El documento introduce los conceptos básicos de la cromatografía, incluyendo que permite la separación de componentes de una mezcla debido a la influencia de una fase estacionaria y una fase móvil. Describe los diferentes tipos de cromatografía según la naturaleza de las fases, e introduce la cromatografía de adsorción, líquido-sólido y en capa fina como ejemplos.

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INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite la separación de los
componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.
a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una
fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un
soporte sólido.
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por
una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.
El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo
de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de
elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que
la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a
distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas
con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la
muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase
estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario
los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con
rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la
muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa
y/o cuantitativamente.

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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se
pueden distinguir distintos tipos de cromatografía
a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la
móvil un líquido.
b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido
anclado a un soporte sólido.
c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no
volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.
d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil
un gas.
Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la
mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.
a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido
polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla
mediante interacciones de tipo polar.

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b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las
diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las
fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.
c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un
sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya
carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la
fase móvil.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar la
concentración en su superficie de otras sustancias. La separación se debe a las
diferencias de adsorción de los componentes de una mezcla sobre la fase
estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran superficie
(adsorbente). La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a la
cromatografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS).
El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica de
los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre moléculas
adsorbidas y el adsorbente han de ser débiles para que su fijación sea reversible,
las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo
o puentes de hidrógeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y
de los solutos han de ser opuestas.
Cromatografía líquido-sólido (CLS).
La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que esta
finamente granulado. La superficie específica contiene centros polares aptos
para la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. Al

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disminuir el tamaño de las partículas, el número de centros activos por unida es
mayor, y la capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente más utilizado
es gel de sílice aunque también se emplea alúmina activada. En el caso del gel
de sílice la interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los
grupos funcionales polares de los compuestos orgánicos.
La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los
componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La
velocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de
la fase móvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el
tiempo la proporción del disolvente más polar.
Propiedades de los disolventes más comunes.
Disolvente Fórmula química
Punto de
ebullición
Constante
dieléctrica
Densidad
Disolventes no polares
Hexano CH3-(CH2)4-CH3 69 °C 2,0 0,655 g/ml
Benceno C6H6 80 °C 2,3 0,879 g/ml
Tolueno C6H5-CH3 111 °C 2,4 0,867 g/ml
Éter dietílico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4,3 0,713 g/ml
Cloroformo CHCl3 61 °C 4,8 1,498 g/ml
Acetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 °C 6,0 0,894 g/ml
Disolventes polares apróticos
1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 °C 2,3 1,033 g/ml

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Tetrahidrofurano (THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 °C 7,5 0,886 g/ml
Diclorometano (DCM) CH2Cl2 40 °C 9,1 1,326 g/ml
Acetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0,786 g/ml
Acetonitrilo (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0,786 g/ml
Dimetilformamida
(DMF)
H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0,944 g/ml
Dimetil sulfóxido
(DMSO)
CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1,092 g/ml
Disolventes polares próticos
Ácido acético CH3-C(=O)OH 118 °C 6,2 1,049 g/ml
n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0,810 g/ml
Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0,785 g/ml
n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0,803 g/ml
Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 24 0,789 g/ml
Metanol CH3-OH 65 °C 33 0,791 g/ml
Ácido fórmico H-C(=O)OH 100 °C 58 1,21 g/ml
Agua H-O-H 100 °C 82 1,000 g
La retención se realiza en base a la competencia que se establece entre el
soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por adsorberse a los
centros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las moléculas de soluto se
adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados
por las moléculas polares presentes en la fase móvil.

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Los tiempos de retención y la selectividad en la separación dependerán de
la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y
la naturaleza de los disolventes que componen la fase móvil (M).
Cromatografía en capa fina.
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,
uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de
vidrio, aluminio u otro soporte. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria
consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el
eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que
los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde
inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil, que
asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes
de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separación. Cuando el
frente del disolvente se encuentra próximo al extremo superior de la placa esta
se saca y se visualiza.
La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por el
disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).
Rf= Distancia recorrida por el compuesto
Distancia recorrida por el disolvente

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La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de
diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se
desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el
hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y
acetato de etilo.
La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicador
fluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la luz
ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz
ultravioleta, la visualización requiere utilizar un agente revelador. El revelador
reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.
Cromatografía preparativa en placa.
La cromatografía preparativa se lleva a cabo en placas de gel de sílice de
1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separación y
aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas
entre 100-200 mg.

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En la superficie del adsorbente (gel de sílice), mediante una pipeta
Pasteur, se traza una línea continua con la muestra disuelta y se introduce la
placa en posición vertical en una cubeta. Durante la elución debe permanecer
tapada para evitar la evaporación del disolvente. Una vez se han separado los
productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del
compuesto a aislar y con ayuda de una espátula se desprende del soporte de
vidrio el gel de sílice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un
erlenmeyer se añade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el
gel de sílice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro.
Chromatotron.

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Cromatografía en columna.
Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico a
escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna
de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un
estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la
fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Los
compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones,
los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace falta
aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un
compuesto de la columna se llama tiempo de retención.
El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel de
sílice, aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La elución de la

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cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión (Flash
chromatography), la diferencia en ambos casos está en el tamaño de las
partículas de gel de sílice (0,063-0,200 nm, sílice de columna, 0,040-0,063 nm,
sílice flash). Debido a que la disminución del tamaño de las partículas de
adsorbente conduce a una separación más eficaz, la cromatografía a media
presión (flash) proporciona mejores resultados, además de ser más rápida.
Las variables que más influyen en la eficacia de la separación en
cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son las
siguientes;
a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura del
adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes
de la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a
separar.
b) Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena
separación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándose
en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en
gradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de
etilo.
Cromatografía en papel.
Es la más sencilla de las técnicas, pero sólo nos dará resultados
cualitativos. Está casi en desuso. El método se basa en un mecanismo de reparto,
y consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extremo de una
tira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en una
cubeta que contenga el disolvente, de manera que éste fluya por la tira por
capilaridad.

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Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira el
papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color
propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los
componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la
elección del disolvente y la del papel de filtro.
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN.
La cromatografía líquido-líquido, también llamada de partición se
caracteriza por emplear una fase estacionaria líquida, anclada a un soporte
sólido, y una fase móvil también líquida. El soporte sólido por lo general es gel
de sílice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase líquida con la
incorporación de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformación
de los grupos silanol (Si-OH) de la gel de sílice en grupos siloxano (Si-O-Si-R),
lo que proporciona una fase líquida estacionaria térmicamente estable y difícil
de hidrolizar en condiciones normales.

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Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de sílice en cromatografía
líquido-líquido.
Funcionalidad Estructura Polaridad Tipo
Diamino -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 Muy alta Normal
Aminopropilo -(CH2)3-NH2 Alta Normal
Nitrilo -(CH2)n-CN Media Normal
Nitro -(CH2)n-NO2 Media Normal
Diol (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH Débil Normal
Dimetilamino -(CH2)3-N(CH3)2 Débil Normal
Propilo -(CH2)2-CH3 Baja Inversa
Fenilo -(CH2)n-Ph Baja Inversa
Octilo -(CH2)7-CH3 Baja Inversa
Octadecilo -(CH2)17-CH3 Muy baja Inversa
La polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en función de la
naturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de sílice, lo que
permite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separación
en la cromatografía líquido-líquido se basa en la diferencia de solubilidad de los
componentes de la mezcla entre las dos fases líquida o en las diferentes
interacciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionales
presentes en la cadena enlazada al gel de sílice. En función de la polaridad de la
fase líquida estacionaria, se distingue entre:
a) Cromatografía en fase normal. La fase estacionaria está constituida por un
líquido de carácter polar. Como fase móvil se emplean mezclas de
disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo,
diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la
separación de compuestos muy polares que quedarían demasiado retenidos
en una cromatografía sólido-líquido. En este tipo de cromatografía el orden
de elución está gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos más
polares quedan más retenidos, igual que en la cromatografía de adsorción.

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b) Cromatografía en fase reversa. La fase estacionaria está constituida por un
líquido de carácter apolar. Como fase móvil se emplean mezclas de agua con
disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fase
móvil más polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separación de
mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una
cromatografía sólido-líquido, y para la separación de compuestos de una
misma serie homóloga. La retención se explica en base a una adsorción
preferencial del disolvente menos polar de la fase móvil a la superficie de las
cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se
establece un mecanismo complejo que supone una combinación de
equilibrios de solubilidad (partición) de la mezcla que se cromatografía entre
la fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil.
La separación ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie
apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares
serán más solubles en la fase estacionaria que los más polares. Por tanto, al
contrario que en la fase normal, los compuestos más polares estarán menos
retenidos que los menos polares. Los tiempos de retención disminuyen
cuando menor sea la proporción de agua, cuando menos polar sea el
disolvente empleado.
Cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía iónica) es un
proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las
propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de
molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y
aminoácidos. La solución que se inyecta es usualmente llamada muestra y los

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componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a
menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad.
La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficie
grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta. Este tipo
de cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambio
catiónico y cromatografía de intercambio aniónico:
La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados
positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional
cargado negativamente (SO3
-
, CO2
-
). Las resinas cuyo grupo funcional activo es
un sulfonato (SO3
-
) se consideran resinas intercambiadoras ácidas fuertes,
mientras que aquéllas cuyo grupo funcional activo es un ión carboxilato (CO2
-
)
se consideran resinas ácidas débiles.
R-A-
H+
+ M+
+ B-
<--> R-A-
M+
+ H+
+ B-
La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando
grupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amonio
cuaternario (R4N+
).
R4-N+
L-
+ M+
+ B-
<--> R4-N+
B-
+ L-
+ M+

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R-H++ M+<--> R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]R
Este tipo de cromatografía se basa en el equilibrio de intercambio iónico
entre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o carboxílicos (para la
separación de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios
(para la separación de aniones) y los iones presentes en la fase móvil. Por
ejemplo, para la separación de cationes se puede utilizar una resina de ácido
débil donde se producirá el siguiente equilibrio:
R-CO2H + M+
 R-CO2M + H+
En este caso, el catión M+
puede ser eluido de la columna por un ácido
fuerte en una concentración capaz de desplazar el equilibrio representado en la
ecuación anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta técnica al estado de

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cromatografía de alta resolución, llamada cromatografía iónica, fue posible a
partir de la década del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienen
los materiales típicos para el intercambio (grupos sulfónicos para cromatografía
catiónica y grupos aminos cuaternario para cromatografía aniónica). Estos
recubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice, vidrio o de algún
polímero que son capaces de soportar las altas presiones comúnmente utilizadas
en cromatografía líquida de alta resolución.
PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
En todo procedimiento en química orgánica reconocemos las etapas que
se muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterización de los
productos orgánicos.
Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificación de
los productos preparados en un proceso sintético en química orgánica
Reactivos Mezcla de reacción
Otros
Productos de reacción
A + B C + D
Purificación Caracterización
Extracción Separación
cromatográfica
Cristalización
Destilación
Pf
Peb
RMN

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Una vez ha concluido la reacción, la mezcla resultante se extrae para
separar los sustratos que nos interesan. A continuación la mezcla obtenida, que
generalmente es el producto de reacción, productos secundarios, reactivos y/o
algo del producto de partida, se separa por cromatografía de columna.
Finalmente los productos, para caracterizarlos correctamente, y por regla
general, requieren de una purificación adicional que se lleva a cabo mediante
otra cromatografía más cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones, según el
caso.
En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prácticas
no se lleva a cabo la separación cromatográfica, aunque sea una operación
necesaria en el trabajo de síntesis, como hemos indicado en párrafos anteriores.
Por esta razón hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un curso
introductoria, de esta manera damos una visión real del trabajo sintético en
química orgánica.
En esta experiencia se propondrá la separación de los componentes de una
mezcla hipotética de reacción por cromatografía de columna. Las mezclas
estarán constituidas realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casos
anteriores, se sugiere tener conocimiento de las características de los sustratos
antes de comenzar.
Las mezclas estarán constituidas por 0.2 g de cada uno de los productos y
antes de proceder a su separación habrá que decidir eluyente más adecuado para
poder desarrollar una separación aceptable.
Procedimiento general
Para el proceso de separación-purificación por cromatografía de columna se

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siguen los siguientes pasos:
A) Se sujeta la columna a un
soporte y se rellena con la fase estacionaria
en forma de papilla o en seco según se nos
indique.
B) Opcionalmente se puede añadir
arena hasta obtener una franja de unos 2-5
mm de espesor, para proteger el frente de la
fase estacionaria.
C) Se deposita la muestra en
disolución o adherida a una pequeña
cantidad de adsorbente sobre la arena,
procurando tener una franja horizontal.
D) Opcionalmente se puede poner
otra franja de arena como la primera o un
poco de lana de vidrio.
E) Añadir la fase móvil con
cuidado por la pared de la columna hasta
llenarla.

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F) Los componentes de la mezcla
deben eluirse manteniendo un flujo continuo
de disolvente.
G) Las fracciones recogidas
deberán analizarse mediante una técnica
cromatográfica analítica: cromatografía de
capa fina para comprobar su contenido y
pureza. Las fracciones que tengan semejante
contenido se juntan en el mismo matraz,
previamente pesado y el disolvente se
elimina en el rotavapor.