Poe hplc

MANEJO DEL EQUIPO Y SOFTWARE CONTROLADOR
DEL HPLC AGILENT 1200
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Vigencia:
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AUTORIZACIONES
Preparado por: Revisado por: Aprobado por:
Cargo / Nombre: MSc
Marcel Berrio Medina
Cargo / Nombre: Docente Cargo / Nombre: Docente
Firma y Fecha: Firma y Fecha: Firma y Fecha:
1. OBJETIVO
Indicar los pasos para la correcta operación del equipo HPLC Agilent 1200 del laboratorio de
Investigaciones en Análisis Instrumental, así como de su software controlador.
2. ALCANCE
Este procedimiento aplica a todos los análisis e investigaciones que se desarrollan en el
HPLC Agilent 1200 del laboratorio de Investigaciones en Análisis Instrumental
3. DEFINICIONES
3.1 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Según define la IUPAC, “La Cromatografía es un método, usado principalmente para la
separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra se mueve.
En HPLC la fase móvil es el parámetro que gobierna la separación. Con una sola
columna es posible separar sustancias polares, iónicas, ionizables y no polares
simplemente modificando la composición de la fase móvil. Además, la selectividad
aportada por la amplia variedad de solventes aptos para ser empleados como fase
móvil en HPLC, le otorgan mucha mayor versatilidad. Si la fase estacionaria es un
sólido y la fase móvil un líquido la cromatografía se denomina cromatografía líquido-
sólido (LSC).
Básicamente, los equipos HPLC pueden clasificarse en integrados y modulares.

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En los primeros, cada una de las partes (reservorio de solventes, bomba, inyector,
horno y detector) están reunidas en un gabinete. En los segundos, los módulos son
instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según la necesidad del
analista sino aumentar su complejidad según varíe.
3.2 Prueba del Sistema de Idoneidad (SST)
Se define como la realización de usualmente 5 inyecciones de una solución de un
estándar de referencia a la concentración que corresponde generalmente al centro del
rango dinámico lineal para un compuesto dado (100%), con el fin de determinar la
repetibilidad, asimetría, platos teóricos y el factor de capacidad de la señal de interés
(pico cromatográfico) y con base en los resultados, establecer si el sistema es o no
apto para obtener datos estadísticamente exactos y precisos, es decir, confiables.
4. POLITICAS
Se debe seguir este procedimiento rigurosamente, sin embargo, se podrán realizar adiciones
o aportes al mismo en pro del mejoramiento en el manejo del equipo en cuestión y siguiendo
en todo momento los lineamientos de la cromatografía líquida de alta resolución.

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5. PROCEDIMIENTO
5.1 Identificación de las partes del equipo HPLC Agilent 1200
Figura 1. Cromatógrafo líquido de alta resolución
5.1.1 Reservorio de fase móvil
El reservorio es el recipiente que contiene la fase móvil. Puede emplearse como
reservorio cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de vidrio o polímero
resistente), con una buena tapa para impedir el ingreso de partículas
ambientales al sistema (se puede utilizar para asegurar el no ingreso de
partículas un papel polimérico adecuado). Al extremo del tubo de salida de
solvente se conecta un filtro de acero o vidrio (buzo) con 2 a 10 µm de
porosidad que impide el ingreso de partículas a la bomba. Además el reservorio
Reservorio de fase móvil
Horno
Automuestreador
Bomba
Desgasificador
Detector
Tuberías

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de la fase móvil debe estar bien identificado, indicando en lo posible las
proporciones de los componentes contenidos en el mismo. Es importante
recalcar que la fase móvil debe ser filtrada y desgasificada al igual que todos los
solventes sin importar que sean grado HPLC, utilizando filtros de 0.22 µm y
sonicándolos por 10 minutos. (Ver figuras 2, 3, 4, 5 y 6)
Figuras 2, 3 y 4. Reservorios de fase móvil
Figura 5. Equipo de filtración de solventes Figura 6. Equipo sonicador
5.1.2 Tuberías
La fase móvil empleada en HPLC debe circular por tuberías que conectan el
reservorio de solvente con la bomba, la bomba con el inyector, el inyector con la
columna cromatográfica y éste con uno o más detectores conectados en serie,
y eventualmente con un colector de fracciones o válvulas de distribución. Los
materiales más empleados para éstas son el teflón y el acero inoxidable,
estando las últimas presentes en los segmentos donde se experimenta mayor
presión, por ejemplo de la bomba al inyector. También tienen diferentes

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diámetros internos, siendo menores en aquellas tuberías donde circula la
muestra (hasta 0.2 mm).
Las uniones permiten conectar las tuberías, y con ellas, los distintos
componentes del sistema cromatográfico. (Ver figura 1)
5.1.3 Bomba
Las bombas impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solvente hacia
el inyector, y de allí hacia la columna. Básicamente existen dos tipos de bomba:
las de pistón (bombas reciprocantes) y las de desplazamiento continuo (bombas
jeringa). Las bombas deben entregar caudales constantes y exactos, producir
poco ruido y baja deriva y contar con sistemas de corte de caudal en caso de
presentarse caídas o aumentos drásticos de presión.
Es común que existan sistemas de desgasificación entre los reservorios de fase
móvil y la bomba que ayudan a asegurar un reducido acceso de aire al sistema.
(Ver figura 7)
Figura 7. Bomba reciprocante
5.1.4 Inyector o Automuestreador
El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin
interrumpir el caudal de solvente a través del sistema. Debe ser fácil de operar,
inerte al ataque químico y capaz de soportar altas presiones, debe ser preciso
en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema, no debe provocar
Desgasificador
Mezclador
Válvula de
purga

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diluciones importantes de la solución inyectada y operar a altas temperaturas.
La muestra inyectada está contenida en viales, los cuales pueden ser
transparentes o ámbar, poseen tapa rosca (en el caso de los equipos Agilent es
necesario colarla porque el brazo del automuestreador sujeta a los viales a
través de ésta) y septos que evitan la evaporación de la solución diluyente de
los estándares y muestras. Cabe recalcar que antes de llevar las soluciones de
estándar o muestra a dichos viales se deben filtrar a través de filtros de 0.45 µm
para evitar el taponamiento de la aguja del inyector y no se debe llenar por
completo el vial sino hasta la marca final del mismo, para permitir el
desplazamiento de volumen generado por la aguja e impedir, por lo tanto, que
se inyecte aire. Se recomienda utilizar viales, tapas y septos de la misma marca
del equipo HPLC. (Ver figuras 8, 9, 10 y 11)
Figura 8. Automuestreador
Figura 9. Partes del vial Figura 10. Filtros para Figura 11. Volumen
estándares y muestras recomendado de llenado
Rack
Brazo
Aguja
Septo
Cuerpo del vial
Tapa
Nivel máximo
de llenado

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5.1.5 Horno
El horno es la parte del equipo cromatográfico donde se conecta la fase
estacionaria o columna cromatográfica. Permite calentar (calentar y enfriar en el
caso de los equipos Agilent) la fase móvil antes de llegar a la columna y a la
columna misma, empleando termostatos, con el fin de optimizar la resolución de
los “picos” cromatográficos. Las columnas pueden ser de acero inoxidable o de
otros materiales poliméricos y poseer diferentes dimensiones, así como
diferentes rellenos dependiendo de la fase cromatográfica con la que se trabaja.
Esto es, para la cromatografía en fase reversa en la cual la fase móvil en
general está constituida por un solvente polar, mezcla de agua y un modificador
orgánico, a los que se les puede agregar aditivos sales y buffers, la fase
estacionaria está constituida por un sustituyente, siendo el más empleado el de
tipo alquílico, especialmente C18 y en menor proporción C8, con o sin
encapado, con menor o mayor grado de cobertura.
En la cromatografía en fase normal la fase estacionaria está constituida por
materiales polares con grupos como diol, ciano, nitro, amino y la fase móvil es
no polar como el hexano. (Ver figuras 12 y 13)
Figura 12. Horno
Columna
Termostatos
izquierdo y
derecho
Tubería de
entrada a la
columna

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Figura 13. Columna cromatográfica
5.1.6 Detector
El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite “ver” y ubicar en
tiempo y espacio la posición de cada componente de una muestra a la salida de
la columna cromatográfica. Debe tener un amplio rango dinámico de respuesta,
poseer una respuesta lineal, no contribuir al ensanchamiento de banda
extracolumnar, responder a todos los solutos, tener la sensibilidad apropiada,
no afectarse por cambios de temperatura, poseer una buena relación
señal/ruido, no destruir la muestra y tener una constante de tiempo baja. (Ver
figura 14)
Figura 14. Detector
5.1.7 Recipiente de desechos
El recipiente de desechos es la parte del equipo cromatográfico donde se
recogen los solventes después de salir de este. Puede ser una botella de vidrio
o de un material de plástico resistente, generalmente de volúmenes iguales o
mayores a 4 litros con el fin de permitir la realización del mayor número de
análisis sin que estos se derramen. Se debe identificar de forma adecuada,
Lámparas
Celda
Tapón de
columna
Sentido
del flujo

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asegurándose de tachar la etiqueta de la botella si se reutiliza una que haya
pertenecido, por ejemplo, a un solvente. Las tuberías de salida provienen de la
bomba (purga) y del detector. (Ver figura 15)
Figura 15. Recipiente de desechos
5.1.8 Sistema de toma y procesamiento de datos
El sistema de toma y procesamiento de datos registra y manipula la señal
proveniente del detector por medio de un registrador gráfico, un integrador y
una computadora. (Ver figura 16)
Figura 16. Sistema de toma y procesamiento de datos
(Quattrocchi, De Andrizzi, & Laba, 1992).

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5.2 Puesta en línea del equipo, adecuación y lavado de columnas
5.2.1 Puesta en línea del equipo
Para poner en línea el equipo HPLC se recomienda seguir los siguientes pasos:
1. En el escritorio del computador aparecen los iconos que despliegan el
software controlador (HPLC LAB 220), tanto online como offline (El icono de
offline se abre para revisar información anterior o la inmediatamente
terminada sin afectar las corridas que se están realizando). Se da “doble
clic” sobre cada uno de esos iconos, siempre haciéndolo primero sobre el de
online (El color rojo indica que el equipo está fuera de línea, observándose el
mensaje “Not Ready”). Se desplegará la siguiente ventana (Figura 17):
Figura 17. Pantalla principal del software controlador (online)
2. Antes de encender los módulos correspondientes a la bomba, horno e
inyector se da “clic” sobre el correspondiente a la bomba (ver figura 17) y
luego sobre la opción “Set up Pump”. Se desplegará la siguiente ventana
(figura 18):

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Figura 18. Ventana de ajuste de parámetros de la bomba
3. Se coloca flujo de “0” en la opción “Flow” y luego se da “clic” en “OK”. (Ver
figura 18)
4. Se da “doble clic” sobre el icono de los reservorios debajo del icono de la
bomba y luego “clic” sobre “Solvent bottles filing”, se desplegará la ventana
de sincronización de llenado de reservorios. En la opción “Total Volume” se
coloca la capacidad del reservorio en litros (por ejemplo 1.00 ó 2.00), en la
opción “Actual Volume” se coloca el volumen real en litros (por ejemplo 0.90
ó 1.50). Se aclara que el valor colocado en “Actual Volume” no puede
superar al de “Total Volume”. Se seleccionan todas las opciones disponibles
y se coloca en “Prevent analysis if level falls below” un valor de “0.050” litros,
con el fin de que se apague la bomba si el nivel de la(s) fase(s) móvil(es)
decae por debajo de 50 mL, impidiéndose la entrada de aire al sistema.
Luego se da “clic” en “OK”. NOTA: es importante recalcar que si no se lleva
a cabo este paso el equipo “creerá” que los reservorios se están secando
aunque este no sea el caso y se apagará la bomba deteniéndose el análisis,
por tal razón, se debe calcular muy bien el volumen de cada fase móvil o
solvente a emplear. (Ver figuras 19 y 20)

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Figura 19. Icono de sincronización de llenado de reservorios
Figura 20. Ventana de sincronización de llenado de reservorios
5. Se da “clic” sobre el icono “on” o sobre los iconos que aparecen en la parte
inferior derecha de cada icono modular, estos últimos también se emplean
para apagar dichos módulos. El color amarillo indica que los módulos están

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entrando en línea y el verde que el equipo se encuentra en línea. Se
observará el mensaje “Ready”. (Ver figuras 21 y 22)
Figura 21. Reconocimiento de módulos por parte del software
Figura 22. Equipo en línea

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5.2.2 Purga de tuberías
Es recomendable llevar un registro de todos los análisis realizados en el equipo
HPLC, ya que de esta forma se puede optimizar, entre otros el proceso de
purga de tuberías. Por ejemplo, si el último análisis involucró fases móviles del
tipo Buffer es necesario purgar todos los canales con abundante agua durante
un tiempo de 5 a 10 minutos a un flujo de 2 a 5 mL/min, este flujo dependerá
tanto del programa de verificación, calibración y mantenimiento del equipo
HPLC, como de la frecuencia de su uso, ya que flujos de 5 mL/min generan un
mayor desgaste de los sellos de los pistones de la bomba, por lo que se
requerirá aconsejablemente de mantenimientos mínimos de seis meses. Por
otro lado, si el último análisis solo involucró solventes y agua, la purga será
menos rigurosa. En todo caso antes de iniciar un nuevo análisis se recomienda
purgar todos los canales con agua.
Los pasos a seguir para la purga son:
1. Asegurarse de lavar e identificar bien los reservorios y filtrar y desgasificar el
agua, solventes y demás fases móviles a emplear. (Ver figuras 3, 4, 5 y 6)
2. Introducir todos los canales en agua, tapando los espacios del reservorio con
papel polimérico para evitar su contaminación con partículas ambientales.
(Ver figura 2)
3. Girar en sentido contrario a las manecillas del reloj la válvula de purga (ver
figura 7) hasta aflojarla, teniendo cuidado de no hacerlo demasiado ya que
se generaría fuga en este caso del agua, sacando al equipo de línea ya que
este cuenta con sensores de fuga en todos los módulos.
4. Se da “clic” en el icono de la bomba, se activan todos los canales en
“Solvents”, se coloca 0% en los canales B, C y D, se coloca flujo de “3” en
“Flow” y se da “OK”. Se purga el canal A por 2.5 minutos. Transcurrido ese
tiempo se coloca 100% en el canal B, se da “OK” y se purga por el mismo
tiempo y así sucesivamente hasta purgar todos los canales. (Ver figura 18).
Luego se coloca flujo de “0” o se apaga la bomba como se indicó en el
numeral “5” de los pasos para puesta en línea del equipo.

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5. Se cierra la válvula de purga y se coloca un recipiente en la tubería de
entrada de la columna, se vuelve a encender la bomba si se apagó sin
colocar flujo de “0” ó se coloca flujo de “3”, de esta forma se lava la tubería
que va desde la bomba hasta la columna. (Ver figura 12). NOTA: en algunos
casos es necesario lavar la celda del detector para lo que se coloca un
puente que reemplaza la columna y se establece un flujo máximo de 0.7
mL/min para no romper dicha celda. Este lavado puede ser con soluciones
de Alcohol isopropílico del 5 al 30% en agua en el caso de presentarse
burbujas de aire en la misma.
6. Se coloca en cada canal la(s) fase(s) móvil(es) y los solventes que se
emplearan en el respectivo análisis y se repiten los pasos 2, 3, 4 y 5,
teniendo en cuenta que no se purgarán nuevamente los canales que se
mantienen en agua, que el paso 5 solo se lleva a cabo para el canal que
contiene el solvente donde fue guardada la columna y que se excluye la
“nota” de este último paso.
5.2.3 Adecuación de columnas
Antes de adecuar la columna se debe consultar cual fue el solvente de
guardado y a continuación se hace lo siguiente:
Con la bomba apagada o con flujo de “0”, colocar la columna como muestra la
figura 12 siempre verificando cual debe ser el sentido del flujo (ver figura 13).
Empezar la adecuación a 100% del solvente de guardado y flujo de 0.2 mL/min.
Progresivamente aumentar el flujo hasta alcanzar el de trabajo. Luego ir
reemplazando el solvente por agua de 10% en 10% hasta alcanzar la
proporción del componente acuoso de la fase móvil. Luego se pueden presentar
los siguientes dos casos:
a. Si la fase móvil no contiene buffers, se pasa inmediatamente a 100% de esta.
b. Si la fase móvil contiene buffers, se reemplaza el agua por la fase móvil
progresivamente de 10% en 10% y luego se pasa a 100% de esta.

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Para lograr que la línea base se mantenga lo más cercana a “0” se hace lo
siguiente:
Monitorear en “Online Plot”. Se da “clic” en “Balance” y el icono modular del
detector se colocará de color amarillo, indicando que está llevando la señal a
“0”, cuando dicho icono se vuelva a colocar verde, se da “clic” en “Adjust” para
hacer visible el “0” del eje “y” (mAU). Para aumentar o disminuir las escalas
tanto del eje “x” como “y” se utilizan las flechas inferiores derecha e izquierda.
(Ver figura 23). NOTA: el tiempo de adecuación de columnas varía entre 1 y 2
horas dependiendo de la naturaleza de la fase móvil, siendo este mayor en el
caso de fases móviles que contienen buffers.
Figura 23. Estabilización de la línea base

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5.2.4 Lavado y guardado de columnas
Después de realizado el análisis se lava la columna con agua y el solvente de
guardado en una proporción 80:20, es decir por un canal agua 80% y el
solvente por otro 20% por un tiempo de 1 hora y se guarda con el solvente
100% por media hora. En caso de análisis con fases móviles que poseen
compuestos jabonosos como el Lauril Sulfato de Sodio, primero se lava durante
media hora con el solvente 100%, ya que si se lava con agua la formación de
espuma dentro de la columna genera sobrepresión del equipo. Después se
continua el lavado y guardado como se indicó en este párrafo. Se puede crear
métodos de lavado que se introducen en la secuencia, para análisis que corren
a horas en las cuales no se puede monitorear el equipo, esto se explicará en los
apartes relacionados a métodos y secuencias. Se desmonta la columna y se
colocan sus respectivos tapones (ver figura 13). Luego se realiza la purga de
tuberías.
NOTA: los procesos de purga de tuberías, adecuación, lavado y guardado de
columnas se realizan utilizando cualquier método, si este no es el método de
análisis no se deben guardar los cambios, pero sí lo es, se guardan los cambios
realizados a este. Esto se explicará en el aparte correspondiente a métodos.
5.3 Creación de métodos y secuencias o series
5.3.1 Creación de métodos
Para crear un método se siguen lo siguientes pasos:
1. En la barra de herramientas se da “clic” en “Method”, luego en “New Method”,
luego nuevamente en “Method” y en “Edit Entire Method”. Se empezarán a
desplegar todas las ventanas correspondientes a informaciones, módulos y
reportes de métodos. (Ver figura 24)

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Figura 24. Creación de un método nuevo
2. En la ventana de “Edit Method” se seleccionan todas las opciones y se da
“clic” en “OK”. (Ver figura 25)
Figura 25. Ventana “Edit Method”

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3. En la ventana de “Method Information” se coloca alguna información que
ayude a identificar al método y se da “clic” en “OK”. (Ver figura 26)
Figura 26. Ventana “Method Information”
4. En la ventana de “Set up Pump” se pueden dar dos casos:
a. Para sistemas isocráticos se establece el flujo, se activa la opción “Stop
Time” y se coloca el tiempo de corrida, se activan los canales a utilizar y
se colocan las proporciones de fase móvil y solvente, si es el caso, a
tiempo “0” y se da “clic” en “OK”. (Ver figura 27-a)
Figura 27-a. Ventana “Set up Pump”. (Sistema isocrático)

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b. Para gradiente de fase móvil se establece el flujo, se activa la opción “Stop
Time” y se coloca el tiempo de corrida, se activan los canales a utilizar y
se colocan las proporciones de las fases móviles a tiempo “0”, se da “clic”
en “Insert” tantas veces como sea necesario para crear la tabla de
gradiente, estableciendo el mismo. En dicha tabla aparecen los canales B,
C y D, por tal razón el porcentaje de A será la diferencia entre 100 y los
porcentajes colocados para los otros canales. Si se comete un error y se
desea eliminar una fila, se selecciona esta dado “clic” al lado izquierdo de
la misma y luego dando “clic” en “Cut”. Solo se coloca el flujo y la presión
máxima la cual tiene como límite 400 bar (se puede establecer una
presión máxima inferior pero esta es la más empleada), en la primera fila
de la tabla. Por último se da “clic” en “OK”. (Ver figuras 27-b y 27-c)
NOTA: Si se va a adecuar la columna después de crear el método de
trabajo, la bomba debe estar apagada.
Figura 27-b. Ventana “Set up Pump”. (Creación de la tabla de gradiente)

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Figura 27-c. Ventana “Set up Pump”. (Corrección de la tabla de gradiente)
5. En la ventana de “Set up Injector” se establece el volumen de inyección y se
da “clic” en “OK”. (Ver figura 28)
Figura 28. Ventana “Set up Injector”

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6. En la ventana de “DAD Signals” se selecciona(n) y establece(n) la(s)
longitud(es) de onda a trabajar y se da “clic” en “OK”. NOTA: este equipo
cuenta con un detector de arreglo de diodos por lo que se pueden visualizar
en la misma corrida, cromatogramas correspondientes a diferentes
longitudes de onda. (Ver figura 29)
Figura 29. Ventana “DAD Signals”
7. En la ventana de “Column Thermostat Method” se establece la temperatura
del horno y se da “clic” en “OK”. (Ver figura 30)
Figura 30. Ventana “Column Thermostat Method”

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8. En la ventana de “Signal Details” se selecciona(n) la(s) longitud(es) de onda
a trabajar, se da “clic” en “Add to Method” y se da “clic” en “OK”. (Ver figuras
31-a y 31-b)
Figura 31-a. Ventana “Signal Details”. (Selección de longitud(es) de onda)
Figura 31-b. Ventana “Signal Details”. (Adición de longitud(es) de onda al método)

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9. En la ventana de “Edit Integration Events” se da “clic” en “OK”. (Ver figura 32)
Figura 32. Ventana “Edit Integration Events”
10. En la ventana de “Specify Report” se seleccionan y establecen los
parámetros que se muestran en la figura 33-a. Con respecto a la opción
“Calculate” se selecciona “ESTD” cuando el recalculo es por estándar
externo, “ISTD” cuando es por estándar interno y “Percent” cuando es por
porcentaje de área, este último empleado en el recalculo de impurezas. Por
otro lado en la opción “Report Style” se especifica el estilo de reporte, por
ejemplo, si se selecciona “Performance”, en el reporte aparecerá el tipo de
columna empleada, los platos teóricos, la simetría y resolución (ver figura 33-
b). Se da “clic” en “Signal Options” y se desplegará la ventana que se
muestra en la figura 33-c, se seleccionan los parámetros que se muestran;
en la opción “Ranges” si se selecciona “Full”, en el reporte se verán los ejes
al máximo dependiendo de la altura del pico y del tiempo de corrida; si se

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selecciona la opción “Use Ranges” se establecen las escalas de acuerdo a la
conveniencia del análisis, esto es muy usado cuando se recalculan
impurezas, ya que la señal de estas al ser más pequeña que la del
compuesto principal no se verían en la escala “full”. En las opciones “Layout”
y “Scale” se establece si se desean ver multiseñales por separado o
superpuestas y si se aplica la misma escala o no a todas las corridas,
respectivamente. Se da “clic” en “OK”, se cierra esta ventana y se vuelve a
dar “clic” en “OK” en la ventana de “Specify Report”.
Figura 33-a. Ventana “Specify Report”

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Figura 33-b. Ventana “Specify Report”. (Estilo de reporte)
Figura 33-c. Ventana “Specify Report”. (Opciones de la señal)

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11. En la ventana de “Instrument Curves” se da “clic” en “OK”. (Ver figura 34)
Figura 34. Ventana “Instrument Curves”
12. En la ventana de “Calibration Settings” en la opción “Tilte” se coloca el
nombre del análisis a realizar; en “Use Sample Data” se selecciona si se
desea trabajar con los datos consignados en la secuencia o si se consignan
manualmente en los espacios para ello (“Multiplier” y “Dilution”) que
aparecen debajo; de igual forma se establecen las unidades, la ventana
(porcentaje de amplitud en eje “x” de lado y lado del tiempo de retención
establecido que ayuda a reconocer el pico de interés) , la señal para la cual
se desea recalcular los picos no recalculados y la corrección o no del
estándar interno, si es el caso. Se da “clic” en “OK”. (Ver figura 35)

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Figura 35. Ventana “Calibration Settings”
13. En la ventana de “Calibration Table” se da “clic” en “Insert” y se desplegará
una ventana donde se coloca el tiempo de retención aproximado del pico de
interés (si se desconoce por completo el tiempo de retención, se coloca
cualquier valor dentro del tiempo de corrida y después de realizar la corrida
de prueba, se corrige este), se da “clic” en “OK” (ver figura 36-a). Luego en la
tabla de calibración se coloca el nombre del(los) compuesto(s) de interés (si
es más de un compuesto se vulve a dar “clic” en “Insert” hasta completar las
filas necesarias), y los factores de calibración de los estándares en la opción
“Amt”. Se da “clic” en “OK”. Si se comete un error y se desea borrar la tabla,
se selecciona esta, dando “clic” a su lado derecho y luego “clic” en “Delete”.
(Ver figura 36-b)

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Figura 36-a. Ventana “Calibration Table”. (Inserción de la tabla)
Figura 36-b. Ventana “Calibration Table”. (Llenado de la tabla)

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14. En la ventana de “Run Time Checklist” se seleccionan las opciones que
aparecen en la figura 37 y se da “clic” en “OK”.
Figura 37. Ventana “Run Time Checklist”
15. Para salvar el método se da “clic” en la opción “Method” de la barra de
herramientas, luego “clic” en “Save Method”, se coloca el nombre del método
nuevo, luego se da “clic” en “Aceptar”; por último se escribe un comentario
acerca del nuevo método y se da “clic” en “OK”. (Ver figuras 38-a, 38-b y 38-
c)
Figura 38-a. Salvado de métodos

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Figura 38-b. Salvado de métodos. (Consignación del nombre)
Figura 38-c. Salvado de métodos. (Consignación del comentario)

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5.3.2 Creación de secuencias
Para crear una secuencia se siguen lo siguientes pasos:
1. En la barra de herramientas se da “clic” en “Sequence”, luego en “New
Sequence”, luego nuevamente en “Sequence” y en “Sequence Table”. (Ver
figura 39)
Figura 39. Creación de una secuencia nueva
2. Se coloca el número de vial, el nombre de muestra o estándar, al colocar el
último se activa el espacio correspondiente a “Sample Info”, donde se
escribe, si se desea, una información acerca del estándar o muestra. (Ver
figura 40)

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Figura 40. “Sequence Table”. (Información del vial y muestra)
3. Se selecciona el método de trabajo. Como se mencionó en el numeral 5.2.4
cuando se debe lavar y guardar columnas a horarios donde no se puede
monitorear el equipo, se crea un método de lavado, que no es más que un
gradiente y se introduce al final de la secuencia. Este método, generalmente
es igual en todo lo demás al método de análisis, es decir solo cambia en la
bomba para el gradiente y el tiempo de corrida, de acuerdo al tiempo que el
operador desee realizar estos procesos. (Ver figura 41)

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Figura 41. “Sequence Table”. (Selección del método)
4. Se establecen las inyecciones por vial y el tipo de muestra, donde “Sample”
es para muestras, “Calibration” para estándares y “Control Sample” para
blancos. (Ver figura 42)
Figura 42. “Sequence Table”. (Inyecciones por vial y selección del tipo de muestra)

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5. Cuando el tipo de muestra es un estándar, en la opción “Update RF” se
coloca “Average” cuando se va a correr la prueba del sistema de idoneidad y
“Replace” cuando se trata de estándares de recalculo, la opción “Update RT”
repetirá automáticamente lo que aparece en “Update RF”. Cuando se trata
de curvas de calibración en la opción “Cal Level” se coloca el nivel de
calibración. (Ver figura 43)
Figura 43. “Sequence Table”. (Calibración)
6. En el caso de muestras se coloca en la opción “Multiplier” el multiplicador, en
“Dilution” el dilutor y en “Inj Volume” el volumen de inyección cuando se
utiliza la misma secuencia para dos tipos de análisis, por ejemplo, una
validación y disolución, es decir, métodos similares pero donde cambia el
volumen de inyección, lo que indica que el volumen de inyección establecido
en la secuencia prima ante el establecido en el método. Se da “clic” en “OK”.
(Ver figura 44)

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Figura 44. “Sequence Table”. (Factores de la muestra y volumen de inyección para métodos
similares pero diferentes tipos de análisis)
7. Para salvar la secuencia, se da “clic” en “Sequence” y luego en “Save
Sequence”, se coloca el nombre de la secuencia (generalmente la fecha de
corrida) y se da “clic” en “Aceptar”. (Ver figuras 45-a y 45-b)
Figura 45-a. “Sequence Table”. (Salvado de secuencia)

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Figura 45-b. “Sequence Table”. (Consignación del nombre)
NOTA: los procesos de purga de tuberías, adecuación, lavado y guardado de
columnas se realizan utilizando cualquier método, si este no es el método de
análisis no se deben guardar los cambios, pero sí lo es, se guardan los cambios
realizados a este. Esto se explicará en el aparte correspondiente a métodos.
5.4 Parámetros de secuencia y salida (resultados)
Para poner a punto la secuencia antes de las corridas cromatográficas, se deben
seguir los siguientes pasos:
5.4.1 Parámetros de secuencia
En la barra de herramientas se da “clic” en “Sequence”, luego en “Sequence
Parameters”. Se establece el nombre del operador, se crea el subdirectorio; en
la opción “Shutdown” se selecciona “Post-Sequence Command/Macro” y se
elige “macro SHUTDOWN.MAC, go”, en el caso de que no se pueda monitorear
el equipo y así este al terminar la secuencia, apagará los módulos principales.
Si el operador desea, en la opción “Wait” se escribe la cantidad de minutos que
el equipo esperará antes de cada inyección. Se escribe un comentario acerca

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de la secuencia y se da “clic” en “OK”; aparecerá un mensaje informando que el
subdirectorio no existe y preguntando que si el operador desea crearlo, a lo cual
se responde afirmativamente. (Ver figuras 46-a y 46-b)
Figura 46-a. “Sequence Parameters”
Figura 46-b. “Sequence Parameters”. (Ajuste de parámetros)

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5.4.2 Ajustes de salida (resultados)
En la barra de herramientas se da “clic” en “Sequence”, luego en “Sequence
Output” (ver figura 47-a). Se seleccionan las opciones que aparecen en la figura
47-b, se da “clic” en “Setup” y se desplegará la ventana “Sequence Summary
Parameters”, se selecciona la opción que aparece en la figura 47-c y se da
“clic” en “OK”. Por último se vuelve a dar “clic” en “OK”.
Figura 47-a. Ajustes de salida
Figura 47-b. Parámetros ajustes de salida

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Figura 47-c. Parámetros ajustes de salida. (Continuación)
5.5 Corridas de prueba y de secuencia
Tal como se indicó en el numeral 5.2.3 se puede adecuar la columna con cualquier
método pero no se deben guardar los cambios. En caso de hacerlo con el método de
análisis se guardan los cambios y en la estabilización de la línea base además de
hacer lo indicado en dicho numeral, también se hace lo siguiente:
En “Online Plot” se da “clic” en “Change” y se desplegará la ventana “Edit Signal Plot”
en la cual se selecciona(n) o remueve(n) la(s) señal(es) que se desea(n) monitorear;
en la ventana se establece un tiempo de monitoreo y se selecciona “draw zero line”
para visualizar el cero de la línea base; en el eje “y” se establece el valor máximo a
visualizar dependiendo del tamaño de la señal del compuesto principal o del
compuesto que se desea apreciar mejor, además se coloca un porcentaje de
compensación para ver la escala por debajo del “0”; se selecciona “Use method
settings”; se da “clic” en “Apply to Method” y finalmente en “OK”. (Ver figura 48-a y 48-
b)

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Figura 48-a. Estabilización de la línea base. (Continuación)
Figura 48-b. Ventana “Edit Signal Plot”

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5.5.1 Corrida de prueba
Para realizar una corrida de prueba se hace lo siguiente:
En la barra de herramientas se da “clic” en “RunControl”, luego en “Sample Info”
y se desplegará la ventana con el mismo nombre, donde se coloca el nombre
del operador, el subdirectorio (que será el mismo establecido en los parámetros
de la secuencia), se escribe un prefijo, la posición del vial donde está el
estándar muestra que se va a correr, el nombre del estándar o muestra y un
comentario acerca del él o ella. Luego se da “clic en “Run Method” (la corrida
empezará inmediatamente) o en “OK” (la corrida no empezará; generalmente se
hace esto cuando aún falta adecuación pero se quiere tener la información
consignada. Para que empiece la corrida se da “clic” en “RunControl” y luego en
“Run Method”). NOTA: las corridas de prueba son muy útiles para establecer
los tiempos de retención reales, los tiempos de corrida ideales, para visualizar
la forma de las señales cromatográficas (“picos”), resoluciones, etc. (Ver figuras
49-a y 49-b)
Figura 49-a. Puesta en marcha de la corrida de prueba

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Figura 49-b. Parámetros para la corrida de prueba
5.5.2 Corrida de secuencia
Una vez que todo esté listo para que el análisis corra, en la barra de
herramientas se da “clic” en “RunControl”, luego en “Run Sequence” o
simplemente en la pantalla principal en “Start”. (Ver figura 50)
Figura 50. Puesta en marcha de la corrida de secuencia

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5.6 Procesamiento de la información
Para el procesamiento de la información se siguen los siguientes pasos:
1. Se da “clic” en “Data Analysis”, luego se selecciona el subdirectorio donde se guardó
toda la información. (Ver figura 51)
Figura 51. Procesamiento de la información. (Selección del subdirectorio)
2. Se da “doble clic” en la secuencia a procesar, luego “doble clic” en una corrida
(generalmente el estándar de recalculo), después en “Integration” y luego se da
“clic” en Edit/Set Integration Events Table”. (Ver figura 52)

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Figura 52. Procesamiento de la información. (Búsqueda de los Eventos de Integración)
3. Se da “clic” en “Zoom in on Window” y se amplía la base de la señal cromatográfica.
Se ajustan los valores de los Eventos de Integración que el software tiene por
default. (Ver figura 53-a)

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Figura 53-a. Ajuste de los Eventos de Integración
4. Se da “clic” en “Add a New Line to the Events Table” para adicionar eventos de
integración e integrar la señal por su base. (Ver figura 53-b)

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Figura 53-b. Ajuste de los Eventos de Integración. (Continuación)
5. Se da “clic” en “Integrate current Chromatogram(s)”, luego en “Cancel Integration
Events Editing” y se salvan los cambios. (Ver figuras 53-c y 53-d)

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Figura 53-c. Ajuste de los Eventos de Integración. (Continuación)
Figura 53-d. Ajuste de los Eventos de Integración. (Continuación)

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6. Se da “clic” en “Calibration”, luego “doble clic” en cada una de las corridas del
Sistema de Idoneidad, se revisa que este haya cumplido; luego se da “doble clic” en
la corrida del estándar de recalculo (si es el caso) y se verifica el factor de
calibración que ya se colocó al crear el método. (Ver figura 54)
Figura 54. Revisión del sistema de idoneidad y recalibración
7. En la barra de herramientas se da “clic” en “Calibration”, luego en “Recalibrate”, se
selecciona “Replace” y finalmente se da “clic” en “OK”. (Ver figuras 55-a y 55-b)

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Figura 55-a. Recalibración
Figura 55-b. Recalibración. (Continuación)
8. Se revisan los ajustes de calibración y se colocan las unidades de la muestra. Se da
“clic” en “OK”. (Ver figuras 56-a y 56-b)

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Figura 56-a. Ajustes de calibración. (Revisión)
Figura 56-b. Ajustes de calibración. (Cambio de unidades)

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9. En la tabla de calibración se verifica el(los) nombre(s) del(los) compuesto(s); se da
doble “clic” sobre cada una de las muestras y se revisan los resultados dando “clic”
en “Identify Peaks, calculate and preview Results”. NOTA: los estándares se
visualizan de igual forma. (Ver figura 57)
Figura 57. Visualización de resultados
10. Si todo en el reporte es correcto, se da “clic” en “Print”, se selecciona el
subdirectorio, se nombra el estándar o muestra, se da “clic” en “Guardar”.
Finalmente se da “clic” en “Close” para abrir la siguiente muestra y se repite el
proceso. (Ver figuras 58-a y 58-b)

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Figura 58-a. Revisión e impresión de resultados

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Figura 58-b. Revisión e impresión de resultados. (Continuación)
6. RECOMENDACIONES
El equipo HPLC marca Agilent, modelo 1200, es un sistema robusto, elaborado para resistir el
uso más no el abuso. Para su uso se recomienda:
1. Leer este procedimiento antes de cualquier manipulación.
2. Recibir la guía de un analista o investigador experimentado.
3. Estar concentrado al momento de su uso.
4. Llenar los formatos y/o registros.
5. No recibir visitas en el laboratorio.
6. No utilizar memorias USB.

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7. SIGLAS
Amt: Amount.
Cal: Calibration
HPLC: High Performance Liquid Chromatography.
Info: Information.
min: minutos.
mL: mililitros.
MSc: Magister en Ciencias.
SST: System Suitability Test.
mAU: miliunidades de absorbancia.
8. BIBLIOGRAFÍA
Quattrocchi, O. A., De Andrizzi, S. A., & Laba, R. F. (1992). Introducción a la HPLC Aplicación
y Práctica. Buenos Aires: Artes Gráficas Farro S.A.

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