Manual de bioquimica

MANUAL DE BIOQUÍMICA – INGENIERÍA AMBIENTAL
1

Manual de prácticas de

Ingeniería Ambiental
Editor: Rodolfo Álvarez Manzo

2

Cuantificación de clorofila α.
Aislamiento de isoprenoides naturales
Determinación de carbohidratos por el método
de la antrona.
Identificación de aminoácidos mediante
cromatografía en papel.
Separación de aminoácidos por electroforesis
sobre papel.
Aislamiento y determinación aproximada del
punto isoeléctrico de la caseína.
Actividad enzimática: ensayos con la α-
amilasa
Número de saponificación y cálculo del peso
molecular promedio de una grasa.
Aislamiento de colesterol de tejido cerebral.
Índice de yodo de una muestra de aceite.
C
O
N
T
E
N
I
D
O

3

• Se dividirá en tres periodos de evaluación; la calificación final
corresponderá con el promedio algebraico de lo que en cada uno de ellos
hayas obtenido.
• La calificación de cada periodo se calcula mediante la siguiente suma:
Promedio de las calificaciones de los diagramas de prelaboratorio de las
prácticas realizadas en ese periodo × 0.1.
Promedio de las calificaciones de los informes de postlaboratorio de las
prácticas realizadas en ese periodo × 0.4.
La calificación del examen del periodo × 0.5.
• Deberá tenerse una calificación final igual o superior a 6 para acreditar la
parte experimental y, como mínimo, dos exámenes parciales con una
calificación igual o superior a 6.
• Los diagramas de prelaboratorio serán a mano, individuales y en ellos
reproducirás la metodología experimental de esa práctica, ya sea como un
diagrama de bloques, con figuras, etc. El mismo deberá estar colocado en
un lugar visible a lo largo de la práctica. Es individual y se te podrá requerir
en cualquier momento de la sesión; se podrá solicitar asimismo un solo
diagrama para calificar con él a todo el equipo, indicando el profesor el de
qué persona será el evaluado. Se entrega el mismo día en el que se lleva a
cabo la práctica.
• El informe de postlaboratorio, también a mano y por equipo, deberá llevar el
nombre de los autores, número y nombre de la práctica, resultados
obtenidos y discusión de los mismos, conclusiones (ideas principales que
se extrajeron de la realización de la práctica) y bibliografía de una fuente
impresa. EN LAS CONCLUSIONES NO SE DISCUTEN RESULTADOS. Se
entregará un informe por equipo a los ocho días de concluida la práctica.
• No está permitido jugar, correr, comer, beber, usar aparatos electrónicos,
salir sin permiso, usar pelo largo sin amarrar, recibir visitas ni usar zapatos
altos o descubiertos. Deberán usar bata de algodón, lentes de seguridad y
guantes, según sea el caso.
• Por la naturaleza de las prácticas y el tiempo destinado a cada sesión, sólo
se observará una tolerancia de 10 minutos para iniciar las actividades.
Luego de ello, no se permitirá el ingreso de ningún estudiante.

4

• Bibliografía
Las prácticas de este manual están adaptadas de algunos protocolos que
aparecen en los siguientes dos textos, a disposición del público en general
en la biblioteca de la División de Estudios Profesionales de la Facultad de
Química de la Universidad Nacional Autónoma de México.
DAVID T. PLUMMER. An introduction
to practical biochemistry. 3ª. Ed.
McGraw-Hill Book Company. Gran
Bretaña, 1987.
S. K.SAWHNEY, R. SINGH.
Introductory practical biochemistry.
Alpha Science international Ltd.
Reino Unido, 2006.
Para fundamentar tus prácticas puedes consultar el archivo de textos sobre
bioquímica existente en la biblioteca Dr. Manuel de Jesús Álvarez Campos,
de la Universidad la Salle. Entre otros, puedes extraer información del
siguiente libro:
R. K. MURRAY, D. A. BENDER, K. M.
BOTHAM, P. J. KENNELLY, V. W. RODWELL,
P. A. WEIL. Harper Bioquímica Ilustrada.
28ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana
Editores, S. A. de C. V. México, 2010.

5

ASÍ SÍ
Se usan bata cerrada, lentes de seguridad y
pantalones.
Se usan zapatos bajos de piel y cerrados.
Se usa el pelo recogido y, cuando sea
necesario, se usarán guantes.
ASÍ NO
No se ingieren bebidas ni se enciende fuego
dentro del laboratorio.
Tampoco se usa
falda ni zapatos
descubiertos
(sandalias).
No se ingieren
alimentos ni se usa el
pelo suelto.
No se usan jamás zapatos de tacón.

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MANUAL DE
PRÁCTICAS
DE
BIOQUÍMICA
INGENIERÍA
AMBIENTAL

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UNIVERSIDAD LA SALLE, A.C.
Facultad de Ciencias Químicas
Materia: Bioquímica Clave: BI050508
Practica No. 1
Cuantificación de clorofila α.
Carrera: Ingeniería
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Rodolfo Álvarez Manzo
Revisada y Aprobada
por: ADALBERTO
JURADO HERNÁNDEZ
Substituye a: Versión
2013
Próxima revisión: 2017
Investigar si las plantas poseen un contenido diferente de las clorofilas α y β en
función del estés de su medio.
• Hojas de hortalizas y de
plantas frescas teóricamente
estresadas
• Mortero con pistilo
• Papel filtro
• Embudo de vidrio de tallo corto
• Espectrofotómetro de UV-
visible
• Matraz Kitazato con manguera
para vacío
• Tres matraces aforados de 10
mL
• 1 pipeta de 10 mL con jeringa
y manguera
• 15 mL de acetona (por
muestra)
Cada equipo trabajará con dos muestras de hojas, una de ellas que se
supone ha recibido atención nutricional y crecimiento adecuado y otra que se
supone ha sido expuesta a ambientes de estrés físico o químico, a ser posible
infectadas o dañadas.
Macera en un mortero una muestra de hoja (100 mg, sin incluir tallos) en 10
mL de acetona-agua 4:1 vol a vol. La muestra presentará turbidez debido a las
proteínas desnaturalizadas y las fibras de paredes celulares presentes, por lo que
posiblemente será necesario que filtres en un embudo de vidrio para producir una
solución ópticamente limpia. Ajusta el volumen final a 10 mL con un matraz
aforado. Lee la absorbancia a 652 nm. Determina la concentración de clorofila α y,
considerando el valor de ε para la clorofila α de 34.5 mg-1
· mL· cm-1
y las
siguientes ecuaciones:

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mg de clorofila α en el extracto = A652 × 10 mL / 34.5 °
Tomado de Prácticas de Bioquímica. Departamento de Química y Ciencia de los Materiales. Área
de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias Experimentales. Universidad de Huelva.
Huelva, España.
1. ¿Cuál es la labor que
desempeña una clorofila en
las plantas?
2. ¿Por qué se emplea acetona
al 80% en vez de agua o
acetona puras?
3. ¿Qué enuncia la Ley de
Lambert-Beer?
4. ¿Qué color corresponde a los
663 nm? ¿Por qué no se usa
para las lecturas luz verde
(550 nm)?
5. ¿Existe algún problema al
emplear acetona para realizar
estas mediciones en el equipo
de UV? Investiga los máximos
de absorción de este
disolvente e indica cuáles son
las transiciones electrónicas
involucradas.
Espectro del visible de la clorofila α. Fuente:
http://cienciasdejoseleg.blogspot.mx/2013/08/
los-colores-que-absorbe-y-refleja-la.html
ASPECTO DE LAS SOLUCIONES DE CLOROFILA.

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Practica No. 2
Aislamiento de isoprenoides naturales.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
por: Adalberto Jurado
Hernández
2013
Aislar y caracterizar espectroscópicamente β-caroteno y licopeno de dos muestras
vegetales basándote en criterios experimentales a los criterios experimentales
establecidos en asignaturas anteriores y en las características propias de estos
lípidos antioxidantes descritas en la literatura.
• 30 g de muestra vegetal fresca
de zanahoria y jitomate
• 2 matraces Erlenmeyer de 250
mL
• 1 varilla de vidrio
• Algodón
• Papel filtro
• 1 matraz Kitasato con
manguera
• 1 embudo Büchner con
empaque
• 1 embudo de separación de
250 mL
• 1 embudo de vidrio
• 1 recipiente de peltre
• 1 parrilla
• Capilares
• Cromatoplacas
• 2 frascos limpios de Gerber
con tapa
• 1 bisturí
• 1 soporte universal
• 1 pinza de tres dedos con nuez
• 1 rotavapor
• 1 regla
• 1 lápiz
• 100 mL de etanol
• 75 mL de diclorometano
• 20 mL de hexano
• 25 mL de acetato de etilo
• 1.5 g de sulfato de sodio
anhidro
• 2 g de cloruro de sodio

10

• Extracto congelado de β-
caroteno o licopeno
• Algodón desengrasado
• Capilares
• Cromatoplacas
• 1 bisturí
• 1 regla
• 1 lápiz
• 1 frasco para cromatografía
• 1 espátula
• 10 tubos de ensayo de 20 mL
de capacidad
• 1 gradilla para estos tubos
• 1 columna cromatográfica
• 2 pinzas de tres dedos con
nuez
• 1 embudo de tallo corto
• 1 vaso de precipitados de 150
mL
• 1 embudo de vidrio
• 1 cápsula de porcelana
• 1 varilla de vidrio
• 1 bomba de vacío
• 1 probeta de 100 mL
• 1 matraz Erlenmeyer de 500
mL
• Gel de sílice para
cromatografía en columna
• 200 mL de acetato de etilo
• 200 mL de hexano
En un Erlenmeyer seco de 250 mL
coloca 30 g. de tejido fresco de zanahoria o
jitomate finamente dividido. Añade un volumen
suficiente de etanol al 95% para recubrir la
muestra y calienta a ebullición en baño maría
durante 5 minutos. Filtra en caliente con un
algodón, procurando que la masa semisólida
quede libre del disolvente. Con este
tratamiento lograrás que la muestra se
deshidrate.
Coloca la masa semisólida en otro
matraz Erlenmeyer de 250 mL y adiciona el
volumen suficiente de diclorometano en una
campana de extracción para cubrirla. Agita
con una varilla de vidrio hasta que el
disolvente extraiga los carotenoides y se filtra en un embudo de vidrio. Adiciona al
filtrado sulfato de sodio para retirar la turbidez hasta donde sea posible (la turbidez
puede persistir debido a la presencia de sales) y concéntrala al vacío en un
rotavapor hasta un volumen aproximado de 5 mL. Al extracto concentrado de
EXTRACTO DE β-CAROTENO EN CH2Cl2

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carotenoides se le practican entonces análisis en placas cromatográficas con las
siguientes mezclas de disolventes
Hexano 100 %
Hexano/Acetato de Etilo 0.2 mL/9.8 mL
Hexano/Acetato de Etilo 0.5 mL/9.5 mL
Hexano/Acetato de Etilo 1 mL/9 mL v/v
para determinar el mejor disolvente para la
separación en columna. La selección de la
mezcla se basará en el Rf de la mancha
que cada equipo considere que podría
corresponder con el β-caroteno en el caso
de la zanahoria y el licopeno en el caso del
jitomate (una guía podría ser la coloración
color amarillo-naranja de estos compuestos y
que en placa, teóricamente, sería abundante;
el Rf de dicho compuesto debe ajustarse a
0.3). Guarda el extracto en un frasco Gerber
con tapa en el congelador, ya que con él
trabajarás la siguiente semana.
A los ocho días adicionarás al extracto la mínima cantidad de diclorometano
para disolverlo en una cápsula de porcelana y le adicionarás gel de sílice para
cromatografía en columna; agitarás esta mezcla con la ayuda de una espátula y
soplarás cuidadosamente sobre ella para ayudar a evaporar el diclorometano.
Realiza esta operación en la campana de extracción de gases evitando en todo
momento respirar el polvo de la gel de sílice. La cantidad de ésta que adicionarás
será la mínima con la que, una vez evaporado el diclorometano, te permita
reobtener la sílice con su textura original, sin formar grumos. De no ocurrir esto,
adiciona un poco de más sílice y unas gotas de diclorometano, vuelve a agitar
para obtener una mezcla homogénea y evapora el disolvente como lo hiciste
antes. Es importante insistir que no debe haber grumos en la muestra de gel de
sílice.
Monta entonces una columna cromatográfica colocando algodón
desengrasado en la parte de abajo (el algodón se desengrasa insertando en el
fondo de la columna un poco de este material y vertiendo sobre él 5 mL de
hexano). A continuación adiciona la gel de sílice suficiente para llegar a 10 cm de
altura, vacía la sílice en un vaso de precipitados de 150 mL, adiciona 100 mL del
eluyente seleccionado, agita con una varilla de vidrio hasta obtener una
suspensión homogénea sin burbujas de aire y readiciona a la columna el gel de
sílice así suspendido con la ayuda de un embudo. Cuando el nivel del eluyente
haya bajado hasta quedar a unos 5 mm del nivel de la sílice adiciona ESTANDO
EL EMBUDO DE VIDRIO SECO la muestra del carotenoide adsorbido en la sílice
a la columna y un poco de más disolvente; permite que el disolvente baje
nuevamente y, faltando otra vez unos mm, adiciona más disolvente. Comienza así
EXTRACTO DE LICOPENO EN CH2Cl2

12

a colectar fracciones de 10 mL cada una sin permitir que la columna se seque.
Identifica la fracción en la que esté presente el componente seleccionado la sesión
anterior en mayor proporción y determina los máximos en su espectro de UV-
visible en el intervalo de 350 a 550 nm. Caracterízalo conforme a los espectros
que se incluyen en la sección de “Material Adicional”.
1. ¿Qué es un carotenoide?
2. ¿Cuál es la estructura del β-caroteno y el licopeno?
3. ¿Por qué el etanol no puede extraer a los carotenoides pero el
diclorometano sí?
4. ¿Por qué es importante que no haya burbujas en el lecho de la columna
cromatográfica?
5. Fundamento de las técnicas cromatográficas de separación.
• Espectros de absorción del licopeno y el β-caroteno.

13

Fuente: http://cromatografialiquida.com.br/carotespec.htm
• Absrociones del β-caroteno: 465 y 490 nm. Fuente: Kriško, A. et al. “Analysis of β-carotene
absorbance for studying structural properties of human plasma low-density lipoproteins”.
Analytical biochemistry. 2004, 331, pp. 177-182.
• Absorciones del licopeno: 443, 471 y 502 nm. Fuente:
http://en.wikipedia.org/wiki/Lycopene_%28data_page%29#Spectral_data.

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Practica No. 3
Determinación de carbohidratos por el método de
la antrona.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Determinar el contenido de azúcares de una muestra vegetal mediante la
formación de un derivado.
• 1 racimo de uvas
• 64 mg de antrona
• 32 mL de ácido sulfúrico
• 0.5 g de glucosa
• Espectrómetro de UV-visible
• 8 tubos de ensaye con 8
canicas para taparlos
• 3 matraces aforados de 100
mL
• 5 matraces aforados de 50 mL
• 3 pipetas graduadas de 10 mL
• 1 pipeta graduada de 1 mL
• 1 espátula
• 1 vaso de precipitados de de
400 mL
Prepara cinco soluciones de glucosa en agua destilada con concentraciones de 10
g/L (solución b), 25 g/L (solución c), 50 g/L (solución d), 75 g/L (solución e) y 100
g/L (solución f). La solución a será el blanco, constituido por agua destilada. Por
otro lado, en un pequeño mortero aplasta unas cuantas uvas para obtener 1 mL de
su mosto; diluye éste hasta obtener dos soluciones cuya concentración sea 1 a
10000 (solución g) y 1 a 20000 (solución h). A continuación, adiciona
cuidadosamente en sendos tubos de ensayo 4 mL del reactivo de antrona frío (64
mg de esta sustancia en 32 mL de ácido sulfúrico concentrado) a 1 mL de las
soluciones a – h en un baño de hielo; cuando se haya estabilizado la temperatura
colócalos en un baño de agua hirviendo y calienta durante 12 minutos tapándolos
con una canica para prevenir la evaporación de agua. Enfría a temperatura
ambiente los ocho tubos y lee su absorbancia en el espectrofotómetro a 620 nm.
Con los tubos a-f construye una curva patrón con la que puedas determinar la

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concentración de los tubos con las muestra problema y, de allí, la concentración
de glucosa en el jugo de uva con desviación estándar.
1. ¿De qué manera reacciona la antrona con los azúcares?
2. ¿Por qué es necesaria la presencia de ácido sulfúrico en la reacción?
3. ¿Qué es la Ley de Lambert-Beer?
4. ¿Por qué el producto de la reacción posee color?
f
100 mL
f
100 mL
f
100 mL
e
50 mL
37.5 mL
f
100 mL
c
50 mL
16.7 mL
f
100 mL
b
50 mL
10 mL
f
100 mL
d
50 mL
25 mL
100 g/L
10 g/L 40 g/L 75 g/L 25 g/L
f
100 mL
f
100 mL
1 a 100
f
100 mL
f
100 mL
1 a 10000
1 mL
f
100 mL
b
50 mL
25 mL
1 mL de
mosto de
uva
10 g de
glucosa
Diagrama para la preparación de las soluciones.

16

Materia: Química Orgánica II Clave: BI050508
Practica No. 4
Identificación de aminoácidos mediante
cromatografía en papel.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Conocer uno de los métodos de identificación clásicos de los α-aminoácidos y
aplicarlo en una muestra personal.
• 1 cámara cromatográfica
• 3 tubos capilares
• 2 placas de papel Whatman
cromatográfico del No. 1 de 5
cm por 5 cm
• Mezcla de butanol/ácido
acético glacial/agua 60:15:25
v/v (eluyente)
• Revelador de ninhidrina (0.2 g
en 100 mL de acetona). Se
prepara justo antes de usarla.
• 6 estándares de aminoácidos
(30 mg de ácido aspártico,
treonina, leucina, prolina y
triptófano en 3 mL de etanol).
• Prepara pequeños volúmenes
de 10 g/L en isopropanol en
agua (1:9 v/v).
• 1 par de guantes por persona
• 1 pinzas de disección
Realiza una cromatografía en capa delgada con sobre el papel Whatman del No. 1
de las cinco soluciones de aminoácidos que se te proporcionarán y de una mezcla
problema (emplea para ello el eluyente de butanol-ácido acético-agua). Luego de
que el eluyente ha ascendido por la placa en su totalidad, espera a que la placa se
seque (puedes calentar ligeramente en la parrilla) e imprégnala cuidadosamente
en su totalidad por la parte trasera con la solución de ninhidrina usando una
brocha, Vuelve a esperar a que se seque la placa, colócala sobre un vidrio de reloj
y revélala a 105 °C durante 2-3 minutos.

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Realiza una segunda cromatoplaca en la que ahora, como muestra, impregnarás
la punta del dedo meñique.
Toma una foto a tus placas e indica en la primera de ellas qué aminoácidos se
encuentran presentes y en la segunda si es posible identificar a alguno de ellos.
¿Cuál es la reacción que tiene lugar entre la ninhidrina y los α-aminoácidos?
¡Cuál es la estructura de los aminoácidos que se utilizarán en esta práctica?
¿De qué color revelan los aminoácidos al reaccionar con la ninhidrina?
¿En qué consiste una cromatografía de capa delgada?
¿Cuál es el mecanismo a partir del cual se separan sustancias en cromatografía?

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Practica No. 5
Separación de aminoácidos por electroforesis
sobre papel.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Conocer uno de los métodos instrumentales más importantes para la separación
de mezclas de α-aminoácidos.
• 1 aparato de electroforesis horizontal
• Fuente de poder
• Ácido aspártico, histidina, lisina y una mezcla de todos ellos en una solución
amortiguadora de tris-acetato conteniendo 10 g/L de glucosa
• Buffer de tris-acetato (0.07 moles/L, pH = 7.6)
• Revelador de ninhidrina (0.2 g en 100 mL de acetona). Se prepara justo
antes de usarla.
• Tiras de papel (10 cm x 2.5 cm).
• Reactivo de anilina-difenilamina.
• Solución amortiguadora de citrato (0.07 moles/L, pH = 3.0).
• 1 par de guantes por persona.
• 1 pinzas de disección
Es importante que bajo ninguna circunstancia, en ningún momento, toques
el papel con los dedos desnudos. Deberás manejar en cualquiera de las
manipulaciones guantes.
Deberás preparar 1 L de una solución amortiguadora de tris-acetato con
una concentración de tris de 0.07 moles/L. Para ello, pesa 8.48 g de tris, afora con
agua destilada a 1 L y ajusta a pH = 7.6 con ácido acético. El tris es el
tris[hidroximetil]aminometano, H2N-C(CH2OH)3.

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Llena al mismo nivel cada uno de los compartimentos de los electrodos con
la solución amortiguadora de tris-acetato recién preparada. Cuidadosamente
aplica un punto de aplicación de la mezcla de aminoácidos a una de las tiras de
papel, evitando por todos los medios llegar al borde. Coloca una aplicación de
cada uno de los aminoácidos puros por separado en cada una de las restantes
tiras, humedécelas sumergiendo sus extremos en la solución amortiguadora hasta
unos cuantos centímetros del punto de aplicación, sumerge los extremos en cada
electrodo y permite que por capilaridad la tira se humedezca por completo.
Cuando esto ocurra, inmediatamente enciende el equipo. Corre la electroforesis
durante 1.5 horas a 8 V/cm. Remueve las tiras y revélalas con ninhidrina. Analiza
los resultados en función de la carga de los aminoácidos al pH impuesto.
• ¿Qué es la electroforesis y cuál es su fundamento?
• ¿Por qué es posible separar mezclas de α-aminoácidos por electroforesis?
• ¿Por qué debe imponerse un pH cuidadosamente controlado durante todo
el experimento?

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Practica No. 6
Aislamiento de caseína de la leche.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Conocer la técnica de aislamiento de proteínas basada en la manipulación de las
condiciones del medio para alcanzar el punto isoeléctrico.
• 1 matraz Erlenmeyer de 500
mL
• 70 mL de etanol al 96 %
• 90 mL de éter
• 1 embudo Büchner con
empaque de hule
• Papel filtro
• 1 matraz Kitasato con
manguera para vacío
• 1 soporte universal
• 1 pinzas de tres dedos con
nuez
• 1 medidor de pH9 tubos de
ensayo
• 2 pipetas de 10 mL
• 8 propipetas
• 1 medidor de pH
• 100 mL de leche
• 100 mL de solución
amortiguadora de acetato de
sodio (0.2 moles/L, pH = 4.6).
• 10 mL de solución de ácido
acético 0.01 M
acético 0.1 M
acético 1 M
• Solución de acetato de sodio
0.1 M
Calienta a 38 °C 150 mL de agua destilada, añade 50 mL de leche y, a
continuación, adiciona gota a gota y con agitación ácido acético 1 M hasta que
observes la formación de un precipitado. Filtra el precipitado al vacío y lávalo con

21

20 mL de etanol primero y luego 20 mL de éter. Seca y determina la relación del
material recuperado en términos de mg de caseína/mL de leche.
A continuación, prepara diez tubos de ensayo a los que adicionarás lo que
se indica en la siguiente tabla:
Tubo
CH3CO2H
0.1 M
CH3CO2H
0.1 M
CH3CO2H
0.01 M
pH
resultante
(aprox)
Caseina en
CH3CO2H 1 M
1 0.5 mL 9.5 mL 3.2 1 mL
2 1 mL 9 mL 3.6 1 mL
3 1.5 mL 8.5 mL 3.8 1 mL
4 2 mL 8 mL 4 1 mL
5 3 mL 7 mL 4.2 1 mL
6 4 mL 6 mL 4.5 1 mL
7 6 mL 4 mL 4.7 1 mL
8 8 mL 2 mL 5.1 1 mL
9 6 mL 4 mL 5.5 1 mL
10 8 mL 2 mL 6.1 1 mL
Anota todo que observes después de mezclar las soluciones. Mide el pH de cada
solución y determinar el punto isoeléctrico aproximado de la caseina.
• ¿Qué función tiene la solución amortiguadora de acetato?
• ¿Por qué se usa tela de muselina y no papel al momento de realizar las
filtraciones de la caseína?
• ¿Qué es el punto isoeléctrico?
• ¿Cual es el punto isoeléctrico de la caseína reportado en la literatura?
• ¿Por qué la caseína precipitó en más de un tubo?

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Practica No. 7
Actividad enzimática: ensayos con la α-amilasa.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Verificar experimentalmente el comportamiento de una enzima sometida a
diferentes medios ideales y estresantes..
1 mortero con pistilo
4 vidrios de reloj
4 vasos de precipitados de 250 mL
1 agitador
4 tubos de ensayo
1 gradilla
1 pipeta de 1 mL
1 pipeta de 10 mL
1 termómetro
1 mechero Bunsen
1 soporte universal completo
Papel filtro
5 cajas de Petri
Solución de Lugol
1 papa
50 semillas de trigo
Arena
Germina en casa 50 semillas de trigo distribuidas en 5 cajas Petri colocándolas
sobre papel filtro húmedo durante 72 horas previo al inicio de la práctica. Durante
ese tiempo las plántulas deben haber alcanzado los 0.5 cm de largo
aproximadamente.

23

Tritura las semillas germinadas en un mortero con un poco de arena húmeda.
Agrega a la mezcla anterior un volumen de agua aproximadamente de cuatro
veces el de la mezcla, deja reposar durante 100 minutos y filtra. Éste será el
extracto crudo de α-amilasa (ECA). Toma la mitad del volumen de este extracto y
caliéntalo durante 3 minutos en un baño de agua hirviendo y permite que
posteriormente alcance la temperatura ambiente. Este será el extracto crudo de α-
amilasa estresado por calor (ECAec).
Prepara también un sol de almidón (sol) como sigue: tritura en un mortero 1
g de papa con 10 mL de agua y agrega a continuación esta mezcla a 100 mL de
agua hirviendo EN ESE ORDEN. Permite entonces que la solución se enfríe.
Por otra parte, un integrante del equipo deberá enjuagar su boca
generosamente con agua para remover cualquier residuo de comida. Colecta en
dos tubos de ensayo 1 mL de saliva. A continuación calienta la muestra del tubo 2
en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos y permite que esta mezcla
alcance la temperatura ambiente. De esta manera habrás preparado una muestra
de saliva (SAL) y una muestra de saliva estresada por el calor (SALec).
Con todas estas preparaciones ya listas, numera nueve tubos de ensayo
como se te indica en la siguiente tabla y adiciona, en el orden que se te indica, (no
olvidando adicionar al final de la secuencia indicada a todos los tubos 3 gotas de
lugol y observar lo que acontece):
► Tubos 1 a 4: (1) adiciona los mL de la solución de ECA, ECAec, SAL o
SALec, según corresponda; (2) adiciona los mL del sol del almidón; (3)
permite que los tubos reposen 5 minutos.
► Tubos 5 a 8: (1) adiciona los mL de la solución de ECA o SAL; (2) adiciona
los mL de las soluciones de HCl o NaOH, según corresponda; (3) permite
que los tubos reposen 5 minutos; (4) adiciona la cantidad indicada de sol
del almidón; (5) permite que los tubos reposen 5 minutos adicionales.
► Tubo 9: es el testigo de los tubos 1 – 8. Adiciona los mL del sol de almidón
indicados.
► Tubos 10 y 11: son los testigos de los medios ácidos (tubos 5 y 7) y
básicos (tubos 6 y 8). (1) Adiciona los mL del sol de almidón indicados; (2)

24

adiciona las soluciones de HCl y NaOH; (3) permite que los tubos reposen 5
minutos.
Tubo mL de ECA mL de ECAec mL de sol mL de SAL mL de SALec mL HCl conc.
mL NaOH
conc
1 5 5
2 5 5
3 1 1
4 1 1
5 5 5 5
6 5 5 5
7 5 1 5
8 5 1 5
9 5
10 5 5
11 5 5
• Describe la función y reactividad química bioquímica de la α-amilasa.
• Define lo que es un sustrato enzimático.
• ¿Cuál es el papel del lugol en esta práctica?
• ¿Qué otros reactivos podrían emplearse para valorar la actividad de la α-
amilasa en sustitución del lugol?
• ¿Qué acontece con la α-amilasa al emplear los medios de pH extremos y el
calor?

25

Practica No. 8
Número de saponificación y cálculo del peso
molecular promedio de una grasa.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Verificar experimentalmente el comportamiento de una enzima sometida a
diferentes medios ideales y estresantes..

En un vaso de precipitados de 4 L hierve 2 L de agua durante 20 minutos. Luego
de ello vierte en botellas con tapa de rosca metálica y séllalas con cera de una
vela.
Pesa 1 g de carbonato de sodio y 3 g de ftalato ácido de potasio (KHP) en sendas
cápsulas de porcelana y colócalos en una estufa a 120 °C durante 2 h previo al
inicio de la práctica.
Retira de la estufa el carbonato de sodio seco y el KHP y, cuidadosamente,
colócalos en cápsulas de porcelana secas a temperatura ambiente. Pesa 2.522 g
(10 mmoles) de KHP y 0.530 g (10 mmoles) de carbonato de potasio, añádelos a
sendos matraces Erlenmeyer de 250 mL, adiciona 100 mL del agua destilada
hervida, disuelve los estándares y adiciona dos gotas de solución indicadora de
fenolftaleína a cada matraz.

26

Prepara 50 mL de una solución de KOH idealmente a 0.5 M adicionando 1.403 g
de hidróxido de potasio a un matraz aforado de 50 mL y adicionando el etanol
necesario hasta alcanzar la marca del matraz.
Por otro lado, prepara 50 mL de una solución de HCl idealmente a 0.5 M
adicionando 2 mL de una solución concentrada de ácido clorhídrico a un matraz
aforado de 50 mL y adicionando el agua destilada hervida necesaria hasta
alcanzar el aforo del matraz.
Valora cada una de las soluciones de trabajo, la de KOH con la del estándar de
KHP y la de HCl con la de Na2CO3. Considera que deberían adicionarse 20 mL de
las soluciones de HCl y NaOH si la molaridad de ambas fuese, efectivamente, de
0.5 M.
Ya con la pureza de KOH y HCl conocida, prepara 100 mL de una solución
etanólica de KOH y 100 mL de una solución 0.5 M de HCl.
Pesa 1 g de un aceite en un vaso de precipitados y disuélvela en 3 mL de una
mezcla 1.1 de etanol-éter. Transfiere íntegramente el contenido de esta solución a
un matraz bola de 100 mL con junta esmerilada, adiciona 25 mL de la solución
estándar de KOH 0.5 M y calienta a reflujo la mezcla durante 30 minutos. En otro
matraz coloca un sistema similar sin el aceite y calienta a reflujo también durante
este tiempo (matarz del blanco). Permite que ambos sistemas se enfríen, adiciona
unas gotas de fenolftaleína a cada matraz y titula con una solución estándar de 0.5
M de HCl. La diferencia de mL de HCl adicionados entre el blanco y el matraz de
la reacción coincide con el número de mililitros de KOH 0.5 M requeridos para
saponificar 1 g del aceite.
El valor de saponificación (S) es el número de miligramos de KOH requeridos
para neutralizar los ácidos grasos resultantes de la hidrólisis completa de una
grasa, un indicativo de la naturaleza de los ácidos grasos en la grasa puesto que a
mayor longitud de la cadena una menor cantidad de ácido es liberado por gramo
de grasa hidrolizada. Dado esto, calcula el peso molecular promedio de la grasa
mediante la siguiente fórmula simplificada:
Peso molecular promedio = 3 x 56.11 x 1000/S.

27

• Representa la reacción de saponificación de un triacilglicérido.
• ¿Qué representa el 3 de la ecuación simplificada con la que se calcula el
peso molecular promedio? ¿Y el 56.11?
• ¿Por qué debe emplearse agua hervida?
• ¿Por qué es necesario estandarizar al KOH y al HCl?
• ¿Cuáles son las reacciones que tienen lugar entre el KHP y la KOH? ¿Y
entre el HCl y el Na2CO3?

28

Practica No. 9
Aislamiento de colesterol de tejido cerebral.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Conocer uno de los métodos de identificación clásicos de los α-aminoácidos y
aplicarlo en una muestra personal.

Adiciona 50 mL de acetona a 15 g de tejido cerebral y machaca durante 10
minutos en un mortero. Filtra la suspensión en un embudo Büchner al vacío
adicionando 50 mL más sobre el tejido cerebral para lavar. Remueve por
destilación al vacío la acetona, enfría el matraz y separa el colesterol crudo en un
embudo Büchner. Recristaliza el colesterol de etanol y determina punto de fusión y
rendimiento. Adicionalmente, caracteriza al colesterol mediante el ensayo de
Lieberman–Burchard: disuelve unos cuantos cristales de colesterol en cloroformo
seco en un tubo de ensayo igualmente seco. Adiciona unas gotas de anhídrido
acético, dos gotas de ácido sulfúrico y mezcla cuidadosamente. Si en la solución
hay colesterol presente, entonces se generará primero una coloraci+on rosada y,
posteriormente, una de color verde intenso.
• ¿Cuál es la importancia del colesterol dentro del organismo humano?
• ¿En qué otros tejidos, además del cerebral, se presenta abundantemente el
colesterol?
• ¿Cómo se lleva a cabo la purificación de un sólido mediante
recristalización?
• ¿En qué consiste la prueba de Lieberman–Burchard?
• ¿Cuál es la manera correcta de determinar un punto de fusión en un
aparato de Fisher-Johns?
• ¿Qué debe hacerse con los tejidos residuales?

29

Practica No. 10
Índice de yodo de un aceite.
Química
En vigor: 2016
Escrita por:
Revisada y Aprobada
Hernández
2013
Conocer el el índice de yodo de un aceite, el cual en términos de la norma
mexicana NMX-F-152-SCFI-2011 se define como la medida de la insaturación de
las grasas y aceites expresada en términos del número de centigramos de yodo
absorbido por gramo de muestra (% de Yodo absorbido).

Solución de yodo de Wijs.
Cloroformo
Solución de yoduro de potasio (KI) al
15 %
Solución de tiosulfato de sodio
(Na2S2O3) 0.1 M
Solución de almidón al 1% (100 mg en
10 mL de agua)
En un vaso de precipitados de 2 L hierve 1 L de agua durante 20 minutos. Luego
de ello, vierte en botellas con tapa de rosca metálica y séllalas con cera de una
vela.
Coloca 4 gotas de un aceite en un vaso de precipitados de 10 mL. Una vez
que hayas obtenido el dato de su peso en gramos, transfiérelo a un matraz de
índice de yodo de 500 mL haciendo uso de 10 mL de diclorometano. Añade con
una pipeta volumétrica 10 mL del reactivo de Wijs y deja reposar exactamente 30

30

minutos en la oscuridad, agitando ocasionalmente. Prepara simultáneamente en
otro matraz de índice de yodo un blanco en el que el aceite no se halle presente.
Al finalizar el tiempo, añade a ambos matraces 5 mL de la solución de KI al
15% (15 g de KI y aforo a 100 mL), agita vigorosamente y añade 100 mL del agua
destilada hervida, lavando cualquier cantidad de yodo libre de la tapa. Titula el
yodo de ambos matraces con la solución de tiosulfato de sodio 0,1 M añadiéndolo
gradualmente, con agitación constante, hasta que el color amarillo de la solución
casi desaparezca. Añade entonces 1 mL del indicador y continúa la titulación,
hasta que el color azul desaparezca completamente. Hacia el fin de la titulación,
tapa el matraz y agita vigorosamente, de manera que todo el yodo remanente en
la capa de cloroformo pase a la capa de yoduro de potasio. La reacción de
titulación es:
Calcula el índice de yodo mediante la siguiente ecuación:
Índice de yodo =
!!! × ! × !".!"
!"#$ !" !" !"#$%&', !" !
Donde
B = mL de la solución de tiosulfato adicionados al matraz del blanco,
S = mL de la solución de tiosulfato adicionados al matraz de la muestra,
M = molaridad de la solución de tiosulfato

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