Este documento describe diferentes métodos para potenciar pruebas inmunohamatológicas, incluyendo soluciones de baja fuerza iónica, soluciones coloidales, enzimas, policationes y soluciones de baja fuerza iónica, y pruebas en gel. Estos métodos permiten acortar los tiempos de incubación y mejorar la detección de antígenos al aumentar la velocidad de reacción entre anticuerpos y antígenos.

1. Se utilizan para aumentar la velocidad de
reacción entre el anticuerpo y el antígeno, lo que
permite abreviar los tiempos de incubación, o
para actuar sobre ciertas reacciones ,ayudando a
la detección o inactivación de antígenos.

2. • LISS:
– Solución de baja fuerza iónica
• (low ionic strengh solution)
• SOLUCIONES COLOIDALES:
• Albúmina bovina al 22%
• Polietilenglicol (PEG)
• ENZIMAS:
• Papaína
• Fisina, Tripcina
• Bromelina
• POLICATIONES Y SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA:
• LIM/POLYBRENE
POTENCIADORES DE TEST
INMUNOHEMATOLOGICOS
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3. Potencial Z
3

4. 4

5. SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA
(LISS)
• Las composiciones químicas de los preparados
comerciales son muy variadas, es importante
el conocimiento previo de cada uno, a tal
punto que algunos reactivos deben
refrigerarse y otros no e inclusive las fechas
de vencimiento tienen amplias diferencias
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6. SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA
(LISS)
• Existen 2 (dos) técnicas:
a) Preparando las suspensiones globulares en
LISS del 2% al 4%
b) Agregando a la mezcla suero/glóbulos de 2 a
10 gotas de LISS (aditivo)
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7. SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA
(LISS)
La incubación es recomendada hacerla entre los
5 min. y 15 min.
– Pasado los 30 min. o 40 min. el anticuerpo
comienza a eluírse y la prueba declina su potencia
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8. SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA
(LISS)
SUSPENSION GLOBULAR EN LISS LISS ADITIVO
1. Lavar los eritrocitos en LISS
Lavar los eritrocitos en
Solución salina
2. Tirar bien el sobrenadante Igual
3. Resuspenderlos en el LISS (2% a 4%)
Agregar 2 a 10 gotas de LISS
(según fabricante)
4. Agregar 2/3 gotas de suero a investigar Igual
5. Centrifugar y leer Igual
6. Incubar entre 5 y 15 min. a 37º Igual
7. Golpe de centrifuga y leer Igual
8. Lavar 3 veces con solución salina Igual
9. Agregar SAGH igual 8

9. SOLUCIONES DE BAJA FUERZA IONICA
(LISS)
• Formula:
– EDTA Na. .............. 2 gr.
– Dextrosa ............... 1000 cc.
• (Glicina – Hidróxido de Na . – Fosfato de Na. – Cloruro
de Na. – Agua Destilada)
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10. SOLUCIONES COLOIDALES
• Incrementan la constante dieléctrica del
medio esto lleva a la reducción del potencial Z
por comportarse como moléculas bipolares
absorbería iones
• La albúmina bovina y otras soluciones se
comportarían de esta manera (Dextran,
Hemacells)
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11. SOLUCIONES COLOIDALES
• El polietilenglicol (P.E.G.) es un polímero de
alto peso molecular utilizado en la industria
como lubricante o como agente estabilizador
• Los anticuerpos que mejor reaccionan con
PEG/SAGH son los del Sistema Rh y Kell
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12. SOLUCIONES COLOIDALES
ALBUMINA BOVINA AL 22% POLIETILENGLICOL
1.
1 gota suspensión globular (del 2% al 4%) +
2/3 gotas de suero problema
Igual
2. Agregar 1 gota de albúmina Agregar 2 gotas de PEG
3. Incubar de 15 a 30 min. a 37º Incubar 15 min. a 37º
4. Leer buscando aglutinación NO centrifugar
5. Lavar 3 veces con solución salina Igual
6. Agregar 1 gota de SAGH Igual
7. Golpe de centrifuga y leer Igual
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13. ENZIMAS
• El tratamiento enzimático de los hematíes
aumenta la sensibilidad de los tests de
hemaglutinación
– con algunas excepciones
• (cambiaría la accesibilidad al antígeno y los
determinantes antigénicos)
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14. ENZIMAS
Por otro lado disminuyen las cargas negativas de
la superficie del glóbulo rojo por cortar las
proteínas portadoras del ácido siálico
(glicoforinas)
• Aumenta el valor de la constante dieléctrica
de 2 a 3 veces
• Reduce las cargas negativas y reduciría el
potencial Z
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15. ENZIMAS
Existen dos técnicas de acuerdo a las enzimas
utilizadas:
– En una etapa [Bromelina]
– En dos etapas [Tripcina y Ficina]
– La Papaína puede usarse con ambas técnicas
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16. ENZIMAS
EN UNA ETAPA EN DOS ETAPAS
1.
1 gota de suspensión globular (3%) +
2 gotas de suero problema
1 gota de suspensión globular +
2 gotas de enzimas (Tripsina – Ficina)
2. Golpe de centrifuga leer (salino – T°/A) Incubar 30 min. a 37º
3.
Agregar 2 gotas de enzimas
(Bromelina – Papaina)
Lavar 3 veces c/salina –
dejar suspensión al 3%
4. Incubar durante 10 min. a 37º
1 gota de susp. + 2 gotas de suero
problema
5. Golpe de centrifuga y leer Incubar 15 a 30 min. a 37º
6. Lavar con salina 3 veces Leer buscando hemólisis o aglutinación
7. Agregar SAGH Lavar con salina 3 veces
8. Golpe de centrifuga y leer
Agregar SAGH
Golpe de centrifuga y leer
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17. ENZIMAS
• Excelente para:
– Detectar anticuerpos del Sistema Rh.
– Detectar anticuerpos fríos (anti A – B – H – P1) incrementan
su acción y actividad hemolítica así como el anti-Lewis y el
anti-I
– Enzima + SAGH para los anti-Kidd
– Tener en cuenta que los anti-Kell muestran un patrón
variado
– Recordar que al fraccionar el ácido siálico se deterioran los
antígenos: Duffy – M y N – S y s – Lua – Xga – Cha – Rga – Tn
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18. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
• Las soluciones de baja fuerza iónica aumentan la
velocidad de reacción entre el antígeno y el
anticuerpo
• El policatión POLYBRENE
– (bromuro de hexadimetrina) también la protamina y la polimicina
– tienen la particularidad de producir una agregación
reversible e inespecífica de los glóbulos rojos [una
verdadera pseudoaglutinación], que es dispersada
fácilmente con un inactivador
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19. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
• La prueba consta de dos pasos
• Si los eritrocitos fueron sensibilizados en el
primer paso, al agregarle el policatión e
inducir a la agregación inespecífica se va a
poder producir la aglutinación especifica que
no va a poder ser dispersada
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20. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
Este polímero cargado positivamente no es
capaz de agregar a los hematíes poliaglutinantes
u otros que tengan niveles de ácido siálico
reducido
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21. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
1. Lavar los eritrocitos y preparar la suspensión del 1% al 3 %
2. Agregar a la suspensión 2 gotas del suero a estudiar
3. Leer fase salina
4. Agregar a la mezcla 1 ml de L.I.M. (aprox. 20 gotas) – mezclar bien
5. Incubar mínimo 1 min. hasta un máximo de 30 min. a temperatura ambiente
6. Agregar luego 2 gotas de Polybrene
7. Incubar durante 15 seg. mínimo - 1 min. como máximo a T°/A
8. Centrifugar moderadamente
9.
Tirar el sobrenadante –
Resuspender muy suavemente para ver el botón globular agregado
10. Agregar por las paredes del tubo 2 gotas del inactivador
11. Leer con el tubo a 45 grados durante 1 min.
12. Lavar 3 veces con solución de lavado o simplemente con S. Fisiológica
13. Agregar SAGH y leer 21

22. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
FORMULAS:
• L.I.M.
– EDTA Na 2 gr.
– Dextrosa al 5% 1000 ml.
• INACTIVADOR
– Citrato de Na. 0,2 M 60 ml.
– Dextrosa al 5% 40 ml.
• SOLUCION de LAVADO
– Citrato de Na. 0,2 M 50 ml.
– Solución salina normal 950 ml.
(Citrato de Na. 0,2 M = 58,80 gr. + agua c s p = 1000 ml.)
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23. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
• RECOLECCION DE LAS MUESTRAS:
– Se puede utilizar suero o plasma extraído con EDTA –
• en los productos comerciales se puede utilizar plasma citratado
– NO se deben utilizar muestras sacadas con heparina ya
que la heparina es un antagonista y por lo tanto neutraliza
al Polybrene
– Determinadas condiciones del suero o plasma como por
ejemplo:
– hemólisis extrema,
– alta concentración de bilirrubina,
– lipemias extremas,
– altas concentraciones de gammaglobulinas, etc.
• Pueden interferir con la prueba
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24. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
LIMITACIONES DEL METODO:
– La aglutinación causada por un anticuerpo es
frecuentemente mas fuerte en la etapa de
desagregación que en la fase de SAGH
• [con algunos tipos de anticuerpos esta fase puede ser
totalmente negativa aún después de resultados
positivos en la fase de desagregación]
– Otros anticuerpos se optimizan en la fase de SAGH
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25. POLICATIONES Y SOLUCIONES DE
BAJA FUERZA IONICA
LIMITACIONES DEL METODO:
– Algunos anticuerpos especialmente los pertenecientes al
sistema Rh pueden demostrarse mejor con este método
(anti-E)
– Un pequeño porcentaje de anticuerpos (anti-Kell – anti-k –
anti-Le – anti-Bg) reacciona muy débilmente o no lo hace
en comparación con las técnicas salino/SAGH – LISS/SAGH
al cabo de la fase de desagregación.
– En estos casos solos se observan resultados positivos si se
concluye en SAGH
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26. TEST EN GEL
SI OCURRE UNA
AGLUTINACIÓN
(REACCIÓN
Ag./Ac.)
El gel debe separar las
células aglutinadas
de las no
aglutinadas
Quedando las primeras
atrapadas en la
matriz de gel.
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27. TEST EN GEL
27
DSG

28. TEST EN GEL
• Requerimientos de la partículas de gelatina:
1. Deben ser inertes
– (no deben reaccionar con ningún componente de la prueba
– Antisueros – SAGH – etc.)
2. Deben tener un tamaño tal que permitan pasar a
través de las mismas los eritrocitos libres (No
aglutinados) y atrapar a los aglutinados de acuerdo a
la potencia de la reacción.
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29. TEST EN GEL
SEPHADEX ® G100 superfino
– Seco 10 a 40 µm
– Húmedo 25 a 100 µm
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30. TEST EN GEL
30

31. TEST EN GEL
• Los micro-tubos (de 6 a 8) donde se encuentran las esferillas
de gel están contenidos en una tarjeta plástica descartable
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32. TEST EN GEL
Extremo Superior - más ancho –
Cámara de Reacción o incubación
Puede o no contener reactivo
Fase de sensibilización eritrocitaria
Burbuja de aire:
Evita que la mezcla suero/glóbulos tome contacto
anticipadamente con el gel
Tramo Medio - largo y angosto –
Contiene las partículas de gel – permite un contacto
prolongado entre el gel y los eritrocitos durante la
centrifugación
Fondo cónico
En el cual terminan los hematíes que atravesaron el gel
Claro botón = imagen negativa 32

33. TEST EN GEL
PRESENTACIONES BASICAS DE LAS TARJETAS
– NEUTRO:
• Sin antisueros específicos para:
Detección, identificación y titulación de anticuerpos irregulares
Pruebas de compatibilidad
Inversas ABO
Etc.
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34. TEST EN GEL
PRESENTACIONES BASICAS DE LAS TARJETAS
– ESPECIFICAS:
• Con uno o más antisueros para:
• Tipificación de antígenos ABO y Subgrupos del A
• Tipificación Rh. y Fenogenotipo
• Tipificación de otros antígenos de otros sistemas de
grupos sanguíneos
– ANTIGLOBULIMICO:
• Con distintivos reactivos SAGH (Poliespecifico y
monoespecifico)
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35. TEST EN GEL
ESTANDARIZACION DE LAS PRUEBAS
INMUNOHEMATOLOGICAS
– Calibración de las suspensiones globulares (0.8%) y
dispensaciones de sueros (25/50 l) que se realizan
con pipeta electrónica y no a ojo ni con goteros
Pasteur.
– Incubación de tarjetas en incubadores especiales con
temperatura y tiempos fijos.
– Centrifugación entre 70 a 80 g. con centrifuga especial
para tarjetas con tiempo y potencia preestablecidas
(900 RPM durante 10 minutos)
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36. TEST EN GEL
SEMBRADO DE LA PRUEBA
Consideraciones Técnicas:
1. Seguir las indicaciones del fabricante
2. Preparar las suspensiones GR
correctamente 0.8-1%
(evitar el cálculo “ a ojo “ y las mediciones imprecisas)
3. Respetar la relación GR / SUERO
establecida
4. Generalmente la suspensión se realiza en
un medio potenciador
5. Proceder a fase de incubación
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37. TEST EN GEL
INCUBACIÓN Y CENTRIFUGACIÓN
Consideraciones Técnicas:
1. Incubación estandarizada
(incubador provisto)
2. Centrifugación estandarizada
(centrífuga provisto)
3. Temperatura y tiempo
estandarizados, deben respetarse
4. Proceder a fase de lectura
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38. TEST EN GEL
VENTAJAS DEL METODO
• No se necesitan lavar los eritrocitos ni antes ni
durante las pruebas
• Reacciones de aglutinación fácilmente leíbles
patrón de aglutinación 4+ - 3+ - 2+ - 1+
C. M. claro y limpio
estable por más de dos días
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39. TEST EN GEL
4 +
1 +
2 +
3 +
Neg.
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40. TEST EN GEL
VENTAJAS DEL METODO
• Aumento de la sensibilidad y de la especificidad
• Al ser un micrometodo requiere poco volumen
de muestra
Ideal para neonatos que son monitoreados frecuentemente
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41. TEST EN GEL
VENTAJAS DEL METODO
• En la tipificación Rh. no requiere prueba del
D. débil
• Integración en las tarjetas de un tubo
control
• Minimiza al máximo los falsos positivos y falsos
negativos
• El fenómeno rouleux no causa discrepancias
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42. TEST EN GEL
VENTAJAS DEL METODO
• Incrementan el nivel de bioseguridad
• Reducción de tiempo
• Disminuye errores en los rótulos
• Se reduce la necesaria destreza, habilidad o
experiencia del operador ya que el entrenamiento
se logra en breve tiempo
• Resultados fácilmente documentados
• Automatización.
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43. TEST EN GEL
DESVENTAJAS DEL METODO
• Los tiempos de incubación y centrifugación para
el ABO son largos
Desaconsejado en emergencias
Desaconsejado para la investigación de anticuerpo tipo
IgM.
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44. TEST EN GEL
Preparación de eritrocitos:
1. El diluyente debe alcanzar la
temperatura ambiente antes de
usar
2. Pipetear 1ml. de ID-diluyente en
un tubo limpio
3. Añadir 10 µl de eritrocitos
concentrados o 20 µl
directamente del segmento de
tubuladura y agitar suavemente
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45. TEST EN GEL
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46. Prueba de compatibilidad
(Tarjeta LISS/COOMBS)
1. Pipetear 50 µl de la suspensión
de eritrocitos
2. Añadir 25 µl del plasma o suero
del paciente en cada microtubo
3. Incubar la tarjeta 15 minutos a
37°
4. Centrifugar durante 10 minutos
5. Leer y registrar
TEST EN GEL
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47. 4 - 4 - - -
TEST EN GEL
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48. TEST EN GEL
48

49. TEST EN GEL
49

50. TEST EN GEL
50

51. Sistema automatizado para
inmunohematología
51

52. WADIANA
52

53. WADIANA
53

54. 54