismos en el propio
alimento y además se describen técnicas sencillas para estudiar el papel de los
microorganismos en la producción de alimentos.

Práctica 13: Análisis microbiológico de alimentos frescos-cocinados.
Investigar tanto la presencia de microorganismos patógenos que representan
un riesgo para la salud del consumidor como la de aquellos que producen
alteraciones en el alimento durante el periodo de conservación. Para ello, se
realizarán los siguientes ensayos tras haber preparado convenientemente la muestra:

Preparación de la muestra:
Tomar la muestra en condiciones asépticas. Para ello se pueden emplear
cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la
toma de muestra y el análisis, se mantendrá la muestra en refrigeración.
Homogeneización del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial
de paletas para que la distribución de los microorganismos en el medio sea
homogénea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plástico estéril
(especial para el homogeneizador) y se añaden 90 ml de caldo de peptona
estéril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos,
aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.

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Realizar una serie de diluciones decimales seriadas: en tubos con 9 ml de
caldo de peptona. En función de la carga microbiana esperada en el alimento
se realizan las diluciones que se crean convenientes.
NOTA: Al añadir 90 ml de caldo de peptona a los 10 g de muestra, se está
realizando la primera dilución decimal (los 10g de la muestra van a implicar
aproximadamente 10 ml de volumen).

13-A INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES
Recuento de microorganismos mesófilos totales
Recuento de enterobacterias en placa
Recuento de mohos y levaduras
13-B DETERMINACIÓN DE INDICADORES DE FALTA DE
HIGIENE
Recuento de coliformes totales en placa
Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos
13-C INVESTIGACIÓN DE PATÓGENOS
Presencia de Salmonella
Presencia de Listeria monocytogenes

Práctica 14: Recuento de formas vegetativas y esporuladas
El objetivo de esta práctica consiste en determinar la presencia de esporas en
un alimento y confirmar su resistencia a las altas temperaturas.

14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS
14-B RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y
ANAEROBIAS

Práctica 15: Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de
manipuladores de alimentos
Determinar el grado de contaminación ambiental y del propio manipulador
para estudiar la influencia en el número y tipo de microorganismos que luego pueden
desarrollarse en un alimento.

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15-A ANÁLISIS DEL AIRE
15-B ANÁLISIS DE SUPERFICIES
15-C ANÁLISIS DE MANIPULADORES

Práctica 16: Utilización de los microorganismos en la industria alimentaria
Descripción de dos técnicas sencillas para estudiar el papel de los
microorganismos en la producción de alimentos.
16-A PREPARACIÓN DE YOGUR
16-B PREPARACIÓN DE CERVEZA

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NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA

Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado
donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser
llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente
limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas
de esterilidad biológica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de
gas).
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados
patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con
precaución por su potencial patogenicidad.

Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus
recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a
un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo,
aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras.

Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de
NORMAS DE SEGURIDAD:

1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.

2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y
jabón.

3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes
más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

3. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben
evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

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6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la
realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados,
que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado
por la fregadera o a la basura común.

8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.

10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos,
etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.

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CALENDARIO DE PRÁCTICAS

1a SEMANA

1er DIA- práctica 1
¿Qué es un medio de cultivo en microbiología?. Preparación de medios de
cultivo generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales
• sólido en placa
• sólido en tubo (slant)
• líquido (caldo)

Esterilización: Diferentes técnicas, aparatos y formas de trabajo para lograr la
esterilización del material y para desechar el material una vez contaminado.

2º DIA- prácticas 1, 2 y 3
-Siembra de los medios preparados el día anterior:
• siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estrías.
• siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estrías en una placa de
LB y otra de agar McConkey.
• siembra de un caldo de LB.
• siembra de dos cultivos en slant de TSI.
• siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies
para demostrar la ubicuidad de los microorganismos
• siembra de levaduras en agar sabouraud: incubación a temperatura ambiente.
Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilización de la jarra de anaerobiosis

3er DIA- práctica 4. Resultados prácticas 1, 2 y 3.
Tinción de Gram: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma

Ver los resultados del agotamiento por estrías y del crecimiento en medio
líquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y
diferencial.
Comprobar la ubicuidad de los microorganismos
Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.

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2a SEMANA

1er DIA- prácticas 5, 6 y 7.
Dilución de un caldo con E. coli para calcular el nº de U.F.C./ ml.
Estudio del efecto de antibióticos sobre el crecimiento bacteriano mediante la
técnica del Antibiograma (Cuantitativo y Cualitativo)
Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento bacteriano

2o DIA- prácticas 8 y 9. Resultados prácticas 5, 6 y 7.
Transformación bacteriana: Realización de la técnica de transformación de un
cultivo de E. coli (por resistencia a un antibiótico) como ejemplo de transferencia
horizontal de DNA.
Estudio de un virus (bacteriófagos): Cómo se pueden visualizar los virus. Ensayo
de infección de bacterias con virus en medio sólido

Ver los resultados de las diluciones seriadas del caldo de E.coli y cálculo del nº
de U.F.C./ml.
Ver los resultados de los antibiogramas
Ver los resultados del efecto de las temperaturas sobre el crecimiento
bacteriano

3er DIA- prácticas 10, 11 y 12. Resultados prácticas 8 y 9.
Tinción de Esporas: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma
Tinción de cápsula: Cómo se realiza y cuál es el objetivo de la misma
Observación de levaduras al microscopio: Diferencias entre organismos
procariotas y eucariotas al microscopio. Cómo es la célula levaduriforme.
Observación de varias especies de levaduras al microscopio.

Ver el resultado de la transformación bacteriana
Ver placas de lisis de los virus infectando a las bacterias en medio sólido

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3a SEMANA

1er DIA- práctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3, 16-B
Aprender a preparar, homogeneizar y diluir convenientemente la muestra a analizar para
el análisis de alimentos frescos-cocinados. Comenzaremos por la investigación de
microorganismos indicadores (mesófilos, enterobacterias) y la determinación de
indicadores de falta de higiene (coliformes totales, Escherichia coli y Staphylococcus
coagulasa positivos).
Comprobar la transformación de una suspensión de harina de malta que la levadura
Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo mediante una fermentación alcohólica para
dar lugar a cerveza.

Recuento de microorganismos mesófilos totales: Preparación de la muestra. Siembra
de diluciones en PCA.
Recuento de Enterobacteriaceae: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en
VRBG.
Recuento de coliformes totales en placa: Preparación de la muestra. Siembra de
diluciones en VRBL.
Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Preparación de la muestra.
Siembra de dilución en caldo EC de doble concentración.
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Preparación de la muestra. Siembra
de diluciones en Agar Baird Parker.
Preparación de cerveza: Preparación de la suspensión de harina de malta, activación de
las amilasas e inoculación con Saccharomyces cerevisiae.

2º DIA- práctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3
Recuento y tinción de Gram de colonias características. Pase de colonias características
a medios para su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas.

Recuento de microorganismos mesófilos totales: Recuento de placas. Tinción de
Gram de colonias con diferentes morfologías.
Recuento de Enterobacteriaceae: Recuento de placas y reconocimiento de colonias
características. Pase a agar nutritivo.
Recuento de coliformes totales en placa: Recuento de placas. Tinción de Gram de
colonias características.
Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Pase de tubos positivos de EC
a tubos con caldo de triptona.

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Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Recuento de placas y
reconocimiento de colonias características. Pase de colonias típicas y no típicas a
BHI.

3er DIA- práctica 13-A-2, 13-A-3, 13-B-2, 13-B-3
Tinción de Gram de colonias características. Pruebas bioquímicas confirmatorias.
Investigación de la presencia de mohos y levaduras.

Recuento de Enterobacteriaceae: Prueba de la oxidasa. Siembra en agar KIA. Tinción
de Gram.
Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Adición de reactivo de Kovacs
y confirmación.
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Adición de plasma de conejo con
EDTA. Resultado de la prueba de la coagulasa.
Recuento de mohos y levaduras: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en
OGA.

4a SEMANA

1er DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C
Análisis de alimentos frescos-cocinados: investigación de patógenos en alimentos como
posible causa de toxiinfecciones. Comenzaremos utilizando una muestra ya
preenriquecida y procederemos a enriquecer en medios líquidos selectivos.
Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de manipuladores de
alimentos.

Presencia de Salmonella: Muestra preenriquecida en agua de peptona tamponada.
Enriquecimiento en caldo Mueller Kauffmann tetrationato y Rappaport-Vassiliadis
Soja.
Presencia de Listeria monocytogenes: Muestra preenriquecida en caldo Fraser-demi.
Enriquecimiento en caldo Fraser.
Análisis del aire: Contaminación en placas de PCA para determinación de mesófilos
totales.
Análisis de superficies no planas: Siembra mediante método del hisopo en placas de
PCA y VRBG.
Análisis de superficies planas por placas de contacto Rodac: Análisis de la superficie
elegida con placas Rodac.

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Análisis de manipuladores: Contaminación en las manos y en el interior de la nariz.
Siembra en placas VRBG y Agar Manitol Sal.

13-A-2: Ver el resultado de la siembra de KIA a partir de colonias
características en el recuento de enterobacterias.
13-A-3: Recuento de colonias en placas OGA.
16-B: Comprobar el resultado de la fermentación alcohólica.

2º DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C, 14-A, 14-B, 16-A
posible causa de toxiinfecciones. Continuaremos la práctica procediendo a aislar los
patógenos en medios selectivos.
Estudio de la resistencia de esporas a los procesos de conservación utilizados en la
industria alimentaria mediante comparación del recuento de formas vegetativas y
recuento formas esporuladas tras tratamiento de la muestra a 80 °C.
Comprobar la transformación de la leche que los microorganismos presentes en un
yogur llevan a cabo mediante una fermentación láctica para dar lugar a otro yogur.

Presencia de Salmonella: Agotamiento en XLD y BGA.
Presencia de Listeria monocytogenes: Agotamiento en Oxford y Palcam.
Recuento de formas vegetativas: Preparación de la muestra. Siembra de diluciones en
PCA.
Recuento de formas esporuladas aerobias y anaerobias: Calentar el mismo tubo de
muestra utilizado para el recuento de formas vegetativas. Siembra de diluciones en
PCA (recuento de esporos aerobios) y en Schaedler (recuento de esporos anaerobios).
Preparación de yogur: Siembra de un tubo de leche con un cultivo iniciador.

15-A, 15-B, 15-C: Ver el resultado del análisis microbiológico de la
contaminación ambiental y de manipuladores de alimentos.

3er DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 14-A, 14-B, 16-A
posible causa de toxiinfecciones. Finalizaremos la práctica procediendo a realizar
pruebas bioquímicas específicas para la identificación del patógeno y tinción de
Gram.
Identificación de bacterias formadoras de esporas según tinción de Gram y prueba de la
catalasa.

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Comprobar el resultado de la fermentación láctica.

Presencia de Salmonella: Enseñar galería API. Explicar pruebas serológicas. Tinción
de Gram.
Presencia de Listeria monocytogenes: Explicar prueba de CAMP, iluminación de
Henry. Realizar prueba catalasa y tinción de Gram.
Recuento de formas vegetativas, esporuladas aerobias y anaerobias: Discernir entre
los géneros Bacillus y Clostridium según la prueba de la catalasa.
Preparación de yogur: Tinción de Gram del cultivo iniciador y del yogur preparado.

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Práctica 1: PREPARACION DE MEDIOS Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN
MEDIOS DE CULTIVO

Fundamento:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento
y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de
medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan
por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el
autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más
empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de
malta, etc.
4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de
algunos microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener
el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.:
fosfatos bisódicos o bipotásicos.
7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes
microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.

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9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actúan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

Tipos de medios de cultivo.

Por su CONSISTENCIA:
a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant
(tubos con la superficie del medio inclinada).
b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.

Por su COMPOSICIÓN:
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee.

Siembra de microorganismos

En términos microbiológicos se entiende por SIEMBRA el proceso
mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo)
de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento.

PARA UNA CORRECTA REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA SON
NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES:

1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles.
Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos
microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de
trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en
conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista
microbiológico.

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•La esterilización

Se utilizan dos tipos principales de esterilización:
Por MÉTODOS FÍSICOS (calor, filtración, radiaciones).
Por MÉTODOS QUÍMICOS (empleo de soluciones químicas).

Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso
del calor húmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la
temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del
agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo
que corresponde a una temperatura interior de 126ºC, manteniéndolo en estas
condiciones durante 20 minutos.
Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc..) se esteriliza con
calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato más empleado (se somete a
temperaturas de 140-180 ºC durante 2h-3h).
En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan
en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al
rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso.

2) Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya:
Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de
ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar
esterilizados previamente.

3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la
esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los
medios de cultivo.
Esto se resuelve con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz
ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que,
debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz
de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama,
de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.

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Material de la Práctica:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
Staphylococcus aureus.
Material a preparar por el alumno:
1 Tubo con medio líquido estéril (caldo común): Luria Bertani (LB)
2 Tubos con medio sólido estéril (agar inclinado): TSI
Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud.

Métodos:

1º) PREPARACIÓN DE MEDIOS

• Preparación de un medio sólido en placa.
1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos añadirlo a una
concentración de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella.
2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca.
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en un baño a
40ºC al menos durante 30 minutos.
4. Distribuir el medio en las placas de Petri que están estériles dentro de una campana
de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la
botella para evitar las contaminaciones.
5. Dejar que el medio solidifique.

• Preparación de medio sólido en tubo (slant).
1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz.
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe
hervir hasta que se vuelva transparente.
3. Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar.
Para ello se empleará una pipeta y los tubos no se llenarán más de un tercio de su
volumen.
4. Autoclavar.
5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con
medio en slant.

• Preparación de medio líquido en tubo (caldo).
1. Pesar y rehidratar el medio.

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2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos más de 1/3 de su volumen).
3. Autoclavar.
4. Sacar del autoclave y dejar enfriar.

Todos los medios se guardan en nevera a 4ºC.

2º) REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA
1.- Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo.
2.- Realizar la siembra, como sigue:

a) Siembra en medio líquido:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo
que se lleva al tubo estéril con medio líquido (agitándola en el seno del medio),
tomando las precauciones mencionadas anteriormente.

b) Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo tomado de los
cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma una gota de inóculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.

c) Siembra en agar inclinado:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo
que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su
superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en
superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis).

3º) INCUBACIÓN de los medios sembrados a 37 ºC hasta que haya habido
crecimiento bacteriano.

4º) OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS:
En primer lugar, observar a simple vista diversas características como el
color y el borde de las colonias crecidas en el agar así como el olor y la turbidez del
medio ya que en algunos casos suelen ser típicos de un determinado tipo de
microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificación.
El siguiente paso sería la observación al microscopio, que será objeto de otra
práctica.

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Práctica 2: OBTENCION DE CULTIVOS PUROS

Introducción
Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de
microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de
aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de
cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas.
Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un
grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo
más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al
origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente
iguales y constituyen un clon.
En esta práctica emplearemos dos métodos para obtener un cultivo puro:
• Aislamiento por agotamiento por estrías
• Aislamiento por siembra de diluciones seriadas (que será el objeto de
otra práctica más adelante).
•
• Agotamiento por estrías.
Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del
inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es
obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas
distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas
bacterias originará una colonia.
Procedimiento:
1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.
2. Tomar el inóculo como se ha descrito anteriormente.
3. Transferir el inóculo a un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. Extenderlo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción
pequeña de la placa.
4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estrías sembradas la
primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de
estrías que no toque la primera.
5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operación descrita en el apartado anterior, pero
rozando al empezar la segunda tanda de estrías.
6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37ºC.

21


Práctica 3: CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

Las bacterias anaerobias se pueden cultivar eliminando el oxígeno del
medio ambiente o estableciendo un potencial rédox bajo, mediante la adición de los
suficientes materiales reductores al medio de cultivo.
La protección de los cultivos anaerobios del oxígeno libre se puede
conseguir por varios métodos diferentes, el más empleado en clínica es sembrar la
bacteria en placas o tubos de cultivo e introducirlos en las llamadas jarras de
anaerobiosis donde se genera una atmósfera libre de oxígeno. Estas jarras constan de
un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética. Las
placas y los tubos sembrados se colocan dentro del soporte en el interior de la jarra
junto al sobre comercial abierto. Para crear la atmósfera anaerobia se utiliza el sobre
comercial que contiene una tableta de borohidrato sódico, otra de bicarbonato sódico
y ácido cítrico y un catalizador de paladio. Cuando se añade agua al sobre, el
borohidrato sódico, bicarbonato sódico y ácido cítrico reaccionan para formar
hidrógeno y dióxido de carbono. El catalizador de paladio cataliza la reacción entre el
hidrógeno y el oxígeno presente dentro de la jarra. Esta reacción produce agua, que se
condensa en las paredes de la jarra. Para confirmar que la atmósfera es anaerobia se
coloca dentro de la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. Éste es
azul en presencia de oxígeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio.
Esquema tomado de :http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p14.pdf

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Práctica 4: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS TEÑIDAS

Para observar las bacterias teñidas es necesario, en primer lugar, hacer un
frotis de las bacterias y fijarlo.
Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio
líquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden sobre el
portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio sólido, debe depositarse previamente
una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuación, se toma con el asa una
pequeña parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua, realizándose la extensión
como en el caso anterior.
La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición
físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta
conserve definitivamente una estructura similar a la que tenía en vivo, sin deformarse
como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por
otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos
adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los
colorantes.
Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el
calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o
tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que
procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la
bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano,
debe quemar.

Material:
Portaobjetos.
Mechero Bunsen.
Asa de siembra.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Cubetas de tinción o similar.
Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y
Safranina.

Método:
1º) Realización del frotis y la fijación de los diferentes cultivos de bacterias Se
procederá tal y como se ha descrito anteriormente.

23


2º) Tinciones:
A) La TINCIÓN SIMPLE es la tinción en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de
naturaleza básica. La técnica es la siguiente:

1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparación y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x)
empleando el aceite apropiado.
Esta técnica permite observar la morfología y tamaño de las bacterias, así como los
tipos de agrupaciones que forman.

B) La TINCIÓN DE GRAM es la tinción diferencial más utilizada en
Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-
positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células
cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más
utilizado es el cristal violeta.
2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el
colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales
metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de
yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol-
acetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el
primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos
bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren en el color con
el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teñirán de azul
por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos
sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del
cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la
safranina. La diferencia está determinada por la composición de su
envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de
peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias gram
negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una
membrana externa que envuelve toda la célula.

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El método de tinción es el siguiente:

1. Se prepara el frotis, se seca y se fija.
2. Se cubre con cristal violeta durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Se traza con lugol un minuto. El lugol actúa como mordiente aumentando la
afinidad del colorante por la bacteria.
5. Lavar con agua el exceso de lugol.
6. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparación deje de
perder color y se lava enseguida con agua abundante.
7. Se cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina,
durante un minuto.
8. Se lava con agua y se seca al aire, observándose a continuación con el
objetivo de inmersión.

3º) Observación de las tinciones de bacterias al microscopio.
Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras
que las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias
Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram-
positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la reacción es
clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden
parecer Gram-negativas.

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Práctica 5: RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO

Introducción
El método que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas
de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades
conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de
las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originará colonias
separadas. Contando el número de colonias, el volumen sembrado en la placa y la
dilución correspondiente, podremos calcular el número de unidades formadoras de
colonias presentes en la muestra inicial.

Material
- Muestra
- Pipetas automáticas.
- Tubos eppendorf.
- Placas de agar LB.

Método
A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de
esterilidad.
-2 -4 -6 -8
Extender 25 µl de las diluciones 10 , 10 , 10 y 10 en una placa e incubar toda la
noche. A partir del número de colonias presentes en cada dilución, calcular el número
de bacterias por ml en el cultivo original.

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Práctica 6: ANTIBIOGRAMA

Introducción
En nuestros días han sido puestos a nuestra disposición para la lucha
contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos.
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por
microorganismos o derivados semisintéticos de éstas, mientras que los
quimioterápicos son productos de síntesis química, pero ambos tienen la propiedad
de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos
antibacterianos. La evaluación de esta sensibilidad nos va a ayudar en la selección del
compuesto más adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las
pruebas más utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente
antibacteriano están basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas
concentraciones del agente.
• Concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una
cepa bacteriana dada.
• Concentración mínima bactericida (CMB) se define como la
menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa
bacteriana dada.

Fundamento
El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la
que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una
solución antibiótica absorbida en discos de papel de filtro. Este método está
estandarizado y los halos de inhibición han sido obtenidos correlacionándolos con las
CMI y aparecen en unas tablas.
Hay varios factores que afectan al halo de inhibición: la carga del
antibiótico en los discos, la difusión del antibiótico en el medio de cultivo, el tamaño
del inóculo bacteriano, la composición y grosor del medio de cultivo, la velocidad del
crecimiento bacteriano y el tiempo de incubación.
Los discos de antibióticos son adquiridos comercialmente. Deben
contener la cantidad establecida de antibiótico y ser conservados a 4ºC protegidos de
la humedad.
El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala
8
de McFarland, aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solución salina
estéril o caldo de cultivo.

27


Objetivos
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una
metodología sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiología.

Material necesario
- Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
- Placas de LB agar.
- Discos comerciales de antibióticos.
- Hisopos estériles
- Pinzas de laboratorio.

Realización
1. Preparación del inóculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra
X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del
inóculo debe equivaler al estándar 0,5 de McFarland.
2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasándolo uniformemente
por toda la superficie en tres direcciones. Por último, pasar el hisopo por el reborde
de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibióticos sobre la
superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre
la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de
la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de
inhibición. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a
difundir los antibióticos.
3. Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18-24 horas.
4. Medir los diámetros de los halos de inhibición con una regla.

Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibióticas.
Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un sólo antibiótico, preparado a
distintas concentraciones.

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Esquema: preparación de los discos impregnados de antibiótico para realizar un
antibiograma. Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/microbi3.htm

Interpretación de los resultados
Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de
resistente (R), intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S).

Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg

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Práctica 7: EFECTO DE LAS ALTAS TEMPERATURAS SOBRE EL
CRECIMIENTO MICROBIANO

Fundamento
Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los
microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que normalmente
crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos nucleicos. Estos primeros
daños impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme una colonia sobre un
medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto en duración y se efectúa a
una temperatura no excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son reparables y, por
eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura o en
duración, los daños se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su
capacidad de formar colonias. Se habla entonces de efecto letal.

Material necesario
3 matraces con un cultivo de la bacteria problema.
1 placa de Petri de agar LB.
Micropipeta y puntas estériles.
Mechero Bunsen.
Baño termostático a 60ºC.

Realización
Se dispondrá de tres matraces con un cultivo de la bacteria problema y de una placa
de Petri con agar LB.
1.- Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con
el tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 15 y 30 minutos.
2.- Tomar, con una punta estéril, 25 µl de uno de los cultivos y extenderlos sobre la parte de
la superficie de la placa correspondiente al tiempo t=0.
3.- Colocar los otros dos matraces en el baño de agua e incubar a 60ºC.
4.- A t= 15 y 30 minutos tomar 25 µl de muestra del matraz que corresponda y extenderlos
sobre la parte de la placa correspondiente.
5.- Incubar la placa a 37ºC durante una noche.
6.- Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos (a t=0 será
imposible porque se tratará de un césped).

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Práctica 8: TRANSFORMACION BACTERIANA POR RESISTENCIA A
AMPICILINA

Las bacterias pueden transmitir la información genética verticalmente (de
"madres" a "hijas") o de una manera horizontal (entre bacterias que coexisten al
mismo tiempo).
La transferencia vertical se realiza mediante el proceso de división celular
y el reparto equitativo del cromosoma bacteriano replicado. La transferencia
horizontal se realiza entre células vecinas y es el mecanismo a través del cual las
bacterias diseminan los genes de resistencia a antibióticos. Los vehículos mediante
los cuales se transfiere el DNA horizontalmente son los plásmidos o los fagos. Un
plásmido es un elemento extracromosómico con capacidad de autoreplicación y los
fagos son virus de bacterias.
Los mecanismos de la transferencia horizontal son:

1.-La TRANSFORMACION: por este mecanismo una célula es capaz de tomar un
fragmento de ADN del medio extracelular y expresar los genes en él
contenidos.
2.-La CONJUGACION: las bacterias capaces de formar el "pelo F" pueden
transferir una copia de parte de su cromosoma a otra bacteria receptora. Es un
procedimiento de transmisión sexual de información genética.

3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el
ADN viral está integrado en el de la bacteria (ciclo lisogénico) se escinde del
cromosoma bacteriano (pasa a ciclo lítico) puede llevarse consigo parte del
genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que
infecte.

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Esquemas tomados de: http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg

Para que se produzca la transformación de un bacteria ésta debe
encontrarse en un estado fisiológico especial denominado "competencia". Las células
competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar un
ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede
expresar sus genes en la bacteria transformada. Si este ADN externo tiene un origen
de replicación funcional en la bacteria competente puede perpetuarse al pasar a las
células hijas (plásmidos).

Objetivo
Demostrar como podemos conferir a una bacteria la resistencia a un antibiótico
mediante transformación con DNA exógeno.

Material:

1 placa de Petri con medio de agar LB con ampicilina.
1 tubo eppendorf conteniendo 100 µl de células de E. coli competentes.
1 tubo eppendorf conteniendo 1µg de plásmido pGEMt portador de un gen de
resistencia a ampicilina.
1 pipeta de 0´1 ml limpia.

Metodología

A.-Preparación de células competentes: Las células de E. coli se cultivan en medio
LB y cuando están en fase exponencial se centrifugan y se resuspenden en una
disolución de CaCl2 50 mM. La concentración de las células es 10 veces la inicial.

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B.-Transformación
1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio.
2. Extender con la punta de la pipeta 50 µl de las células competentes en una
mitad de la placa.
3. Añadir el resto de las células sobre el ADN del segundo tubo.
4. Mantener 20 minutos en hielo.
5. Colocar el ADN con las células a 42º durante 1 minuto.
6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos.
7. Incubar las células a 37ºC durante 15 minutos.
8. Extender las células transformadas en la segunda mitad de la placa.
9. Incubar 20 horas a 37ºC

Observación y discusión de resultados.

Se observará que algunas de las células tratadas han adquirido resistencia
a ampicilina como se puede comprobar por la aparición de colonias en la placa en
que se sembraron.

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Práctica 9: AISLAMIENTO Y CARACTERISTICAS DE UN
BACTERIOFAGO (VIRUS DE BACTERIAS)

Los virus son demasiado pequeños para poder ser vistos con el
microscopio óptico y únicamente son visibles gracias al mayor poder de resolución
que ofrece el microscopio electrónico. Los virus están compuestos de un genoma,
bien en forma de DNA o RNA, y de proteínas. Son parásitos obligados y necesitan de
la maquinaria metabólica de la célula huésped para la replicación de su material
genético. En esencia un virus consta de ácido nucleico rodeado por una cubierta de
proteína, llamada cápsida.

Los bacteriófagos son virus de bacterias que presentan todas las
características de estructura y ciclo vital que presentan los virus animales o vegetales.
Se han descubierto especies de bacteriófagos que atacan selectivamente a
prácticamente todas las bacterias importantes conocidas. El bacteriofago Lamba (λ)
es uno de los bacteriófagos más estudiados de los específicos de E. coli. Infecta la
célula uniéndose al receptor de la maltosa (proteína que permite que la maltosa entre

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en la célula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la célula bacteriana.
En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma
bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar
nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisogénico y en el segundo de ciclo
lítico.

Objetivo
La presencia de virus pasaría desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes
infecciosos y que se hacen evidentes a través de los síntomas de las enfermedades
que producen. El objetivo de la práctica consiste en visualizar la presencia de
bacteriófagos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso.

Material
Dos placas de medio phage base precalentadas a 37°C.
Dos tubos de vidrio con 300 µl de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4
competentes diluidas en phage broth.
10 ml de phage top agar a 55 °C.
Eppendorf con 200 µl del fago φ 85 diluido en phage broth.
Pipeta automática
Pipeta de 5 ml estéril
Pipeteador automático

Metodología
Tomar un tubo con 300 µl de células competentes y añadirles 200 µl de una dilución
del fago. Mezclar por agitación. A partir de aquí, hacer lo mismo con el tubo con 300
µl de células competentes al que no le hemos añadido el fago.
Incubar 30 min a temperatura ambiente.
Añadir 5 ml de phage top agar a 55 °C. IMMEDIATAMENTE mezclar y añadir
sobre la placa de phage base precalentada a 37°C.
Dejar solidificar y meter en la estufa a 37°C.

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Práctica 10: IDENTIFICACION DE LEVADURAS

Introducción
Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse
asexualmente por gemación o fisión. La mayoría se reproducen asexualmente por
gemación polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la periferia de la
célula, una protuberancia (yema) que aumenta de tamaño hasta que finalmente se
desprende de la pared celular, constituyendo una nueva levadura. Unas pocas
especies se multiplican por escisión.
Algunas especies pueden formar micelio, y la mayoría de ellas fermentan
uno o varios azúcares. Intervienen en fermentaciones beneficiosas como la
fabricación del pan, vino, cerveza y quesos. También pueden intervenir en
alteraciones de zumos y frutas, miel, almíbares, jaleas, carnes, vino, cerveza y otros
alimentos.
Su identificación se basa en criterios morfológicos y fisiológicos. En esta
práctica nos centraremos en la identificación de levaduras siguiendo pruebas
morfológicas lo que nos permitirá aproximarnos al género al que pertenecen teniendo
en cuenta que la identificación definitiva se hace en base a pruebas bioquímicas.
Definimos algunos términos habituales en micología.
1. Blastospora: Célula fúngica que se forma como consecuencia de un proceso de
gemación.
2. Clamidospora: Espora esférica formada en las hifas, ya sea en posición intercalar
o terminal, de pared gruesa y cuyo diámetro es mayor que el de los filamentos en los
que se forma.
3. Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo.

Las pruebas morfológicas utilizadas para la identificación de levaduras son:
• Aspecto de las colonias.
• Observación microscópica de los cultivos.
Microscópicamente, es difícil distinguir en cultivos sobre agar las colonias de
levaduras de las bacterianas. La mayor parte son blanquecinas y algunas cremosas o
rosadas.

Objetivos
1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
2. Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las levaduras,
tales como presencia de micelio, blastosporas y clamidosporas.

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Material necesario.
1. Cultivos puros en agar Sabouraud de:
Candida pseudotropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Realización
1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras.
2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se
inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se
toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una
porción de la placa. Se incuban las placas durante tres días a temperatura
ambiente.
3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequeña cantidad del cultivo en medio
sólido a la gota. Remover hasta formar una suspensión homogénea. Colocar
un cubreobjetos
4. Observación microscópica de los cultivos. Se empleará el objetivo X10.

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Práctica 11: TINCIÓN DE ESPORAS

Fundamento:

Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de
formar endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas
temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales
son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones,
compuestos tóxicos, etc.), formándose una espora por cada forma vegetativa. Al
finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al
exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. La formación de
endosporas es un carácter de gran importancia en la biología de un microorganismo.
La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana
bacteriana frente a la tinción, por lo que se utilizan técnicas especiales de coloración
con verde malaquita o fucsina básica (en caliente) como colorantes.

Material:
-Cultivo de Bacillus en medio sólido.
-Portaobjetos.
-Asa de siembra.
-Mechero Bunsen.
-Papel de filtro.
-Verde malaquita (solución acuosa al 2%).
-Safranina.
-Microscopio.

Método:

1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas)
de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor.
2. Colocar el porta sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro de
aproximadamente el mismo tamaño que la extensión (tienen por objeto mantener
húmeda la preparación y evitar que los bordes del porta se manchen de colorante).
3. Añadir la solución de verde malaquita (solución acuosa al 2%), calentar con el
mechero nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisión de vapores blancos.

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Continuar calentando durante 5 minutos. Añadir más colorante si éste se evapora. Es
importante que la muestra no se seque.
4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro.
5. Teñir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto.
6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Se verá la endospora teñida de color verde y las células vegetativas de color rojo.

Interpretación de los resultados:
La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria
constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo
género. Por ejemplo, Bacillus sphaericus posee una endospora esférica con
localización terminal y deformante de la célula vegetativa, por lo que suele ser
denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene localizada la
endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un
abombamiento característico denominado en huso.

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Práctica 12: TINCIÓN DE CÁPSULA

Fundamento

La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan
muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de
material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular.
Las cápsulas se pueden clasificar en función del grado de asociación con
la superficie celular, o por su consistencia:

Cápsula rígida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la
entrada de partículas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un
límite exterior definido.
Cápsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partículas.
Además, es deformable y carente de límites precisos.
Cápsula integral: íntimamente asociada con la superficie celular, con la pared
celular
Cápsula periférica: asociada a la superficie celular sólo en determinadas
condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.
Hay una cierta confusión en la nomenclatura de las cápsulas. Por eso cabe destacar
que CÁPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rígido e integral. Capas
mucilaginosas son las de tipo flexible y periférico.

Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de papel activo (metabólico)
pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:

• Adhesión a otras células: microcolonias y consorcios
• Adhesión a sustratos inertes o vivos: colonización de sus nichos
ecológicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores)
• Protección contra agentes antibacterianos
La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenación regular
radial, o a veces en láminas concéntricas. El material capsular se compone de

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macromoléculas asimétricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades
repetitivas: polisacáridos o polipéptidos.

Material
- Cepas bacterianas: Klebsiella en medio líquido
- Tinta china
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Microscopio óptico

Método
La observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de
refracción es similar al del medio. Se recurre a tinción negativa por medio de
nigrosina o tinta china.

1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir una
gota de tinta china y mezclar bien.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta
china. Evitar que se formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes.
Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será
absorbido por los papeles.
4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las
manos con jabón.
5. Observar al microscopio, se debe de ver la célula teñida de negro y la cápsula
en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar
el contraste de las células.

41


Práctica 13: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS FRESCOS-
COCINADOS

Los alimentos son fácilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural,
en origen o durante el procesamiento y la manipulación. La multiplicación de los
microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteración inapreciable
hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una vía de transmisión de
enfermedades. Por lo tanto, el alimento puede ser vehículo de microorganismos
patógenos o de sus toxinas, con riesgo para el consumidor.
En esta práctica nos centraremos en algunas bacterias y hongos que pueden ser causa
tanto de toxiinfecciones, al ser ingeridas por el hombre, como de alteraciones
durante la conservación del alimento.

13-A: INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES

13-A-1. Recuento de microorganismos mesófilos totales (NF EN ISO 4833)
La determinación de este grupo nos da idea de la calidad de la materia prima y del
proceso de elaboración del producto. Cifras altas en este recuento pueden indicar un
proceso de alteración del alimento, aunque no necesariamente hay que relacionarlo
con la presencia de gérmenes patógenos.
Material
Muestra
Balanza de precisión
Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml
Placas de Petri estériles vacías
PCA fundido estéril para recuento en placa

Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a una serie de tres placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 45-
50 °C.
3. Incubar durante 24 h-72 h a 30 °C. Recuento de placas en las que el número
de colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.
4. Tinción de Gram de colonias con diferentes morfologías.

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13-A-2. Recuento de Enterobacteriaceae (NF EN ISO 7402)
Las bacterias pertenecientes a la familia Enerobacteriaceae son bacilos Gram
negativos que se caracterizan por ser:
. Bacilos Gram negativos
. Citocromo c oxidasa negativos
. Fermentadores de la glucosa
. Reductores de nitratos a nitritos
Se aíslan del intestino del hombre y de los animales, y su presencia en los alimentos
en niveles altos hace pensar en una elaboración inadecuada y/o contaminación
posterior. En esta práctica se hace un recuento de Enterobacteriaceae totales sin
llegar a identificar los géneros.
Material
Muestra
VRBG fundido para recuento en placa
Placas de agar nutritivo
Tubos KIA
Reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio

Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de dos de las diluciones decimales y por
duplicado (10 -2, 10 -3), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBG fundido y atemperado a 45-
50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).
3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Las colonias características son de
color violeta con un halo de precipitación alrededor.
4. Confirmar las colonias típicas aisladas mediante pase a agar nutritivo
(incubación 24h a 37 C) y a partir de ahí, realizar la prueba de la oxidasa y
siembra en agar KIA y tinción de Gram. Cálculo de ufc/gramo.

13-A-3. Recuento de Mohos y levaduras (NF ISO 7954:1988)
Se investiga la presencia de mohos y levaduras por ser potencialmente productores
de micotoxinas y porque pueden llevar a cabo procesos de alteración del alimento.

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En esta práctica se aísla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibiótico
oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano.
Material
Muestra
Placas de Petri con medio OGA

Método
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA.
2. Incubar durante 5 días a 25 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.

13-B: DETERMINACIÓN DE INDICADORES DE FALTA DE HIGIENE

13-B-1. Recuento de coliformes totales en placa (NF ISO 4832,1991)
Los coliformes es un grupo perteneciente a las enterobacterias que además de
fermentar la glucosa también fermenta la lactosa. A este grupo pertenece E. coli que
es un indicador de contaminación fecal.
Características estructurales y fisiológicas de los coliformes:
. Bacilos Gram Negativos
. Citocromo C oxidasa negativos
. Fermentadores de la lactosa
Material
Muestra
Placas de Petri con medio VRBL

Método
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBL fundido y atemperado a 45-
50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).

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3. Incubar durante 24 horas a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Tinción de Gram. Cálculo de
ufc/gramo.

13-B-2. Investigación de Escherichia coli Presencia/Ausencia
Escherichia coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo
coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con producción de ácido y gas
a 37°C. Además, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentación a 44°C.
Es de interés su investigación en alimentos por ser indicador de contaminación
fecal, que implica una mala manipulación del producto.
Características estructurales y fisiológicas:
. Fermentadores de la lactosa
. Productores de indol a 44°C

Material
Muestra
Tubos con caldo EC con campana
Tubos con caldo de triptona
Reactivo de Kovacs

Método
1. Siembra de 10 ml de muestra (dilución 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble
concentración con campana, precalentados a 44°C.
2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44°C.
3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la
campana.
4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con
caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44°C
durante 24-48 horas.
5. Añadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol.

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13-B-3. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos (ISO 6888,1999)
Staphylococcus aureus pertenece a la familia Micrococaceae y es coco Gram
positivo, catalasa positivo y anaerobio facultativo, que se caracteriza por la presencia
de coagulasa (coagula soluciones de plasma). Es un germen ubicuo que se encuentra
en la piel y cavidad nasofaríngea del hombre y de numerosas especies animales,
especialmente en las mamas de vacas y ovejas de donde contamina leche y otros
alimentos. Esta bacteria es el agente etiológico de la intoxicación estafilocócica,
aunque no todas las cepas de esta especie son enterotoxigénicas (capacidad de formar
enterotoxinas).
. Coco Gram positivo
. Aerobio-anaerobio facultativo
. Catalasa positivo
. Coagulasa positivo
. Fermenta el manitol
. Posee enzima lecitinasa
Material
Muestra
Placas de Petri con medio agar Baird Parker
Tubos con caldo BHI y tubos con plasma de conejo/EDTA

Método
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio Agar Baird Parker.
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. Recuento de placas en las que el número
de colonias esté comprendido entre 15-150 (típicas y no típicas).
3. Confirmar tres colonias típicas y 3 no típicas mediante siembra en caldo BHI.
Incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.
4. Añadir 0,1 ml a tubos estériles que contienen 0,3 ml de plasma de conejo con
EDTA. Incubar durante 4-6 horas para observar la aparición del medio
solidificado por la acción del enzima coagulasa
5. Los resultados Staphylococcus coagulasa + se expresan como ufc/g o ml
multiplicando el número de colonias confirmadas positivas, por 10 (porque
hemos sembrado 0,1 ml por placa) y por el factor de dilución.

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13-C: INVESTIGACIÓN DE PATÓGENOS

Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al
ser ingeridos por el hombre.

13-C-1. Presencia de Salmonella (NF EN ISO 6579,2002)
Salmonella es una enterobacteria patógena causante de importantes trastornos
gastrointestinales, por lo que resulta de interés su investigación en Microbiología de
los alimentos. La legislación española actual no admite la presencia de esta bacteria
en los alimentos, por lo que se lleva a cabo un análisis de presencia o ausencia.
Los animales son el reservorio principal de la enfermedad humana, excepto para las
bacterias responsables de las fiebres tifoidea y paratifoidea en las que el único
reservorio es el hombre. La manifestación de la enfermedad puede ser subclínica
(portadores asintomáticos) o bien producir cuadros de enteritis, septicemia o fiebre
intestinal.
La transmisión se lleva a cabo por ingestión de alimentos contaminados
(especialmente pollos, huevos y productos lácteos).
Control: Preparación y refrigeración adecuadas de los alimentos. Mejora de la
higiene.
. No forman esporas
. Anaerobios facultativos
. Catalasa positivos
. No fermentadores de la lactosa
. Móviles por flagelos peritricos, excepto S. typhi y S. paratyphi.
. Requerimientos nutricionales simples
. No tienen actividad ureasa
. Son lisina y ornitina positivos

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Material
Muestra
Agua de peptona tamponada (BPW)
Placas de Petri con medio XLD
Placas de Petri con medio BGA
Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato
Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja

Método
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril
y añadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el
stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 °C.
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,
1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann
tetrationato e incubar a 37 °C durante 24 horas. Por separado, añadir 0,1 ml
de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis
Soja en incubarlo a 42 °C durante 24 horas.
3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar los caldos de
enriquecimiento y a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por
estrías en medio selectivos para Salmonella (XLD y BGA). Incubar las placas
a 37°C durante 24-48 horas.
Nota: Salmonella crece en XLD formando colonias rosas con centro negro
salmón. En BGA las colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el
medio a un rosa intenso.
4. Confirmación bioquímica y serológica: Si se considera conveniente, se
pueden realizar a partir de las colonias presuntivas de Salmonella pruebas
confirmativas bioquímicas y/o serológicas

13-C-2. Presencia de Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1, 1997)
Listeria es una bacteria ubicua que se encuentra principalmente en los pastos, desde
donde contamina vegetales y animales y posteriormente alimentos. Por ser una
bacteria psicotrofa y osmotolerante es capaz de multiplicarse en condiciones en las
que otros microorganismos quedan inhibidos. El género Listeria incluye 7 especies,
de las cuales la única patógena para el hombre el L. monocytogenes.

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. Bacilos Gram positivos
. Oxidasa negativos
. Esculina positivos
. Catalasa positivos
. Móviles
. Sulfhídrico negativos
Las distintas especies se pueden diferenciar por:
. Hemólisis
. Prueba de CAMP
. Producción de ácido a partir de xilosa
. Producción de ácido a partir de ramnosa
Material
Muestra
caldo Fraser demi
caldo Fraser
Placas de Petri con medio Oxford
Placas de Petri con medio Palcam

Método
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril
y añadir 225 ml de caldo Fraser demi. Homogeneizar con el stomacher.
Incubar la bolsa 24 horas a 30 °C.
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,
0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Fraser e
incubarlo a 37 °C durante 24 horas. Los tubos que contienen Listeria se
ponen de color negro.
3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar el tubo de Fraser y realizar
un agotamiento por estrías en medio selectivos para Listeria (Oxford y
Palcam). Incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas.
Nota: Listeria crece en Palcam formando colonias pequeñas, negras-grisáceas,
rodeadas de un halo negro y deprimidas en el centro. En Oxford las colonias de
Listeria son verde grisáceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro y
deprimidas en el centro.

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4. Confirmación bioquímica: Para confirmar las colonias sospechosas como
pertenecientes al género Listeria, se realizarán las siguientes pruebas:
iluminación de Henry (positiva), tinción de Gram (bacilo Gram positivo) y
catalasa (positivo). Si las pruebas son positivas continuar la identificación de
la especie. L. monocytogenes es hemolítica, CAMP positiva, y fermenta la
ramnosa, pero no la xilosa.

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Práctica 14: RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS

Algunas bacterias productoras de esporas (Bacillus, Clostridium) resisten algunos
procesos de conservación utilizados en la industria alimentaria en los que las formas
vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. También especies de estos
géneros provocan enfermedades alimentarias.

14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS
Material
Muestra
Pipetas automáticas de 1
PCA fundido para recuento en placa

Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacías estériles.
50 °C.
3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Tinción de Gram y de esporas de
los distintos tipos de colonias.

14-B RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y
ANAEROBIAS

Material
Muestra
Pipetas automáticas de 1
PCA fundido para recuento en placa
Medio Schaedler fundido para recuento en placa
Jarra de anaerobiosis

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Método
1. Calentar el tubo de muestra (dilución 10 -1) a 80 °C en el baño durante 10
minutos. Este tratamiento térmico destruye las formas vegetativas pero lo
resisten las esporas.
2. Hacer una dilución decimal en caldo de peptona del tubo previamente
sometido a calor.
3. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacías estériles.
50 °C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y
atemperado a 45-50 °C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso
añadir doble capa).
5. Incubar durante 24 h a 37 °C. Las placas de anaerobios se incuban en una
jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el número de colonias
esté comprendido entre 30 y 300. Comparación con el recuento de aerobios
mesófilos. Tinción de Gram y esporas.

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Práctica 15: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA CONTAMINACIÓN
AMBIENTAL Y DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS

Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en
el agua, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. Cuando el tema a
tratar es la microbiología de alimentos, es importante determinar el grado de
contaminación ambiental, ya que las condiciones higiénicas del lugar de trabajo
(utensilios, superficies, etc.) y del propio manipulador van a influir en el número y
tipo de microorganismos del alimento.

15-A ANÁLISIS DEL AIRE
El aire, además de partículas en suspensión, es portador de bacterias o sus esporas.
Por ello, puede ser causa tanto de contaminación de alimentos y superficies como de
infecciones en el hombre (patologías respiratorias, etc.). Existen distintos métodos
para el análisis del aire: sedimentación, filtración, choque en líquidos y precipitación
electrostática, entre otros. En esta práctica vamos a explicar el primero, por ser uno
de los métodos más empleados. El método de sedimentación en placa es uno de los
más sencillos para la determinación de microorganismos del aire. A pesar de ello, los
resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en
el aire, ya que estos niveles varían en función de las corrientes de aire y del tamaño
de las partículas en suspensión.
Material
Placas de PCA

Método
1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminación se desee
examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas.
2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 °C.
3. Determinar el número de aerobios mesófilos totales ambientales.

15-B ANÁLISIS DE SUPERFICIES
Para llevar a cabo una correcta manipulación de los alimentos es necesario mantener
una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios que

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hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los
productos llevarán microorganismos. En la manipulación, el envasado y el
almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo
momento en niveles que aseguren la calidad microbiológica del alimento. El objetivo
de los análisis microbiológicos de superficies es comprobar el estado higiénico del
lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el
procesado de los alimentos. Existen distintos métodos para el examen microbiológico
de las superficies: método del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar,
de la lengüeta (o película pegajosa), etc. En esta práctica se describen el método del
hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac
(para el estudio de superficies planas).

15-B-1. Análisis de superficies no planas (método del hisopo)
Este sistema es el más antiguo y el más utilizado en el examen microbiológico de
superficies, ya que sirve para el análisis tanto de superficies planas como no planas.
Es especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios
(máquinas picadoras de carne, cubiertos, etc.). Además, se pueden estudiar
superficies muy contaminadas, ya que a partir de la solución salina estéril es posible
realizar las diluciones decimales precisas.
Material
Plantilla de papel de aluminio estéril
Hisopo estéril
10 ml de solución salina estéril
Placa de PCA y VRBG

Método
1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de
aluminio estéril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm2).
2. Humedecer el hisopo estéril en una solución de 10 ml de solución salina
estéril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla.
3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solución salina estéril y dejar
durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodón
al caldo.
4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA y VRBG.
5. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. El resultado se expresa en ufc/9 cm2

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15-B-2. Análisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC: replicate
organisms direct agar contact)
Material
Placas Rodac
Medio PCA fundido y atemperado a 55°C

Método
1. El medio PCA, una vez fundido y atemperado a 55°C, se vierte en las placas
de manera que sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con
la superficie a examinar.
2. Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida.
3. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. La superficie delimitada por las placas
es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en ufc/25 cm2
Nota: el principal inconveniente de este método es su ineficacia en superficies muy
contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes
en la superficie. Sin embargo, se obtienen buenos resultados en los casos en los que
la carga microbiana es baja.

15-C ANÁLISIS DE MANIPULADORES
Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador
quien lo contamine durante el procesado. Consideramos normal que el manipulador
tenga una abundante carga microbiana en su piel, pero nunca deberán aislarse de ella
bacterias patógenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la
necesidad de que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene
durante el procesado de los alimentos. El objeto de un análisis de manipuladores es
comprobar que la persona que procesa el alimento no es una fuente de contaminación
de éste. Se pueden estudiar: manos, uñas y fosas nasales.
Material
Hisopo estéril
Placa de VRBG y Agar Manitol Sal.

Método
1. Para realizar esta práctica el alumno no se lavará las manos. Pasar los dedos
por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.

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2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la
mitad restante de la placa.
3. Tomar con un hisopo estéril muestra del interior de la nariz y sembrar el
hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.
4. Incubar durante 24 horas a 37 °C.
5. Observar el crecimento de las colonias características en cada medio de
cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de
Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus
aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).

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Práctica 16: UTILIZACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN LA
INDUSTRIA ALIMENTARIA

No todos los microorganismos son patógenos o alterantes, sino que algunos de ellos
pueden ser aprovechados por el hombre en la fabricación de diferentes productos.
Éste es el caso de las levaduras que se emplean por ejemplo, en la elaboración del
pan y bebidas alcohólicas como vino y cerveza. También se utilizan bacterias en la
fabricación de productos lácteos, embutidos, etc.
El objetivo de esta práctica consiste en comprobar la transformación que algunos
microorganismos llevan a cabo sobre diferentes materias primas para dar lugar a
productos aprovechables para la alimentación humana. Se propone la realización de
dos tipos de fermentación que se caracterizan por subproductos finales, de ahí los
nombres de fermentación láctica y fermentación alcohólica.

16-A PREPARACIÓN DE YOGUR
La fermentación láctica es producida por bacterias capaces de transformar azúcares
en ácido láctico, disminuyendo de tal manera el pH del medio, que impiden el
crecimiento de otros microorganismos. De este modo, la fabricación de yogur y de
otros productos lácteos fermentados tuvo su origen como un método de conservación
de la leche. La leche fresca tiene un pH de aproximadamente 6,6. A este pH, la
caseína (proteína de la leche) está formando una suspensión coloidal de caseinato
cálcico. Conforme las bacterias lácticas van fermentando los azúcares, con
producción de ácido láctico, el pH disminuye y, al llegar a 4,6 la caseína se
desnaturaliza y la leche se coagula formando un producto semisólido, que es el
yogur.
Material
2 tubos estériles con 5 ml de leche pasteurizada
yogur comercial
Método
1. Inocular uno de los tubos mediante el asa de siembra con el cultivo iniciador
de la fermentación procedente de un yogur comercial. El otro tubo no se
inocula y queda como control.

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2. Incubar los dos tubos durante 16 horas a 46-48 °C para favorecer el
crecimiento de estas bacterias, ya que son termófilas. Nota: también se
pueden incubar a 37 °C durante 24 horas.
3. Comprobar que se ha producido una fermentación láctica si la leche ha
coagulado en el tubo inoculado. En el tubo control no inoculado se mantienen
las características iniciales: la leche es líquida.
4. Mediante tinción de Gram se confirma la presencia de bacilos y cocos
responsables de la fermentación. En el tubo control no se observa ninguna
bacteria.

Fermentación láctica

16-A PREPARACIÓN DE CERVEZA
La cerveza es el producto que se obtiene de una fermentación alcohólica llevada a
cabo por levaduras sobre distintos cereales: cebada, maíz, arroz. Estos cereales
contienen almidón que no es fermentable por levaduras, por lo que previamente debe
ser hidrolizado a azúcares más sencillos: glucosa y maltosa. La harina de malta es la
cebada germinada y contiene gran cantidad de amilasas, enzimas responsables de la
hidrólisis del almidón. La activación de estas enzimas se produce a 75 °C, actuando

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sobre el almidón para romperlo en sus azúcares fermentables. De esta forma, la
levadura puede llevar a cabo la fermentación alcohólica para dar Co2 y etanol.
Material
2 tubos con harina de malta al 5%
Saccharomyces cerevisiae
Método
1. Preparar en un vaso de precipitados una suspensión en agua de harina de
malta al 5%. Es necesario mantener la suspensión en agitación, ya que la
harina no es perfectamente soluble en agua.
2. Llenar dos tubos de tapón de rosca prácticamente hasta el borde, de manera
que se genere una atmósfera microaerófila.
3. Incubar los dos tubos durante 1 hora a 75 °C para que se activen las amilasas
y rompan el almidón.
4. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 10 min para eliminar los posibles
microorganismos presentes y asegurar que la fermentación se debe
únicamente a la levadura.
5. Una vez enfriados los tubos a temperatura ambiente, inocular uno de ellos con
Saccharomyces cerevisiae mientras que el otro tubo no se modifica en
absoluto (tubo control). Nota: el inóculo se prepara resuspendiendo 29 mg de
levadura en 1 ml de solución salina estéril.
6. Incubar los dos tubos a temperatura ambiente durante varios días. En función
del inóculo añadido varía el tiempo necesario para la producción de la
cerveza.
7. Solamente en el tubo que contiene la levadura se producirá la fermentación
alcohólica, que se visualiza mediante la aparición de burbujas de CO2. Nota:
la cerveza así obtenida se puede filtrar y beber, aunque su sabor no es el de
una cerveza comercial, ya que no se le ha añadido lúpulo.

Fermentación alcohólica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Prueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son proteínas que forman
parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo
respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo
Enterobacterias (carecen del citocromo c) del género Pseudomonas (poseen
citocromo c).
Procedimiento: Añadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-p-
fenilendiamonio (incoloro). Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas
en placa y mezclar con el colorante. El colorante se oxida rápidamente en
presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul). Si la prueba es
negativa no habrá viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo).

Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima
triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros
coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es
el compuesto que se detecta en este ensayo.
Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de
proteínas animales es especialmente rico en triptófano) con una colonia. Incubar a
37 °C durante 24 horas. Añadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de
color rojo en la superficie del caldo, la prueba será considerada positiva.
El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede
reaccionar tanto con el indol como con el triptófano, produciendo compuestos de
coloración rojiza. Para evitar la interferencia del triptófano, el p-
dimetilaminobenzaldehido está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua.
A diferencia del triptófano, el indol es soluble en alcohol isoamílico, y por tanto,
sólo él reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado.
Galería API 10S: es una galería de varias pruebas bioquímicas simultáneas que
identificarán/confirmarán la enterobacteria que hemos aislado del producto
alimenticio.
Procedimiento: Añadir agua a la cámara de incubación (5 ml aproximadamente).
Coger 5 colonias y resuspender en 5 ml de agua destilada estéril (esto da una
turbidez aproximada de 0,5 en la escala de Mc Farland). Rellenar los pocillos del

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API (no la cúpula) con una pipeta Pasteur. El símbolo significa que el pocillo ha
de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la
cúpula del pocillo. Incubar a 37 °C durante 24 horas.
Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qué pocillos la prueba
correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un
cambio de color, la aparición de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de
fenilalanina necesitan reactivos apropiados (Kovacs y cloruro férrico
respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los números que
hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como éstos se encuentran
agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de números o código
que nos permitirá identificar la bacteria.

Prueba de CAMP: Permite distinguir la especie de Listeria que hemos aislado,
ya que L. monocytogenes potencia la β-hemólisis producida por S. aureus,
mientras que L. innocua no.
Procedimiento: sembrar en una placa de agar sangre una estría vertical de una
cepa beta-hemolítica de S. aureus. En una de las dos mitades, sembrar las cepas
control de dentro hacia fuera (sin llegar a tocar la estría central) en dos estrías
perpendiculares a la estría de S. aureus. En la otra mitad, sembrar una estría de la
muestra. Incubar a 37 °C durante 24 horas. Si la cepa aislada es CAMP positiva,
se observará una potenciación de la hemólisis en la zona de intersección, con
forma en punta de flecha.

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